有效控制豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)的基于合成肽的標記疫苗和診斷系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本文公開了針對豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的基于肽的標記疫苗以及用于預防、監(jiān)測和控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的一組免疫診斷測試。本發(fā)明不同實施方案所述的疫苗制劑包含來源于PRRSV?GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的肽的混合物；每種肽獨立地包含B細胞PRRSV中和/受體結合表位，該表位獨立地連接人工T輔助細胞表位以增強相應肽的免疫原性；并且其可以補充有代表來源于PRRSV?GP4、GP5、M和核殼蛋白的T輔助細胞表位的肽的混合物，以提供細胞介導的免疫性。在可接受的遞送系統(tǒng)中制備此類病毒肽組合物作為疫苗制劑，并且可以在PRRSV攻擊時對不含PRRSV抗體的豬提供對感染的交叉保護。
【專利說明】有效控制豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的基于合成肽的標
記疫苗和診斷系統(tǒng)
發(fā)明領域
[0001] 本公開內(nèi)容涉及針對豬繁殖與呼吸綜合征(Reproductive and RespiratorySyndrome, PRRS)的基于肽的標記疫苗以及用于監(jiān)測和控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的一組免疫診斷測試。_2]發(fā)明背景
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)于二十世紀八十年代晚期發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其是大母豬(sow)和小母豬(gilt)中嚴重的生殖不能(severe reproductive failure)的原因，并且是養(yǎng)豬工業(yè)中最重要的病原體之一。大母豬和小母豬感染可能導致晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)小豬和產(chǎn)下先天虛弱(weak-born)的小豬，而感染的公豬則表現(xiàn)出精子質量降低和精液中的病毒分泌。
[0004]另外，還發(fā)現(xiàn)PRRSV參與幼豬中的豬呼吸疾病綜合癥狀，與繼發(fā)性病毒和細菌感染聯(lián)合引起呼吸問題。該病毒表現(xiàn)出受限的體內(nèi)細胞向性，其中肺泡巨噬細胞是主要的靶細胞。
[0005]PRRSV是動脈病毒科(Arteriviridae)和巢狀病毒目(Nidovirales)的有包膜的正單鏈RNA病毒(I)，長度約為15kb，由9個開放閱讀框(ORFs)組成。病毒體由核殼核心組成，所述核殼核心由與病毒RNA締合的核殼蛋白(由開放閱讀框7，0RF7)構成。核殼由脂質包膜包繞，在所述脂質 包膜中包埋六種結構蛋白:糖蛋白GP2(0RF2a)、GP3 (0RF3)、GP4 (0RF4)和GP5 (0RF5)，以及非糖基化蛋白M(0RF6)和E (0RF2b)。GP5和M被認為是包膜中最豐富的蛋白，而其余包膜蛋白以較低的量存在。位于基因組5’末端的ORFla和ORFlb編碼非結構蛋白。
[0006]與多種其他的RNA病毒相似，PRRSV表現(xiàn)出高基因變異性，這反映在毒力、與免疫系統(tǒng)的相互作用和病毒蛋白的抗原特性的變化。盡管在各基因型中存在高變異性程度，但是通?；?RF5和/或0RF7序列將病毒毒株分類為歐洲(EU)和北美(NA)基因型。
[0007]PRRSV已經(jīng)獲得了多種允許逃避宿主的保護性免疫性的特性。這些特性為在感染一周或兩周后病毒特異性抗體的晚產(chǎn)生；此類抗體在體外不能減少原代豬肺泡巨噬細胞(PAM)中的病毒復制；非常需要的病毒中和抗體在感染后約三周到四周才以低水平出現(xiàn)，因此出現(xiàn)得太晚而不能影響病毒血癥的急性期(1，2)。
[0008]盡管這種病毒中和抗體應答是弱的，但是，在感染發(fā)生時存在充分量的此類病毒中和抗體能夠提供針對病毒在肺中復制、病毒血癥和該病毒的經(jīng)胎盤傳播的保護，這表明PRRSV-特異性的中和抗體能夠部分有助于保護性免疫性(2，3)。
[0009]在被感染的、具有中和抗體的豬的血液中發(fā)現(xiàn)PRRS病毒血癥，這表明單獨的體液免疫應答沒有提供可靠的保護(solid protection)。已表明細胞介導的免疫性(CMI)在清除PRRSV方面起重要作用(4)。發(fā)現(xiàn)在感染的豬中的CMI應答的發(fā)生(通過淋巴細胞胚細胞樣轉變和適應性細胞因子產(chǎn)生(例如，干擾素Y ; IFN-Y)確定)是延遲的，并且在感染后約4-8周在外周血單核細胞(PBMCs)的體外回憶應答中可檢測到，其與中和抗體的產(chǎn)生相關(5-7)。IFN-y在針對動物中的多種細胞病變病毒感染的細胞介導的免疫應答中起關鍵作用。在感染PRRSV的豬中，在淋巴結、肺和外周血單核細胞中檢測到IFN-y mRNA(7)。
[0010]在過去的二十年以來，在整個PRRSV結構蛋白質組尋找代表誘發(fā)中和抗體的B細胞表位和誘發(fā)IFN- Y的T細胞表位的病毒抗原區(qū)已經(jīng)成為獸醫(yī)病毒免疫學中最有挑戰(zhàn)性的課題之一。顯示全球PRRSV研究團體的積累的努力產(chǎn)生的此類表位繪圖結果的代表性的論文提供在本文中作為參考文獻(8-10)。
[0011]盡管修飾的活疫苗(MLV)以及殺死的PRRSV病毒裂解物疫苗是可商購的，但是，對于PRRSV相關疾病的控制仍然是有問題的。由于PRRSV疫苗有效針對同源攻擊而非異源攻擊，所以一個主要的問題是功效。另外，在本領域中已經(jīng)報道了關于MLV的安全性問題。修飾的活疫苗不適合用于懷孕的大母豬、小母豬，并且由于接種可能導致精液中疫苗病毒的泄出，因此也不適合用于公豬。修飾的活病毒疫苗可能在接種的動物中持久存在。已經(jīng)報道了對未接種的動物的傳播和因此產(chǎn)生的疫苗病毒誘導的疾病。此外，急需開發(fā)允許區(qū)分感染的豬和接種的豬的標記疫苗，由此促進對PRRSV感染的追蹤和控制。
[0012]總之，急需設計包含不同功能性B和T細胞表位的免疫原性PRRSV肽，所述肽能夠誘導保護性抗體和細胞免疫應答，以及設計引入這些設計肽的疫苗制劑，以允許在豬中對PRRSV毒株的交叉保護。隨著這些合理設計的且分子表征的免疫原性肽的可獲得性，還需要鑒定能夠被來自感染的豬的抗體識別的抗原肽，并且使用這些設計肽來開發(fā)用于血清學鑒定感染的動物與接種的動物的一組診斷測試，由此的診斷系統(tǒng)，以允許有效地控制PRRSV感染。最后，需要開發(fā)用于此類基于肽的標記疫苗和診斷系統(tǒng)的低成本制備和質量控制的方式，以廣泛用來有效地監(jiān) 測和控制PRRS疾病。
[0013]參考文獻:
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[0039]本公開內(nèi)容涉及針對豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的基于肽的標記疫苗以及用于預防、監(jiān)測和控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的一組免疫診斷測試。
[0040]盡管存在關于結構性PRRSV蛋白質組的抗原區(qū)的可用的科學信息，但是，由于研究團體在數(shù)十年的努力后未能開發(fā)出任何成功的針對傳染劑的基于肽的疫苗，因此有一些人持有這樣的觀點，即，對于大部分病原體將不可能產(chǎn)生和合成的肽疫苗。本發(fā)明人已經(jīng)從第一代生物疫苗中學到很多，其中引入選擇性PRRSV B和T細胞表位的合理設計途徑應該允許驗證和開發(fā)針對需要的病毒毒株的基于合成肽的PRRSV疫苗以及用于監(jiān)測和控制所述疾病的成套的診斷測試。重要的是，認識到B細胞中和表位主要是構象性的，并且必須在設計那些B細胞表位相關的肽免疫原時進行考慮。相關的B抗原表位的鑒定和設計需要理解被靶向的分子的結構與其功能之間的關系。理解進行免疫原設計的靶分子的結構和功能的這樣的學科被本發(fā)明人稱為“功能抗原學(functional antigenics) ”。另外,免疫應答是復雜的且是多面性的。針對作為準種(quas1-species)群體存在的快速進化的RNA病毒的疫苗應該保持目的在于刺激盡可能多的不同的保護性免疫機制，從而使出現(xiàn)逃避宿主免疫系統(tǒng)的病毒變體的危險減至最少。[0041]成功的基于合成肽的疫苗將包含刺激免疫系統(tǒng)(包括適應性免疫性和先天性免疫性)的適當元素的成分。開發(fā)基于表位的肽疫苗的另一個主要的障礙部分是由于代表這些表位的長度較短的肽的非免疫原性性質。另外，需要引入B和T表位的大量組庫(repertoire)，以允許疫苗針對由于病原體的遺傳變異以及宿主的遺傳可變性導致的寬泛的交叉保護的通用性。通過對針對多種疾病的基于合成的肽的疫苗和診斷測試的廣泛嘗試和實驗驗證，本發(fā)明人已經(jīng)集中于模擬天然靶分子上的抗原位點的肽免疫原的合理設計，以誘導用于體外和體內(nèi)血清學和功能研究的抗體，該肽免疫原補充有適當?shù)腡細胞表位，以增強所需要的免疫原性。這已經(jīng)在每種靶標疾病中產(chǎn)生了用于臨床和商業(yè)應用的優(yōu)化的抗原、免疫原和疫苗制劑(11-20)。
[0042]本發(fā)明的各個實施方案所述的疫苗制劑包含來源于PRRSV GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的肽的混合物；每種肽獨立地包含B細胞PRRSV中和/受體結合表位，該表位獨立地連接人工T輔助細胞表位以增強各個肽的免疫原性；并且其可以補充有代表來源于PRRSVGP4、GP5、M和核殼蛋白的T輔助細胞表位的肽的混合物，以提供細胞介導的免疫性。在可接受的遞送系統(tǒng)中制備此類病毒肽組合物作為疫苗制劑，并且可以對不含PRRSV抗體的豬在PRRSV攻擊時提供對感染的交叉保護。
[0043]本發(fā)明的各個實施方案所述的診斷系統(tǒng)包含一組診斷測試，其中一種測試以ELISA免疫測定形式針對兩種重疊的PRRSV 0RF7-編碼的抗原肽提供，以提供對PRRSV-感染的動物的優(yōu)化的抗體識別，其余測試以ELISA免疫測定形式針對GP2、GP3、GP4和GP5來源的疫苗靶標肽提供，以提供對PRRSV肽疫苗免疫的動物的優(yōu)化的抗體識別。組合來看，這些診斷測試組成用于區(qū)分感染的動物和接種的動物(Differentiation of Infected fromVaccinated Animals, DIVA)的診斷系統(tǒng)，因此有效地監(jiān)測和控制所述疾病。
[0044]還涉及制備用于保護豬免于PRRSV感染的所述疫苗的方法，以及制備一組DIVA免疫診斷測試的方法，由此允許有效地控制所述疾病。
[0045]通過在靶標物種中的大量的血清學驗證過程來設計并優(yōu)化本發(fā)明的肽或肽組合物，以開發(fā)標記疫苗，所述標記疫苗與天然病毒交叉反應，對不含PRRSV抗體的小豬在PRRSV攻擊時對感染交叉保護，并且開發(fā)一組基于肽的ELISAs，以區(qū)分感染的動物與接種的動物。
[0046]本公開內(nèi)容涉及PRRSV疫苗，其具體包含來源于PRRSV GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的B表位的肽和肽組合物，其中每種肽任選地連接T輔助細胞表位，以增強肽的免疫原性，從而在免疫的宿主中誘導體液免疫性，包括與PRRSV交叉反應的高滴度抗體。
[0047]在疫苗制劑中，所述肽或肽組合物進一步補充有代表PRRSV GP4、GP5、M和核殼蛋白的T細胞表位的另外的肽，以發(fā)起細胞介導的免疫應答。
[0048]提供本發(fā)明的多個實施方案。一組實施方案涉及有效作為抗原的一種或多種肽和一種或多種肽組合物，以檢測來自感染的動物的針對核殼(NC)蛋白的抗體。第二組實施方案涉及有效用于檢測針對來自接種的動物的標記疫苗靶向的GP2、GP3、GP4和GP5表位的抗體的肽和肽組合物。
[0049]還有另一組實施方案是涉及來源于PRRSV蛋白的B和T細胞表位二者的肽、其同源物和類似物。所述PRRSV優(yōu)先、但是任選地連接人造組合的T輔助細胞表位，以增強其各自的免疫原性。
[0050]另外，另一組實施方案是涉及疫苗組合物，其包含來自PRRSV B和T細胞表位衍生的肽免疫原的肽和肽組合物，以誘導與天然PRRSV蛋白交叉反應的抗體應答和細胞介導的免疫應答二者，二者一起保護豬免受PRRSV感染。
[0051]每種這樣設計的肽可以以毫克至千克規(guī)格化學合成用于工業(yè)應用，并且能夠進行質量控制。 [0052]本發(fā)明的各個實施方案還提供遞送載體(delivery vehicles)和常規(guī)與疫苗制劑結合的其他成分。
[0053]附圖簡沭
[0054]圖1A.顯示按照本發(fā)明的一個實施方案通過免疫熒光檢測在共轉染的HTK細胞系細胞的細胞質中的針對PRRSV GP5蛋白的抗體的機制的圖示。
[0055]圖1B.按照圖1A所述的機制進行的免疫熒光測定(IFA)。檢測具有與細胞質中的GP5結合的針對PRRSV GP5的抗體的共轉染的HTK細胞系細胞。
[0056]圖2A.在PRRSV MD001毒株(登記號AF121131)的核殼(NC)蛋白上的抗原位點的位置和鑒定抗原肽(SEQ ID NO:1)用于檢測感染的動物中針對NC蛋白的抗體的UBI PRRSVNC ELISA。
[0057]圖2B.在PRRSV MD001毒株(登記號AF121131)的核殼(NC)蛋白上的抗原位點的位置和鑒定抗原肽(SEQ ID NO:2)用于檢測感染的動物中針對NC蛋白的抗體的UBI PRRSVNC ELISA。
[0058]圖 3.來自 PRRSV 毒株 MD001 (SEQ ID No:3) ,JXAl (SEQ ID No:4)、NA (SEQ ID No:5) EU (SEQ ID N0.6)的同源核殼蛋白序列的比對。
[0059]圖4.PRRSVJXAI毒株(登記號AY2G2352)的PRRSV ORF 2至ORF 7蛋白上適于標記疫苗設計的選擇的B和T細胞表位的位置。
[0060]圖5.用UBI PRRSV NC NA ELISA檢測的來自不同來源的豬血清的血清反應性。
[0061]圖6A.在通過UBI ’ s診斷系統(tǒng)(即，檢測PRRSV感染的豬的測試和檢測接受包含來源于GP2、3和4蛋白的設計的肽免疫原的疫苗制劑的動物的測試)檢測和區(qū)分的PRRSV感染的豬中，UBI PRRSV標記疫苗制劑誘導針對目標肽免疫原的特異性的高滴度抗體。
[0062]圖6B.在通過UBI ’ s診斷系統(tǒng)(即，檢測PRRSV感染的豬的測試和檢測接受包含來源于GP3、4和5蛋白的設計的肽免疫原的疫苗制劑的動物的測試)檢測和區(qū)分的PRRSV感染的豬中，UBI PRRSV標記疫苗制劑誘導針對目標肽免疫原的特異性的高滴度抗體。
[0063]圖7A.顯示PRRS病毒攻擊后的組織病理學損傷的照片。具有間質性肺炎(interstitial pneumonia)的對照組動物在肺中出現(xiàn)淋巴細胞對肺泡壁的增厚。
[0064]圖7B.顯示PRRS病毒攻擊后的組織病理學損傷的照片。動物通過UBI PRRS GP5肽疫苗制劑免疫。肺保持正常的肺泡壁。
[0065]發(fā)明詳沭
[0066]肽抗原可以檢測免疫學反應，并且一些肽抗原還可以刺激免疫學反應。多種肽抗原可以用于免疫應答的靈敏性和特異性檢測，但是最通常的是其本身不作用為免疫原。肽免疫原是一類特殊的肽抗原，其可以用于刺激免疫應答以及檢測它們。按照本發(fā)明的一個實施方案，PRRSV疫苗中的肽抗原是具有B細胞(B)和T輔助細胞(Th)表位二者的肽免疫原，所述B細胞(B)和T輔助細胞(Th)表位一起作用刺激產(chǎn)生保護性免疫應答，并且還存在能夠檢測針對PRRSV感染的免疫應答的不同組的肽抗原。
[0067]一種鑒定B細胞表位的方法依賴于一組多種長度的嵌套的且重疊的肽，其長度典型地在20至60個殘基或更長的范圍。這些較長的肽通過一系列費力的獨立的固相肽合成來合成。然后，所得到的多組嵌套的且重疊的肽可以用于抗體結合研究以鑒定最好呈遞免疫顯性決定簇(包括不連續(xù)的構象B細胞表位)的肽。本發(fā)明的一個實施方案提供兩種重疊的PRRSV 0RF7-編碼的核殼肽，其中，一種包含70個氨基酸的序列(SEQ ID No:l，也顯示在圖2A中)，另一種包含73個氨基酸的序列(SEQ ID No:2，也顯示在圖2B中)，每種本身具有B細胞表位簇，以進行優(yōu)化的抗體識別。使用來自PRRSV-感染的小豬的血清樣品和ELISA免疫測定形式，憑經(jīng)驗鑒定并優(yōu)化這些抗原肽?？梢赃m合包含肽抗原的抗體捕獲相的任何免疫測定形式，例如，ELISA，都可以用來檢測和量化與來自PRRSV-感染的豬的血液、血清或血漿樣品中的PRRSV核殼蛋白的特定片段結合的抗體。
[0068]在一個具體的實施方案中，鑒定了約70個氨基酸的優(yōu)化的PRRSV抗原肽(SEQ IDNo:1)(其對應于全長PRRSV核殼蛋白的氨基酸殘基2-71)和約73個氨基酸的另一種優(yōu)化的PRRSV抗原肽(SEQ ID No:2)(其對應于全長PRRSV核殼蛋白的氨基酸殘基51-123)。這兩種肽在混合物中等比例組合，以組成用于在感染的豬中通過ELISA檢測針對PRRSV的抗體的最優(yōu)化的抗體捕獲相。這兩種高度抗原性的肽均被發(fā)現(xiàn)具有免疫顯性的B細胞表位簇，并且具有針對PR RSV陽性血清組的最顯著和一致的抗原性。包含PRRSV核殼肽(例如，SEQ ID No:1與No:2)的診斷檢測試劑盒的制備和應用在本發(fā)明的各個示例性的實施方案的范圍內(nèi)。
[0069]PRRSV抗原肽發(fā)明的具體實施方案進一步限定為SEQ ID Nos:1和2的免疫學功能同源物，其具有來自PRRSV的突變體和變異毒株的對應序列和構象元件。同源PRRSV抗原肽具有與起源變異PRRSV北美毒株的核殼蛋白位置2-71和51-123大致相關的氨基酸殘基。此類同源物容易通過序列比對程序如ClustalW(由德國歐洲分子生物學實驗室(European Molecular Biology Laboratory,Germany)的Julie D.Thompson,Toby Gibson和英國劍橋的歐洲分子生物學研究所(European Bioinformatics Institute,Cambridge,UK.)的Desmond Higgins制作，算法)進行驗證。圖3顯示通過ClustalW對取自不同PRRSV毒株的四種抗原序列的比對=MDOOl臺灣/99Y/AF121131 (SEQ ID No:3)，JXAl北京/06Y/EF112445(SEQ ID No:4)， NA/NJ_a/04Y/AY37282， (SEQ ID No:5), EU/Lena/08Y/EU909691 (SEQ ID No:6)。圖3中比對的核殼蛋白同源物的起源PRRSV毒株包括歐洲毒株的各種病毒。表 I 還示例了 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 (北美毒株/MD001/TW/AAC98536)的抗原肽的同源物(SEQ ID No:7和SEQ ID No:8)，其中EU是起源PRRSV毒株(歐洲毒株/08V204/比利時/EU/⑶737266)。在一個實施方案中，SEQ ID No:1的同源物(SEQ IDNo:7)具有EU毒株的PRRSV NC蛋白的大約氨基酸位置2至大約氨基酸位置72的氨基酸序列。在另一個實施方案中，同源物(SEQ ID No:8)具有EU毒株的PRRSV NC蛋白的大約氨基酸位置52至大約氨基酸位置128的氨基酸序列。這兩種同源肽可以類似地以相等比例組合在混合物中，以組成最優(yōu)化的抗體捕獲相，從而用于在感染的豬中通過ELISA檢測針對PRRSV (優(yōu)選是歐洲毒株)的抗體。
[0070]本發(fā)明的同源物進一步定義為與SEQ ID No:1和SEQ ID No:2具有至少50%的同一性。在一個實施方案中，變異毒株同源物(SEQ ID NO:7)與SEQ ID No:1具有約50%的同一性。在另一個實施方案中，變異毒株同源物(SEQ ID NO:8)與SEQ ID No:2具有約64%的同一1f生。
[0071]除了從PRRSV NC蛋白鑒定的用于檢測來自感染的動物的血清樣品的抗體的抗原肽之外，在PRRSV GP2、GP3、GP4和GP5蛋白上存在于中和和/或受體結合功能位點相對應的抗原區(qū)。圍繞這些表位區(qū)設計多種肽免疫原，用于通過基于目標肽的ELISAs來評估其各自的免疫原性，并且更重要的是，按照本發(fā)明的一個實施方案，用于通過免疫熒光測定(IFA)來評估誘導的抗體與天然PRRSV蛋白的交叉反應性。另外，在PRRSVGP4、GP5、M和NC蛋白上存在大量文獻記錄的免疫顯性T細胞表位。來自這些T輔助位點的肽將在豬中引發(fā)淋巴細胞增生應答，這導致細胞因子(包括IFN-Y)產(chǎn)生，其在動物中的針對多種細胞病變病毒感染的細胞介導的免疫應答中起重要作用。
[0072]圖4所示的實施方案示例基于PRRSVJXA1的序列(登記號AY2G2352)本發(fā)明在PRRSV ORF 2-0RF 7編碼的(GP2，GP3，GP4，GP5，M和N)蛋白上選擇的B和T細胞表位的分布和位置。
[0073]本發(fā)明的另一個實施方案提供四種優(yōu)化的和選擇的PRRSV B細胞表位簇肽的序列，即 GP5.3(V21-E65) (SEQ ID No:9)，GP2B (V111-L136) (SEQ ID No:10)，GP3B (C57-C75)(SEQ ID No:11)和GP4B (C52-C69) (SEQ ID No:12)。這些B細胞表位簇位于具有中和和受體結合特征的位點周圍。
[0074]本發(fā)明的其他實施方案提供這四種PRRSV B細胞表位簇肽的免疫學功能類似物。表3顯示具有MD001、JXA1、NA和EU的起源毒株的同源性GP5 (SEQ ID Nos: 13-15)，GP2 (SEQID Nos:17-19)、GP3 (SEQ ID Nos:21-23)和 GP4(SEQ ID Nos:25-27)來源的 B 表位簇肽序列的比對。還顯示了每種B細胞表位簇肽(SEQ ID NOs =16,20,24,28)的共有序列，其中分
配給變異位置的氨基酸是最常用于這些位置的那些氨基酸。
[0075]B細胞表位簇肽的免疫學功能類似物包括SEQ ID Nos:9，10，11，12的變體以及基本保留與起源抗原肽相同的免疫學特性的同源物。例如，作為SEQ ID No:9的功能類似物或同源物的變體可以在氨基酸位置具有保守置換；整體電荷的變化；共價連接另一結構部分；或小的添加、插入、缺失或保守置換和/或它們的任意組合。因此，與PRRSV GP5.3B表位(V21-E65)抗原肽(例如SEQ ID No:9)結合的抗體也將以基本上相似的功效結合PRRSVGP5.3B表位抗原肽的免疫學功能類似物。在一個實施方案中，所述功能類似物與SEQ IDNo:9或同源具有至少40%的同一性。在另一個實施方案中，所述功能類似物與SEQ ID No:11或同源物具有至少56%的同一性。在另一個實施方案中，所述功能類似物與SEQ ID No:12或同源物具有至少72%的同源性。在另一個實施方案中，所述功能類似物與SEQ ID No:10或同源物具有至少80%的同源性。在另一個實施方案中，所述功能類似物與SEQ ID No:12或同源物具有至少94%的同源性。
[0076]在一個實施方案中，如表3中所示，PRRSV GP 5.3 B表位簇肽(V21-E65)的免疫學功能類似物包括已經(jīng)通過保守置換和通過插入或缺失進行修飾的PRRSV GP5.3B表位簇肽的形式。在該實施方案中，免疫學功能類似物可以通過保守置換由SEQ ID No:9或由SEQID No:9的同源物進行修飾。
[0077]保守置換是這樣的情形:一個氨基酸殘基被另一個具有相似化學特性的氨基酸殘基置換。例如，非極性(疏水的)氨基酸殘基包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性的)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及帶負電荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0078]在另一個實施方案中，如在表3和4中所示，免疫學功能類似物可以通過在N端、C端的氨基酸添加和/或通過對肽中間的插入而進行修飾。在本發(fā)明的各個實施方案中，添加是在肽的N端或C端。添加可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11個氨基酸殘基(SEQID Nos:9和30)。所述添加可以組成在PRRSV蛋白中不存在的且不改變PRRSV B表位簇肽的免疫原性的氨基酸序列。在PRRSV B表位簇肽中不存在的添加包括，但不限于，小的帶電荷序列(例如，賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸)，能夠形成分支結構的氨基酸(例如，ε N-賴氨酸)或能夠形成環(huán)狀結構的氨基酸(例如，半胱氨酸)。在本發(fā)明的一個實施方案中，添加在PRRSV中不存在的氨基酸序列是5個氨基酸或更少的氨基酸。氨基酸添加可以是經(jīng)典的或非經(jīng)典的氨基酸或其混合物。
[0079]在另一個具體的實施方案中，免疫學功能類似物可以通過對肽的N端、C端和/或中間的氨基酸缺失而進行修飾。在多個實施方案中，缺失是在肽的N端或C端。缺失可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11個氨基酸殘基。在表4所示的一個具體的實施方案中，氨基酸序列的缺失是9個氨基酸或更少的氨基酸(SEQ ID Nos:33和34)。
[0080]在另一個實施方案中，如表7所示，PRRSV B表位簇肽的免疫學功能類似物包括已經(jīng)通過改變電荷進行修飾的PRRSV B表位簇抗原肽。此類電荷改變可以是氨基酸置換、添加或缺失的結果，或是共價連接帶電荷分子的結果。電荷改變可以具有這樣的結果:與未修飾的肽相比較，使得肽堿性更高、酸性更高或更加中性。在一個具體的實施方案中，通過在N端或C端添加1-5個賴氨酸殘基而使得肽堿性更高。在更具體的實施方案中，通過在N端添加3個賴氨酸殘基而使得肽堿性更高。
[0081]通過非限制性實例舉例，本發(fā)明的肽的免疫學功能類似物可以具有添加到末端氨基酸的I至約5個另外的氨基酸(經(jīng)典的或非經(jīng)典的)。例如，序列Lys-Lys-Lys可以添加到該PRRSV B細胞表位簇肽的氨基端以改變電荷。
[0082]肽可以使用標準技術，如Merrifield固相合成方法和對該程序的多種可用的改進而容易地合成。還可以使用重組DNA技術制備肽。因此，本發(fā)明的多個示例性的實施方案包括編碼PRRSV B細胞表位簇抗原肽和PRRSV B細胞表位簇抗原肽的免疫學功能類似物的核酸分子及其互補物。本發(fā)明的多個示例性的實施方案也包括載體，特別是表達載體，所述載體包含編碼PRRSV B細胞表位簇抗原肽和免疫學功能類似物的核酸分子。本發(fā)明的多個示例性的實施方案還 包括包含所述載體的宿主細胞。
[0083]本發(fā)明的多個示例性的實施方案還包括制備PRRSV抗原肽和PRRSV抗原肽的免疫學功能類似物的方法。例如，所述方法可以包括在使得PRRSV肽和/或PRRSV肽的免疫學功能類似物表達的條件下培育包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼PRRSV抗原肽和/或PRRSV抗原肽的免疫學功能類似物的核酸分子。[0084]本發(fā)明的一個實施方案提供通過固相合成制備的肽組合物。該實施方案可以使用來源于感染的細胞的裂解物或分泌物的受控目充分限定的免疫原。通過該實施方案的化學方法制備的抗原的質量得到控制和限定，并且結果可以確?？乖浴⒚庖咴院彤a(chǎn)率的再現(xiàn)性。此外，在制備肽抗原時不使用生物危險性物質，這降低了風險并消除了對昂貴的生物學防范的需求。由于位點特異性免疫原存在高摩爾濃度的所選表位，確保使用PRRSV抗原肽組合物的疫苗的安全性和致免疫力。
[0085]在一個實施方案中，本發(fā)明的肽是合成的。使用限定的PRRSV抗原合成肽使在小豬中用作抗原進行抗體檢測和診斷時的假陽性結果最少。使用具有已知的B細胞和Th表位的限定的合成肽作為免疫原消除了在用作疫苗的免疫原成分時由于存在抗原物質引起的不需要的非-PRRSV-特異性的免疫應答，所述抗原物質來源于PRRSV-感染的宿主細胞或重組病毒感染的宿主細胞和來自可以與PRRS病毒共同純化的重組蛋白表達系統(tǒng)和/或重組蛋白。例如，來自豬的血清具有針對宿主細胞的抗體，或針對重組大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母或桿狀病毒(baculovirus)的抗體,然后其與基于生物來源的抗原的診斷測試中所用的抗原物質交叉反應，并且由具有這些外來免疫原作為成分的疫苗產(chǎn)生的這樣的免疫應答是非保護性的。相比之下，接受本發(fā)明的PRRSV肽疫苗的豬將產(chǎn)生專一的免疫應答，避免針對來源于宿主細胞或表達載體的蛋白(例如，來自重組人腸桿菌、酵母或桿狀病毒的已與生物來源的PRRSV抗原共同純化的蛋白)的不需要的抗體和其他免疫應答。 [0086]該合成肽的實施方案還使在制備過程中產(chǎn)生的雜質的干擾減至最少。利用長的合成，盡管嚴格控制偶聯(lián)效率，但是，由于延伸循環(huán)過程中的事件，包括氨基酸插入、缺失、置換和提前終止，也產(chǎn)生肽類似物，由此導致隨著目標肽合成一起產(chǎn)生多種肽類似物。然而，當在免疫學應用中用作免疫診斷目的的固相抗原或用作接種目的的免疫原時，此類肽類似物在肽制劑中仍然適合作為抗原性和免疫原性的貢獻劑。
[0087]在25年的合成肽免疫學應用的經(jīng)驗中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與允許通過小分子藥物保留特定藥物活性或在與生物來源的藥物共同制備的大分子中存在的需要的活性和不需要的毒性的結構可變性范圍相比，允許保留目的免疫學活性的結構可變性的范圍適應性(accommodating)大得多。這就是為什么肽類似物(有意設計的或由于合成過程中的誤差不可避免產(chǎn)生的作為具有與目的肽相似的色譜和免疫學特性的缺失序列副產(chǎn)物的混合物)通常與所需要的肽的純化制劑一樣有效。設計的類似物和意圖之外的類似物混合物是有效的，只要開發(fā)出有判斷力的QC方法來監(jiān)測制備過程和產(chǎn)物評估過程，從而保證利用這些肽的最終廣品的再現(xiàn)性和功效。
[0088]在本發(fā)明的其他實施方案中，內(nèi)源性PRRSV Th肽及其同源物(SEQ ID N0.47-79)可以包含在疫苗組合物中。Th肽的存在可以提高PRRSV肽疫苗的免疫原性。PRRSV B表位來源的免疫原性肽(包括上述同源物和類似物)可以與內(nèi)源性PRRSV Th表位混合。
[0089]在本發(fā)明的其他實施方案中，內(nèi)源性PRRSV Th肽可以作為組合序列存在，其中，基于針對所述PRRSV Th肽的同源物的序列，氨基酸殘基的組合存在于構架內(nèi)的特定位置上。組合肽的組裝物可以通過一種合成方法合成，在所述合成方法中，通過在指定的位置添加指定的受保護的氨基酸的混合物而不是添加一種特定的氨基酸。所述組合PRRSV Th肽組裝物可以允許對多樣性遺傳背景的動物的寬泛的T輔助細胞表位覆蓋。代表性的PRRSV Th肽組合序列顯示在表7的SEQ ID Nos80-90中，對于每種PRRSV Th表位，其來源于表6的SEQ ID Nos47-79。
[0090]在一個實施方案中，具有來自ORF 4、0RF5、0RF6和0RF7的免疫顯性PRRSV Th表位簇的肽，其描述為基于JXAl序列的SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76 (也顯示在表6中)并且不與PRRSV B肽免疫原連接，可以用來補充PRRSV B表位肽免疫原的免疫原性，從而增強基于肽的PRRSV疫苗制劑的免疫原性，如實施例5所示。包括SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76作為游離肽，而不與B表位肽免疫原共價連接，可以提高疫苗制劑的免疫原性。在如實施例10所述的另一個實施方案中，組2包括SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76 作為游離肽，組 1、3 和 4 包括 SEQ ID N0s80_90 作為游離肽，而不與B表位肽免疫原共價連接，可以提高疫苗制劑的免疫原性。
[0091]在另一個實施方案中，PRRSV肽(包括上述同源物和類似物)可以通過或不通過間隔區(qū)與包含已知含有Th表位的序列的肽共價連接。該實施方案可以提供比不具有共價連接的Th表位的等價免疫原提高的免疫原性。在一個特定實施方案中，包含Th表位的肽被共價連接到PRRSV肽的N端(SEQ ID No:38)和/或C端(SEQ ID No:39)。在另一個特定的實施方案中，間隔區(qū)具有序列Lys-Lys-Lys- ε NLys (SEQ ID No:36),或單一氨基酸eNLys，也顯示在表5中(分別為SEQ ID Nos:43和42)。在一個實施方案中，包含Th表位的肽共價連接到PRRSV肽的氨基端。在一個特定實施方案中，表5所示的包含Th表位的肽(SEQ ID No:40)是通過Lys-Lys-Lys- ε NLys間隔區(qū)(SEQ ID No:36)連接到氨基端的人工組合的Th肽SEQ ID No:35 (如在表5中所示)，并且表示為SEQ ID No:40。
[0092]本發(fā)明的各個實施方案涉及用于保護豬抵抗PRRSV的疫苗組合物。在示例性的實施方案中，疫苗包含免疫原性肽抗原或肽免疫原組合物和可接受的遞送載體或佐劑。在不同實施方案中，PRRSV疫苗組合物包含肽抗原或肽免疫原組合物和獸醫(yī)學上可接受的遞送載體或佐劑，其中所述肽抗 原包含選自由下列組成的組的氨基酸序列:
[0093]a) PRRSV B 細胞表位簇肽抗原 GP5.3 (V21-E65) (SEQ ID No:9)、GP2B (V111-L136)(SEQ ID No:10)、GP3B(C57-C75) (SEQ ID No:11)和 GP4B (C52-C69) (SEQ ID No:12)中的任一種；
[0094]b) (a)的同源物；
[0095]c) (a)或(b)的抗原性和免疫學功能類似物，
[0096]d)具有至少一個保守氨基酸置換、氨基酸添加和/或氨基酸缺失的(a)，(b)或(C);和
[0097]e) (a)-(d)的任意組合。
[0098]在PRRSV疫苗的實施方案中，通過添加或缺失I至5個氨基酸而改變肽抗原的電荷。在PRRSV疫苗的另一個實施方案中，抗原性和免疫學功能同源物或類似物與來自來源于 GP2、GP3、GP4 和 GP5 的 PRRSV B 細胞表位簇肽抗原 GP5.3 (V21-E65) (SEQ ID No:9)、GP2B(V111-L136)(SEQ ID No: 10)、GP3B(C57-C75)(SEQ ID No:11)和 GP4 B (C52-C69)(SEQID No:12)中的任一種的氨基酸序列的抗原具有至少50%的同一性。在一個特別的實施方案中，肽抗原具有選自由SEQ ID Nos:9，10，11，12組成的組的氨基酸序列。
[0099]在PRRSV疫苗的另一個實施方案中，所述肽抗原還包含共價連接到所述肽抗原的N端或C端的T輔助細胞表位。在一個特定的實施方案中，T輔助細胞表位共價連接到所述肽抗原的氨基端。在另一個特定的實施方案中，T輔助細胞表位通過具有至少一個氨基酸的間隔區(qū)共價連接到肽抗原上。在一個特別的實施方案中，所述T輔助細胞表位為SEQ IDNo:35o在另一個特別的實施方案中，間隔區(qū)為Lys-Lys-Lys-ε NLys (SEQ ID NO:36)。在另一個特別的實施方案中，間隔區(qū)為eNLys。在一個特定的實施方案中，肽抗原為SEQ IDNo =42,43,44,45 或 46。
[0100]在各個示例性實施方案中，可以使用任意量的免疫原性肽抗原來在動物中引發(fā)免疫應答。在一個特別的實施方案中，肽抗原的量為約0.1 Ug至約lOOmg。在另一個特別的實施方案中，肽抗原的量為約1μ g至約lOmg。在另一實施方案中，肽抗原的量為約10 μ g至約Img。
[0101]在PRRSV疫苗組合物的不同實施方案中，所述組合物還包含SEQ ID Nos =47,51,52，55，59，61，63，67，70，74和76的十一種PRRSV T輔助細胞表位肽的等摩爾混合物。在一個特定的實施方案中，SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76的等摩爾混合物的量為約0.1μ g至約lmg。在一個更具體的實施方案中，SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76的等摩爾混合物的量為約I μ g至約100 μ g。
[0102]在各個示例性的實施方案中，可以使用任意類型或任意量的遞送載體或佐劑。在一個特定的實施方案中，遞送載體和佐劑是Montanide? ISA50V(一種由植物油及二縮甘露醇油酸酯(mannide oleate)構成的油性疫苗佐劑,用于制備油包水形式的乳液)、Tween,?80 (亦被稱為:聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或它們的任意組合。
[0103]在一個特定的實施方案中，PRRSV疫苗組合物包含SEQ ID No:33的肽抗原和獸醫(yī)學上可接受的遞送載體或佐劑，其中肽抗原的量為約10 μ g至約lmg。
[0104]本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于保護PRRSV母體來源的抗體(MDA)陽性或不是PRRSV母體來源的抗體(MDA)陽性的小豬抵抗PRRSV感染的方法，所述方法包括施用上述任意示例性實施方案所包括的疫苗。
[0105]按照本公開內(nèi)容制備的兩種具有SEQ ID Nos:1和2的PRRSV NC肽的混合物還可以用于通過在免疫測定的捕獲相中(例如，在ELISA檢測試劑盒的固相免疫吸附中)使用抗原有效量的肽來檢測PRRSV抗體。按照本發(fā)明的實施方案，任何相容的免疫測定形式都可以與所述肽一起使用。所述形式是普通技術人員公知的，并且已經(jīng)記述在許多標準的免疫學手冊及文章中，例如，參見Harlow等，1988 (24)。這些公知的免疫測定形式特別包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫斑點分析、凝集測定、抗體-肽-抗體夾心測定、肽-抗體-肽夾心測定。在一個實施方案中，免疫測定是使用包被有包含兩種PRRSV NC抗原肽(SEQ ID Nos:1和2)的肽組合物的固相的ELISA0
[0106]按照本發(fā)明的一個實施方案，所述肽能夠通過篩查ELISA檢測來自于母豬(sow)和小母豬(gilt)、公豬和閹公豬以及小豬的血清的PRRSV感染，用于評估來自于接種前的小豬的血清的母體來源的抗-PRRSV抗體的水平和用于確定接種的小豬中針對使用PRRSV抗原肽的疫苗的免疫應答水平。
[0107]在一個特定實施方案中，可以利用ELISA免疫測定來測試豬血液、血清或血漿樣品中抗-PRRSV抗體的存在，包括以下步驟:
[0108]1.將兩種PRRSV NC肽(SEQ ID Nos:1和2)的混合物連接到固體支持物上，
[0109]ii將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品；和
[0110]iii.檢測與連接到所述固體支持物上的所述肽結合的抗體的存在。
[0111]在另一個特定實施方案中，可以利用ELISA免疫測定來測試豬血液、血清或血漿樣品中抗-PRRSV抗體的存在，包括以下步驟:
[0112]i.將作為起源于歐洲毒株序列的SEQ ID NOs:1和2的同源物的兩種PRRSV NC肽(SEQ ID Nos:7和8)的混合物連接到固體支持物上，
[0113]ii將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品；和
[0114]iii.檢測與連接到所述固體支持物上的所述肽結合的抗體的存在。
[0115]在所述ELISA試劑盒的示例性的應用中，將待檢測的豬血清樣品稀釋在樣品稀釋劑中，然后在任意抗體(如果存在的話)與肽-敏化的固相結合的條件下與上述一種或多種PRRSV NC肽接觸一段時間。去除未結合的物質后(例如，通過用磷酸緩沖的鹽水洗滌)，二級復合物與標記的針對豬特異性IgG的抗體或標記的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G接觸。這些抗體或蛋白A、G或A/G與二級復合物結合形成三級復合物，并且由于第二抗體或蛋白A或G或A/G用報道分子標記，因此，當進行檢測方式時，檢測到所述三級復合物。報道分子可以是酶、放射性同位素、熒光團、生物發(fā)光分子、化學發(fā)光分子、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白等。對于ELISA，報道分子優(yōu)選是酶。
[0116]本發(fā)明的具體實施方案包括，但不限于下述:
[0117](I) 一種豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)疫苗組合物，所述組合物包含肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，其中所述肽抗原包含選自由下列各項組成的組的氨基酸序列:a) SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11,SEQ ID NO: 12，及其任意組合；b) (a)的同源物；和c) (a)或(b)的任意組合。
[0118](2)根據(jù)(I)所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
[0119](3)根據(jù)⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
[0120](4)根據(jù)⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO=Il的氨基酸序列。
[0121](5)根據(jù)⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0122](6)根據(jù)(I)所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原通過添加或缺失1_5個氨基酸而改變。
[0123](7)根據(jù)(I)所述的PRRS疫苗，其還包含共價連接到所述肽抗原的氨基端或羧基端的T輔助細胞表位。
[0124](8)根據(jù)(7)所述的PRRS疫苗，其中所述T輔助細胞表位是SEQ IDNOs:35。
[0125](9)根據(jù)(7)所述的PRRS疫苗，其中所述T輔助細胞表位通過包含ε賴氨酸殘基的間隔區(qū)共價連接到所述肽抗原上。
[0126](10)根據(jù)(9)所述的PRRS疫苗，其中所述間隔區(qū)是SEQ ID NO:36。
[0127](11)根據(jù)(I)所述的PRRS疫苗，其還包含不與抗原肽連接的T輔助細胞表位，其中所述T輔助細胞表位選自由SEQ ID NOs:47-90組成的組。[0128](12)根據(jù)⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原的總量為約IOyg至約lmg。
[0129](13)根據(jù)(I)所述的PRRS疫苗，其中所述遞送載體和佐劑選自由下列各項組成的組:Montanide ISA50V,聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯和CpG寡核苷酸。
[0130](14) 一種用于保護小豬抵抗PRRS感染的方法，所述方法包括施用⑴所述的疫苗。
[0131](15) 一種PRRS疫苗組合物，所述組合物包含:a)肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，b)包含選自由SEQ ID Nos:10，11，12，31及其組合組成的組的氨基酸序列的肽抗原，和c)選自由SEQ ID NOs:80-90及其組合組成的組的PRRSV Th肽。
[0132](16) 一種PRRS疫苗組合物，所述組合物包含:a)肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，b)包含選自由SEQ ID Nos:42，44，45，46及其組合組成的組的氨基酸序列的肽抗原，和c)選自由SEQ ID NOs:80-90及其組合組成的組的PRRSV Th肽。
[0133](17) 一種用于診斷PRRS感染的方法，所述方法包括下述步驟:a)將SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2的混合物連接到固體支持物上，b)將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品，和c)檢測與連接到所述固體支持物上的所述肽結合的抗體的存在。[0134](18)用于測試抗-PRRSV抗體存在的ELISA免疫測定法，其包括下述步驟:a)將SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8的混合物連接到固體支持物上，b)將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品，和c)檢測與連接到所述支持物上的所述肽結合的抗體的存在。
[0135]下述實施例作用于舉例說明本發(fā)明，并且不是用來限制本發(fā)明的范圍。
[0136]實施例1
[0137]使用PRRSV共轉染的HTK細胞通過免疫熒光測定(IFA)評估靶標PRRSV B細胞表位簇肽抗原與天然PRRSV蛋白抗原之間的交叉反應性的免疫血清滴度的血清學測定
[0138]可以使用共轉染重組痘苗病毒rVVT7 (T7聚合酶重組痘苗病毒)與分別編碼T7啟動子下游的PRRSV orf3、orf4和orf5的質粒的HTK細胞通過免疫熒光檢測針對PRRSV亞基蛋白GP3、GP4和GP5的抗體。這種方法提供這些PRRSV蛋白在哺乳動物細胞中的瞬時表達，具有使用其原始病毒復制的高保真度。由于PRRSV GP3、GP4和GP5由跨膜結構域和側鏈修飾組成，所以，最好的PRRSV蛋白結構只可能從頭制備。每種PRRSV亞基蛋白，即GP2、GP3、GP4或GP5，從頭合成，并且使用共轉染的HTK細胞作為通過免疫血清進行細胞內(nèi)染色的靶細胞，以在免疫測定中評估針對PRRSV的特異性抗體的存在。這種免疫熒光測定系統(tǒng)允許以高特異性和靈敏性檢測針對天然PRRSV抗原的抗體的最佳條件。
[0139]按照圖1A所示的機制，將HTK細胞系細胞轉染T7聚合酶重組痘苗病毒(rVVT7)(21),并且通過 lipofectamine?(Invitrogen) (22),共轉染PRRSV_orf3、orf4和 orf5質粒。具體來說，構建通過T7聚合酶啟動子調(diào)控表達天然PRRSV蛋白的pRRSV質粒按下述完成:通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增全長pRRSV基因(來自登記號為AF035409的臺灣PRRSV
MDOOl毒株)并且克隆到pCR2.1 丫0丨)(/質粒載體(Invitrogen)中。通過測序驗證pRRSV
質粒的表達能力，其顯示來自PRRSV毒株MDOOl的orf3、orf4和orf5的全長核苷酸序列。
[0140]HTK細胞在96-孔平板中生長至80 %匯合，感染rVVT7 (22)，然后通過Iipofectamine?(Invitrogen)分別共轉染 pRRSV orf3、orf4 和 orf5 質粒。共轉染后 24小時，將細胞用80%丙酮固定，并且將平板保存在-80°C，以通過免疫熒光測定(IFA)檢測針對PRRSV蛋白的抗體。
[0141]圖1A的示例顯示感染T7聚合酶重組痘苗病毒(T7/vac) (21)和通過
Iipofectamine? (Invitrogen)共轉染pCR_orf5質粒的HTK細胞。重組GP5蛋白在其翻譯后轉運到細胞質中(22)。按照本發(fā)明的一個實施方案，抗-GP5抗體與轉染的HTK宿主細胞的細胞質結合，由此它們能夠通過標記的二級抗體的免疫熒光進行檢測。這種方法通過在HTK細胞中由原核T7啟動子調(diào)控瞬時真核表達全長PRRSV GP5蛋白提供以高特異性檢測針對真正的PRRSV GP5蛋白的抗體。使用pCR-全長PRRSV基因組的類似的轉染也可以用來通過在HTK細胞中由原核T7啟動子調(diào)控瞬時真核表達全長PRRSV基因組而以高特異性檢測 PRRSV GP2、GP3、GP4、M 和 N 蛋白。
[0142]通過免疫熒光測定(IFA)滴定PRRSV抗體
[0143]血清樣品起始在PBS中稀釋10倍，然后2倍連續(xù)稀釋。對于每次檢測運行，包括來自PRRSV-感染的SPF豬的陽性對照血清和來自未感染的SPF豬的陰性對照血清，以驗證通過pRRSV orf-7質粒的PRRSV核殼蛋白的表達。在高于1: 10的稀釋度給出定位在細胞質的熒光信號(如圖1B所示)的血清樣品評分為IFA滴度> 10 ;這些滴度指示動物感染了 PRRSV。對于來自由于接種而包含“目標肽”特異性抗體的動物疫苗的血清，其針對特定抗原蛋白或全長PRRSV基因組的交叉反應性可以使用相對應的目標天然PRRSV蛋白(例如GP2，3，4或5)通過免疫熒光測定(IFA)進行評估。由具有天然感染的豬或由給予基于PRRSV肽的疫苗的豬收集的血清樣品的所有檢測按照編號進行。
[0144]實施例2 [0145]基于PRRSV B細胞表位簇肽抗原的ELISAs用于代表PRRSV的中和/受體結合位點設計肽的免疫原性評估
[0146]96-孔平板的孔用IOOyL在IOmM NaHCO3緩沖液(pH9.5)(除非另外指明)中2ug/mL(除非具體提及)的單個目標肽在37°C分別包被I小時。
[0147]將肽包被的孔用250 μ L在PBS中的3重量％的明膠在37°C溫育I小時，以封閉非特異性蛋白結合位點，然后用含有0.05體積％ TWEEN? 20的PBS洗滌三次并且干燥。將通過IFA檢測對PRRSV抗體陽性的豬血清和陰性對照血清用含有20體積％正常山羊血清、I重量％明膠和0.05體積％ TWEEN ? 20的PBSl: 20稀釋，除非另外指明。每孔添加一百微升的稀釋樣品，并且允許在37 V反應60分鐘。
[0148]然后，將孔用含有0.05體積％ TWEEN ? 20的PBS洗滌六次，以去除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶-綴合的山羊抗豬IgG作為標記的追蹤劑來結合在陽性孔中形成的抗體/肽抗原復合物。每孔加入一百微升處于預先滴定的最佳稀釋度且在含有I體積％正常山羊血清和0.05體積％ TWEEN ? 20的PBS中的過氧化物酶-標記的山羊抗-豬IgG并且在37°C再溫育30分鐘。將孔用含有0.05體積％ TffEI N ^ ?0的PBS洗滌六次，以去除未結合的抗體，并且與100 μ L在檸檬酸鈉緩沖液中含有0.04重量％ 3’，3’，5’，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和0.12體積％過氧化氫的底物混合物再反應15分鐘。該底物混合物用來通過形成有色產(chǎn)物來檢測過氧化物酶標記。通過加入100 μ L 1.0M H2SO4終止反應，并且確定450nm處的吸光度(A450)。
[0149]血清稀釋按照檢測動物血清中的PRRSV抗體的目的進行:(a)為了鑒定潛在的天然感染，使用1: 20稀釋，記錄A45tl讀數(shù)，并且利用內(nèi)在的固有陰性對照進行截點計算；或(b)為了確定接受基于肽的PRRSV疫苗制劑的豬的抗體滴度，檢測1: 10至1: 10，000的10倍連續(xù)血清稀釋液，并且通過A45tl的線性回歸分析計算檢測的血清的滴度，表示為Log1Q。
[0150]實施例3
[0151]鑒定診斷應用中的最佳PRRSV抗原肽以區(qū)分感染的動物與接種的動物
[0152]先前公布的來自PRRSV分離株JXAl，LV, EU, NA和來自臺灣毒株MD001的序列的PRRSV的基因組序列用來推斷開放閱讀框的蛋白序列，并且由ORF 2，3，4，5，6和7編碼的蛋白序列獲得的數(shù)據(jù)用來設計用于檢測來自具有PRRSV感染的動物的血清中的抗體的B細胞表位簇抗原肽和用于在接受標記疫苗制劑的動物中檢測誘導的特異性抗體的抗原肽，所述抗原肽代表用于標記疫苗制劑的功能性中和/受體結合位點。 [0153]我們利用這樣的策略:利用生物信息學信息和典型的免疫試驗來限制為鑒定用于診斷和疫苗應用的最佳B和T細胞表位簇肽而篩選的肽的數(shù)量。
[0154]開發(fā)區(qū)分感染的動物與接種的動物所急需的工具，其稱為“DIVA”系統(tǒng)，與標記疫苗設計方法互相補充。
[0155]由于在豬PRRSV感染過程中產(chǎn)生的大部分抗體特異性針對PRRSV 0RF7編碼的核殼蛋白(NC)蛋白，因此，針對其的主要抗原決定簇在來自同一大洲的毒株中相對充分保守的，因此，靶向NC蛋白作為檢測病毒特異性抗體和診斷感染和疾病的適當?shù)暮蜻x子。使用基于合成肽的抗原進行抗體捕獲的優(yōu)點是公知的，包括由于沒有引起假陽性的與PRRSV不相關的細胞成分導致的提高的特異性，以及由于表位簇肽的固有性質導致的提高的靈敏性。
[0156]具有已知的PRRSV感染的動物的陽性血清用來針對強的和一致性的抗原性篩選可用于抗體檢測的重疊的PRRSV 0RF7編碼的NC肽。從已知不具有PRRSV感染的正常的和SPF豬收集陰性血清。關于北美MD001毒株的NC蛋白的表位繪圖的數(shù)據(jù)總結在圖2中。使用2ug/mL的設計肽以0.1mL/孔包被平板，進行間接ELISA。合成具有來源于MD001 NC蛋白的序列的長度增加兩個系列(a至e)的肽。合成4171系列的肽(圖2A所示)，C端從殘基71開始，同時合成4172系列的肽(圖2B所示)，C端從殘基123開始。這些肽分別用于平板包被并且用三組匯集的PRRSV陽性血清以及一組12份驗證的PRRSV陰性血清檢測每種肽的靈敏性和特異性。
[0157]如圖2A所示，發(fā)現(xiàn)肽4171e(SEQ ID NO:1)在用具有位于肽4171e的N端的序列“PNNNGKQQKKK” (SEQ ID No:91)的Ilmer抗原表位檢測的該4171系列的肽中是抗原性最強的。
[0158]如圖2B所示，發(fā)現(xiàn)鈦4172e (SEQ ID NO:2)在用具有位于N端的序列“EKPHFPLATEDDVRHHFT”(SEQ ID No:92)的18mer抗原表位檢測的該4172系列的肽中是抗原性最強的。
[0159]18mer 抗原表位 “EKPHFPLATEDDVRHHFT” (SEQ ID No:92)在存在于肽 4171a_d 中時沒有抗原性。然而，該18mer肽表位本身存在于全長4171e分子(SEQ ID NO: I)中以與SEQ ID NO:1上的Ilmer抗原表位“PNNNGKQQKKK”組合形成大的構象表位。此外，兩種70和73mer肽(分別為SEQ ID N0:1和2)的出乎意料的免疫顯性抗原性與代表NC蛋白上的大暴露表面的長肽一致，呈現(xiàn)長的連續(xù)的和不連續(xù)的表位的隊列。[0160]抗原肽4171e(SEQ ID No:1)和 4172e(SEQ ID No:2)以 2:1 比例的混合物用于以3ug/mL每孔0.1mL進行平板包被，其形成用于捕獲/檢測針對PRRSV北美毒株的抗體的UBI PRRSV NC ELISA 的一部分。
[0161]如圖3所示，比對來自多個PRRSV毒株(MD001，JXAl，NA和EU)的同源性NC蛋白序列。盡管與親本MD001序列比較時，對于起源EU序列存在顯著的氨基殘基的置換、插入和缺失，但是，表1所示的基于起源歐洲毒株的PRRSV核殼蛋白氨基酸序列的置換肽同源物(SEQ ID No:3和SEQ ID No:4)在UBI PRRSV NC EU ELISA中類似地用作抗原，用于捕獲/檢測針對PRRSV歐洲毒株的抗體。
[0162]一組之前通過IFA檢測關于抗-PRRSV NC蛋白反應性表征的30份血清用作陽性血清組，以進一步驗證UBI PRRSV NC ELISA的靈敏性和特異性。如表2所示，當IFA的檢測界限為約1: 16稀釋度時，UBI PRRSV NC ELISA具有與關于NC蛋白的IFA檢測大致相同的靈敏性水平。UBI PRRSV NC ELISA檢測用作補充的血清學工具來評估現(xiàn)場樣品(fieldsample)并且鑒定感染的動物和接種的動物，以及評估其他實施例中所述的基于PRRSV標記肽的疫苗。
[0163]實施例4
[0164]設計并合成用于血.清學驗證的肽，以鑒定用于PRRSV標記疫苗的抗原肽
[0165]設計大量PRRSV抗原肽全體成員，所述PRRSV抗原肽代表來自PRRSV GP2，GP3，GP4，GP5，M和NC蛋白的PRRSV B和T細胞表位簇位點，序列長度為約10至約70個氨基酸。對于一些肽，在適當位點進行氨基酸置換，以允許形成環(huán)形的肽，從而發(fā)揮對局部結構保持的限制，進而使與相對應的 天然蛋白的交叉反應性最大化。對于其他抗原肽，進行于人造組合Th肽(例如，UBITh3，SEQ ID No:15)的連接，以增強其各自的免疫原性。所有的肽進行勞動力集中型和時間靈敏性的“血清學驗證”過程，包括肽合成的重復循環(huán)，疫苗制劑，動物免疫，和血清學檢測，以產(chǎn)生候選肽，用于在目標動物中進一步檢測已經(jīng)通過我們的初步應用的各種診斷劑和疫苗。
[0166]用于免疫原性檢測的所有肽使用430A、431和433型應用生物系統(tǒng)肽合成儀(Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models 430A,431 和 433)利用 Fmoc 化學合成。每種肽都是通過獨立合成在固相支持物上產(chǎn)生，具有N端Fmoc保護和三功能氨基酸的側鏈保護基團。將合成完畢的肽從固相支持物上切下，并且通過90%三氟乙酸去除側鏈保護基團。合成的肽制劑通過Matrix輔助的激光解析飛行時間(Matrix-Assisted LaserDesorption Time-Of-Flight, MALDTOF)質譜法表征正確的組成，并且通過反相HPLC表征包括合成模式和濃度的內(nèi)容。對于長的合成，盡管嚴格控制偶聯(lián)效率，但是由于延伸循環(huán)過程中的事件還產(chǎn)生肽類似物，所述延伸循環(huán)過程中的事件包括氨基酸插入、缺失、置換和提前終止，由此導致與目標肽合成物一起產(chǎn)生多種肽類似物。但是，當作為免疫診斷目的的抗體捕獲抗原或作為接種目的的免疫原用于免疫學應用中時，肽制劑中的此類肽類似物仍然適于作為抗原性和免疫原性的貢獻劑。典型地，有意設計的或通過合成方法作為副產(chǎn)物混合物產(chǎn)生的此類肽類似物通常與需要的肽的純化制劑同樣有效，只要開發(fā)出有判斷力的QC方法來監(jiān)測制備過程和產(chǎn)物評估過程，從而保證利用這些肽的最終產(chǎn)品的再現(xiàn)性和功效。
[0167]圖4顯示已經(jīng)通過我們初始的研究和用于后續(xù)疫苗制劑應用的驗證的所選的在PRRSV 2至ORF 7編碼的蛋白(GP2，GP3，GP4，GP5，M和NC蛋白)上的B和T細胞表位的分布/定位。B細胞表位簇肽免疫原的設計目標是產(chǎn)生模擬所選的功能位點的抗原肽，其能夠誘導中和抗體或參與PRRSV受體與靶細胞的結合?；趩蝹€PRRSV毒株序列或作為用于病毒覆蓋寬度的組合序列，如來源于數(shù)種PRRSV毒株序列,在受體結合/中和位點周圍的四個氨基酸構架GP5.1,5.2,5.3和5.4上設計特異性的GP5 B細胞表位簇肽，如表4所示(SEQID Nos:9-14)，以檢測其與天然PRRSV GP5蛋白抗原的相對免疫原性和交叉反應性。
[0168]基于PRRSVJXA1序列，在來自結構蛋白GP2至GP4的中和位點周圍設計的另外的B細胞簇抗原肽具有這樣的設計:GP2B表位(V111-L136)，GP3B表位(C57-C75)和GP4B表位(C52-C69)，其顯示在表3中。GP2 B(V111_L136)作為線性肽(SEQ ID NO:6)存在，而GP3B表位(C57-C75)和GP4 B表位(C52-C69)作為環(huán)形肽(SEQ ID NOs:7和8)存在，從而允許對構象保持的局部限制。這些抗原肽還分別在GP5.1和GP5.2構架的C端(SEQ IDNos:29 和 30)或在 N 端(SEQ ID Nos:39-46)與人造組合 Th 肽(SEQ ID No:15)連接，如表5所示，以由于其長度短的性質來增強這些肽抗原的免疫原性。這些B細胞表位簇肽免疫原結合在疫苗制劑中，按照充分設計的流程免疫到豚鼠中或豬中，按時收集免疫血清用于廣泛的血清學評估。這些免疫血清基于用于免疫原性的ELISAs進行檢測，以檢測其針對各種目標肽抗原的抗體滴度。
[0169]通過免疫熒光測定(IFA)檢測針對PRRSV天然蛋白抗原的交叉反應性如實施例1所述進行。這是評估設計的肽免疫原用于最終疫苗制劑的適用性。對于合格作為肽免疫原的那些肽抗原，進一步設計具有來源于表3所示的起源PRRSV毒株(例如，MD001，JXALNA和EU毒株)的序列或共有(cons)序列的肽同源物，或具有表4關于SEQ ID Nos32, 33和34、來源于其的組合序列的肽同源物作為肽免疫原來允許在免疫的宿主中誘導抗體，以具有與不同毒株的PRRSV的廣泛的交叉反應性。
[0170]關于T細胞表位簇肽免疫原的設計是簡單得多的。選擇基于其在從PRRSV-免疫的并后期攻擊的豬獲得的外周血單核細胞(PBMCs)培養(yǎng)物中誘導IFN-Y反應的能力充分表征的免疫顯性T細胞表位結合在疫苗制劑中，以拓寬免疫的宿主中的細胞介導的免疫應答?；赑RRSV JXAl毒株來自GP4，GP5，M和NC蛋白的T細胞表位簇肽的序列和在各種PRRSV毒株(MD001，NA和EU)中的同源PRRSV T輔助細胞表位序列的比對在表6中顯示為SEQ ID Nos:47-790為了提高這些相當疏水性的肽抗原的可溶性，對于其向每個T輔助細胞肽的N端添加三個賴氨酸殘基(KKK)，以作用為肽免疫原。通過等比例混合所有鑒定的Th肽免疫原(SEQ ID Nos:47-79)制備這些T細胞簇肽的匯集物，作為疫苗制劑中的補充劑(T細胞表位匯集物I)，以進一步增強PRRSV B細胞簇肽免疫原的免疫原性，并且其自身作為PRRSV T細胞肽免疫原用以細胞介導的免疫性。
[0171]為了進一步拓寬對動物多樣性遺傳背景的T細胞表位覆蓋性，對于每種T細胞表位基于四種同源性T表位序列制備針對特定表位的組合肽。類似地,在各個組合T表位簇肽免疫原(SEQ ID.NOs:80-90)的N端添加三個賴氨酸殘基(KKK)，如表7所示。這些T表位簇組合肽免疫原的匯集物(匯集物2)用作疫苗制劑中的補充劑，以進一步增強PRRSV B細胞簇肽免疫原的免疫原性，并且其自身作為PRRSV T細胞肽免疫原用以細胞介導的免疫性。
[0172]實施例5
[0173]用包含來自GP5，2，3和4蛋白的PRRSV B表位簇肽抗原的疫苗制劑免疫豚鼠和豬，用于評估與天然PRRSV蛋白的免疫原性和交叉反應性
[0174]胞外結構域是膜蛋白延伸到細胞外空間(在細胞外的空間)的結構域。胞外結構域通常是病毒蛋白起始與靶細胞表面接觸并且在感染過程中負責附著并進入細胞內(nèi)的部分。由于中和抗體阻斷病毒與其細胞受體的相互作用，所以，與病毒進入相關的結構域對于中和抗體的誘導是重要的。當開發(fā)下一代有效的PRRSV疫苗時，因此，重要的是評估PRRSV與病毒進入相關的結構域的功能性。巨噬細胞-特異性的凝集素唾液酸黏附素(CD163)是巨噬細胞上關鍵的病毒受體。使用可溶形式的唾液酸黏附素，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRRSV GP5和M復合物的二硫鍵連接的異二聚體是唾液酸黏附素的配體。這種配體-受體相互作用依賴于唾液酸黏附素的凝集素活性和GP5糖蛋白上的唾液酸。因此，研究PRRSV GP5蛋白的胞外結構域以及M對GP5免疫原性的影響來鑒定用于PRRSV標記疫苗制劑的最佳GP5肽免疫原，目的在于誘導阻斷病毒M/GP5與宿主細胞受體唾液酸黏附素之間的相互作用的免疫性。
[0175]在PRRSV GP5蛋白的胞外結構域中的受體結合/中和位點周圍設計多于45種肽抗原，并且分組成四個氨基酸序列構架，用于免疫原性評估。[0176]基于PRRSV毒株MD 001的序列，第一構架從GP5胞外結構域的C端殘基“E”(谷氨酸)開始并且一直延伸到胞外結構域的N端，包括GP5蛋白信號序列中的五個另外的氨基酸殘基，從而組成40mer肽抗原，如表4的GP5.1MD001 (A26-E65)肽抗原(SEQ ID No:29)所示。這種設計允許在GP5肽抗原的中間部分存在Cys殘基，以在需要時，用于與M肽的胞外結構域形成二硫鍵。
[0177]第二結構域是GP5.1MD001 (A26-E65)肽抗原在N端延伸到信號序列中的五個另外的氨基酸殘基，形成 45mer 肽GP5.2 MD001 (V21-E65) (SEQ ID No:30)，其中在 C24 與 C48 之間的分子內(nèi)二硫鍵能夠允許保持GP5胞外結構域的局部構象(regional conformation)。這種設計將允許在不存在M蛋白的條件下誘導針對GP5大部分胞外結構域的特異性抗體。
[0178]第三構架依據(jù)第二構架肽抗原GP5.2MD001 (V21-E65)建模，不同在于略去胞外結構域的 llmer GP5HV2 區(qū)域，從而產(chǎn)生 34mer 肽抗原 GP5.3 (V21-D54) (SEQ ID No:9)。這種設計將允許B細胞識別GP5胞外結構域的高度保守的中央?yún)^(qū)域。
[0179]第四構架(GP5.4)針對位于GP5胞外結構域中央的環(huán)狀結構，基于PRRSV毒株MDOOI序列產(chǎn)生25mer的環(huán)狀肽GP5.4 (C24-C48)。為了調(diào)和毒株與毒株間的變異，依照根據(jù)北美類型JXA1/MD001和JXAl/NJ-a的PRRSV毒株序列的第三和第四氨基酸構架的肽抗原建模的組合肽設計為 GP5.3JXA1/MD001 (V21-D54) (SEQ ID No:32)，GP5.3JXAI/NJ-a(V21-D54)(SEQ ID NO:33)和GP5.4 NJ-a/JXAl/MD001(C24-C48)(SEQ ID NO:34)。為了評估M蛋白胞外結構域對GP5胞外結構域(ectocdomain)肽免疫原性的影響,基于MD001序列設計(M1-Y26)具有下述序列的26mer胞外結構域肽:“MGSSLDDRCHDSTAPQKVLLAFSITY” (SEQ ID No:93)用于評估。
[0180]PRRSV的結構由與病毒RNA締合的核殼蛋白組成。核蛋白被脂質包膜圍繞，其中包埋六種結構蛋白:GP2，GP3，GP4，GP5和非糖基化的蛋白M和E (0RF2b)。GP5和M是包膜中最豐富的蛋白，而其他包膜蛋白以較低的量存在。GP5已經(jīng)成為PRRSV保護性免疫性的主要靶標，然而，依據(jù)PRRSV的可變性以及最近的發(fā)現(xiàn)，即，GP2和GP3也在某種程度上參與臨床和病毒學保護，而記錄的與來源于GP2，GP3和GP4的抗原肽結合的多克隆抗體也表現(xiàn)出針對PRRSV的中和活性，還設計了選自GP2，GP3和GP4的肽抗原，對其進行篩選和鑒定，以結合在PRRSV疫苗制劑中。具體地，基于PRRSVJXAl毒株序列，設計表3所示的抗原肽GP2B表位(V111-L136) (SEQ ID No:10)，GP3B 表位(C57-C75) (SEQ ID No:11)，GP4B 表位(C52-C69)(SEQ ID No:12)用于免疫原性和交叉反應性評估。表3中還列出了來自不同PRRSV毒株的同源GP5，GP2，GP4和GP4來源的B表位序列作為肽抗原設計參照的實例。
[0181]這些來自GP5，GP2，GP3和GP4的B表位簇肽抗原還分別在GP5.1和GP5.2構架的 C 端(SEQ ID Nos:37 和 38)或在 N 端(SEQ ID Nos:39-46)與人工組合 Th 肽(SEQ IDNo:35)連接，如表5所示，以克服其長度短的性質而增強這些肽抗原的免疫原性。
[0182]疫苗制劑 [0183]在本發(fā)明的基于肽的PRRSV疫苗的示例性的應用中，具有包含表3-7中SEQ IDNos:9-90列出的受體結合/中和或T輔助細胞表位簇位點的肽作為免疫原的疫苗制劑，其不與外源Th表位的連接或通過氨基端或所極端與Lys-Lys-Lys- ε NLys (SEQ ID No:36)或ε NLys間隔區(qū)與外源T輔助細胞表位(如人工組合的Th序列UBITh ? 3 (SEQ ID No:35))連接，使用商購的油性疫苗遞送載體Montanide ISA 50V2按照供應商推薦的方法配制成油包水乳液。Montanide? ISA 50V2 (Seppic, Paris France),是一種二縮甘露醇油酸酷和礦物油的油性的佐劑組合物，通常用于豬疫苗，將其用等體積的在PBS中的水相肽溶液乳化。按照特定的流程(例如，肽比例和在乳液中的總肽濃度)，將肽免疫原分別配制成約25至75ug/mL的溶液。將基于乳液的疫苗制劑以每位點0.25mL至0.5mL肌內(nèi)注射到豚鼠中或以每位點ImL注射到小豬中，除非另外具體指明。
[0184]用設計的肽疫苗制劑免疫豚鼠和小豬
[0185]對于在豚鼠中進行的免疫原性研究，使用成年成熟的且首次用于實驗的雄性和雌性Duncan-Hartley豚鼠(300_350g/BW)每組3只。動物在O和3wpi用特定的疫苗制劑肌內(nèi)(頂)免疫2個劑量。在免疫之前，疫苗制劑應該在室溫放置約30分鐘，并且渦旋約10至15秒。在初次免疫后0，3和5周(wpi)采集血液獲得血清樣品。這些樣品通過基于目標肽的ELISAs進行檢測，檢測直接的結合滴度，以及通過基于PRRSV共轉染的細胞的IFA進行檢測，檢測交叉反應性滴度，如實施例1和2所述，以進行所述肽免疫原和疫苗制劑的免疫原性評估。
[0186]將來自無特異性病原體(SPF)的農(nóng)場的約4周齡的小豬在耳部標記進行免疫原性研究，并且按照研究流程分組(3-5頭小豬/組)。在第O和4周，這些組通過肌內(nèi)用疫苗組合物免疫。在一個研究中，利用來自具有先前的PRRSV感染的常規(guī)農(nóng)場的小豬來評估在存在抗PRRSV抗體的條件下設計的PRRSV肽抗原的獨立的免疫原性，評估通過使用診斷性ELISA檢測的組合進行，以區(qū)分感染的豬和接種了本發(fā)明的標記疫苗制劑的豬，并且還檢測豬對所述PRRSV標記疫苗制劑的反應。
[0187]在第一次免疫時，在3-4周第一次加強時，以及在加強后兩周即在5-6周時采集血液樣品，制備血清樣品并且進行多重血清學測試，以評估免疫原性和交叉反應性，如實施例1和2詳細所述。
[0188]由PRRSV GP5蛋白胞外結構域序列設計的肽免疫原的優(yōu)化和排序
[0189]在所制備的多種GP5胞外結構域肽免疫原中，將它們中的九種配制成乳液制劑，以在致敏和加強免疫時間表后示例并排序其相對免疫原性。從表8可以看出，基于PRRSVMDOOl序列的肽免疫原4020Kc(SEQ ID No:38)的免疫原性比肽免疫原4020 Kb (SEQ IDNo:37)的強，二者均基于目標肽ELISA( > I 1glO)和IFA滴度。因此，氨基酸序列構架
2(GP5.2)設計優(yōu)于構架I (GP5.1)。肽免疫原4020Kc用在大部分通過PRRSV MDOOl進行的PRRSV攻擊研究中，如在實施例6中詳細所述。如表8所示，發(fā)現(xiàn)按照構架3 (GP5.3)設計的具有來源于PRRSV MD001的序列的肽免疫原4048Kb (SEQ ID No:39)具有大致與肽4020Kc相同的免疫原性，然而，其IFA滴度高于肽免疫原4020Kc的滴度。當與肽免疫原4048Kb比較時，使用基于第三構架(GP5.3)設計的另一種肽免疫原4050Kb (SEQ ID No:40)發(fā)現(xiàn)如通過ELISA和IFA 二者證明的相似的免疫原性。因此，認為構架3是關于GP5B細胞表位簇抗原呈遞的更有利的設計。
[0190]為了拓寬病毒毒株的覆蓋性，我們因此基于氨基酸序列構架3，如肽免疫原4052Kb (SEQ ID No:41)和肽4124Kb (SEQ ID No:42)，繼續(xù)設計一些相關的組合抗原，以檢測與單一序列GP5肽4048a(SEQ ID No:9)和4050a(SEQ ID No:31)比較的抗體應答性的寬度。對于來源于用肽4052Kb免疫的免疫血清，發(fā)現(xiàn)與MD001和JXAl來源的GP5.3的構架序列的雙重反應性，因此證實覆蓋MD001與JXAl 二者的寬度。設計GP5.3肽抗原4124a(SEQID No:30)和4124Kb (SEQ ID No:42)來進一步擴展所述肽免疫原的組合性質，并且比較其各自的免疫原性。如表8所示，與肽抗原4124a相比，對肽4124Kb發(fā)現(xiàn)免疫原性的顯著增強，如通過ELI SA和IFA 二者所示，這表明與肽抗原4124a連接時人工組合Th表位(SEQ IDNo:35)的免疫原性增強作用。減少在N端和C端兩端的氨基酸以保持GP5的環(huán)化結構已經(jīng)形成肽抗原4094a (SEQ ID No:35)的設計及其免疫原性更強的形式肽抗原4094Kb (SEQ IDNo:43)的設計。兩種肽抗原在這樣的序列調(diào)整后都表現(xiàn)出減少的免疫原性，因此人工構建的環(huán)結構(C24-C48)保留GP5胞外結構域的關鍵部分，并且通過從N端和C端兩端延伸到肽抗原4124a和4124Kb結構，可以最理想地建立由此增強的免疫原性。
[0191]在所有的評估中，在C端連接人工組合Th肽(SEQ ID No:35)，如在肽抗原4020b和4020c的情形中所示，形成4020Kb和4020Kc，或在N端連接人工組合Th肽(SEQ ID No:35)，如4124a，形成4124Kb，均促使各種肽抗原變成更好的肽免疫原。將肽4094和4124系列的肽抗原制成乳液疫苗制劑，用于進行通過PRRSVJXA1毒株的基于PRRSV GP5的攻擊研究，如實施例7中所述，使用肽免疫原4124Kb證明甚至使用該乳液的單次施用(組5)也能成功地完全保護(20/20 = 100%)首次用于實驗的小豬免受高度致病性PRRSVJXAl毒株的感染，而肽免疫原4094系列在兩次劑量的免疫后發(fā)揮亞最佳的保護作用(4/5 = 80% )0_2] PRRSV胞外結構域M肽對GP5B表位簇肽抗原免疫原性的影響
[0193]GP5和M是PRRSV包膜中最豐富的蛋白，并且這兩種蛋白在其胞外結構域形成二硫鍵連接的異二聚體，以作用為在巨噬細胞的細胞表面上的唾液酸黏附素受體(⑶163)的配體。制備全長M胞外結構域肽抗原(長度為26mer)，并且以1:1和1: 10的比例與全長GP5胞外結構域肽免疫原4020Kb或4020Kc混合，以評估該胞外結構域M肽對兩種GP5胞外結構域肽抗原4020Kb和4020Kc的免疫原性的影響。
[0194]如表9所示，發(fā)現(xiàn)當以等比例與GP5肽免疫原4020Kb和4020Kc混合時，該26mer胞外結構域M肽令人驚訝地是免疫原性的，其中M針對GP5肽免疫原4020Kb和4020Kc的相對免疫原性分別排序為約1000-和100-倍，如果通過基于肽的ELISA測量的(比較組I和2 ；比較組3、4和5)。關于GP5肽免疫原4020Kc的IFA滴度也以劑量依賴性方式被顯著抑制(比較組3、4和5)。由于配體-受體相互作用依賴于巨噬細胞上唾液酸黏附素的凝集素活性和在GP5糖蛋白上的唾液酸，因此，重要的是保持GP5的免疫原性，以允許誘導與PRRSV包膜中的這種主要蛋白結合的抗體。因此，盡管提示M肽與包膜上的GP5共價連接因此形成作為配體的GP5/M復合物的一部分，在我們隨后的PRRSV疫苗設計中在基于B細胞表位簇肽抗原的成分中被省略掉。
_5] PRRSV Th匯集物的不同劑暈對PRRSV GP5B細胞表位簇肽抗原的IFA滴度的影響
[0196]代表GP5胞外結構域的中央環(huán)化結構(C24-C48)的GP5肽抗原4094a具有亞最佳免疫原性，其被用于該小豬中的研究，以研究不同劑量的PRRSV Th肽對B細胞表位簇肽抗原免疫原性的影響。等比例的PRRSVTh表位簇肽的混合物進一步補充有5%，10%，20%至50%的4094a肽抗原(SEQ ID No:31)。將包含B細胞表位簇抗原肽和T細胞表位簇肽抗原二者的疫苗制劑通過具有致敏和加強方案的標準免疫流程以30ug/mL亞最佳劑量給予小豬，以監(jiān)測所述PRRSV Th表位對肽抗原4094a免疫原性的影響(組I至組4)。盡管對于這些監(jiān)測的組，通過ELISA測量的免疫原性沒有顯著變化，但是IFA滴度證實在這些小豬中誘導的針對天然PRRSV GP5蛋白的抗-肽抗體的交叉反應性以劑量依賴性方式提高。為進行比較，還表明具有共價連接到4094a (序列ID No31)上的組合Th表位的GP5B細胞表位簇肽免疫原4094Kb (SEQ ID No:43)(組5)相對于單獨的肽抗原4094a具有提高的免疫原性。這些短的PRRSV Th肽(SEQ ID Nos:47-79)，已知在將免疫的宿主致敏后當暴露于PRRSV時其通過回憶應答建立針對PRRSV的細胞介導的免疫性，所述肽不與B細胞表位簇肽抗原共價連接。由提高的IFA滴度顯示的抗體應答性質量改善指示所述T細胞介導的免疫應答的益處。為了建立寬泛基礎的細胞介導的免疫性，包括在暴露于PRRSV時產(chǎn)生針對PRRSV的細胞因子，在所有后續(xù)的攻擊研究中，這些仔細選擇的PRRSV Th肽與PRRSV B細胞表位簇肽免疫原一起以20% (w/w)包含在所述疫苗制劑中。
[0197]在抗原位點周圍鑒定和設計具有中和活性的高度免疫原性的GP2、GP3和GP4B細胞簇肽
[0198]根據(jù)最近的發(fā)現(xiàn)，即，與來源于GP2、GP3和GP4蛋白的抗原肽結合的多克隆抗體還表現(xiàn)出針對PRRSV的中和活性，并且這些PRRSV包膜的次要蛋白也在某種程度上參與抵抗PRRSV的臨床和病毒學保護，基于PRRSVJXA1毒株序列設計特異性的抗原肽GP2 B表位(V111-L136) (SEQ ID No:6) ,GP3 B表位(C57-C75) (SEQ ID No:11) ,GP4 B表位(C52-C69)(SEQ ID No:12)，如表3所示，并且鑒定為候選肽抗原用于免疫原性和交叉反應性評估。這些B表位簇肽抗原分別在N端連接人工組合Th肽(SEQ ID No:35)，成為GP2、3和4B細胞表位簇抗原肽(SEQ ID Nos.44-46),用于在豚鼠中進行的免疫原性評估。
[0199]包含在抗原位點周圍的單獨、特異性設計的具有中和活性的GP2、GP3和GP4 B細胞簇肽的疫苗制劑，連接人工組合Th序列或不連接人工組合Th序列，在豚鼠中進行檢測，以評估其各自的免疫原性。在多種設計的肽免疫原中，三種在N端連接人工組合Th肽的肽(SEQ ID Nos:44,45和46)甚至在以30ug的劑量單次施用時表現(xiàn)出令人驚訝地高免疫原性，如表11所示。因此，這些高度免疫原性的肽是結合在最終PRRSV疫苗制劑中的突出的候選物。
[0200]在豚鼠中關于組合的GP2、GP3、GP4和GP5表位簇肽免疫原的免疫原性評估
[0201]在精細化關于來源自PRRSV GP2，3，4和5蛋白的每種B細胞表位簇肽抗原的設計后，在基于標準乳液的疫苗制劑中以相等的比例混合的這些肽的組合，以30ug/mL的總肽濃度進行初次致敏，在3 wpi以15ug/mL進行隨后的加強，檢測當與其他肽抗原混合時每種肽抗原的免疫原性，并且還評估肽抗原混合物的整體免疫原性，從而評估和避免對所述混合物中一種或多種抗原的免疫原性的任何不需要的抑制作用。進行這樣的評估以避免M肽對GP5/M肽抗原混合物的負影響。
[0202]如表12所示，當GP4 B表位簇肽抗原(SEQ ID No:46)與GP3 B表位簇肽抗原(SEQ ID No:45)混合成為 GP3/4 組合制劑(combo formulation)，與 GP3 (SEQ ID No:45)和 GP 5 (SEQ ID No:42)組成成為 GP3/4/5 組合制劑，或與 GP2 (SEQ ID No:44)和 GP3 (SEQID No:45)組合成為GP2/3/4組合制劑時，通過基于目標肽的ELISA判斷的GP4肽抗原的免疫原性在與GP3靶標肽混合時保持為強的，但是當以三肽抗原混合物存在時，被顯著減弱。當與GP4肽抗原比較時，GP2和GP3表位簇肽抗原的免疫原性保持與單肽抗原一樣免疫原性。因此，GP2和GP3表位簇肽抗原可以更穩(wěn)健地用在任何PRRSV肽抗原混合物中，以增強免疫應答覆蓋的寬度。盡管事實上GP2、GP3和GP4是病毒包膜上的次要成分，但是，在不存在GP5抗原肽的條件下(例如，組1、2和4)，通過肽抗原混合物獲得合理的IFA滴度，這表明與相對應的天然PRRSV蛋白抗原的交叉反應性。
[0203]實施例6
[0204]補充有PRRSV Th表位簇肽抗原的基于GP5來源的肽的PRRSV疫苗保護小豬免受PRRSV MD001毒株的攻擊
[0205]為了證明PRRSV GP5 B細胞表位簇肽抗原保護豬免于PRRSV感染的功效，由臺灣的動物技術研究所(Animal Technology Institute, Taiwan(ATIT))進行三次連續(xù)的免疫和攻擊研究。為了客觀地評價由PRRSV GP5B表位簇肽抗原制備的疫苗制劑，將所有的制劑編碼。對SPF豬進行規(guī)律性檢測，以確保沒有病原體，包括豬瘟(ClassicalSwine Fever)、假性狂犬病 (Pseudorabies)、萎縮性鼻炎(Atrophic rhinitis)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、口蹄疫(Foot and Mouth Disease)、豬痢疾(Swine Dysentery)、擠瘡(Scabies)和胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。所有來自PRRS1001S、1002S和1003S研究的組使用GP5B表位簇肽免疫原4020Kc(SEQ ID No:38)和4052Kb (SEQ ID No:41)，并且在一些制劑參數(shù)中具有較少的變化。對于組I和2的來源于4020Kc抗原肽的疫苗制劑，以及組3和4的來源于4052Kb抗原肽的疫苗制劑，認為這些制劑是等價的。在各種疫苗制劑中以10重量％補充匯集的等比例的 PRRSV Th 表位肽混合物(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于JXAl序列)，以進一步增強免疫原性，通過提供細胞介導的免疫性，增強PRRSV GP5肽抗原的免疫原性。
[0206]為了不污染轉基因SPF農(nóng)場，在兩位位點進行研究，僅免疫部分在轉基因SPF農(nóng)場進行，該農(nóng)場提供四周齡的SPF豬進入這些免疫/攻擊研究。該農(nóng)場由ATIT掌管，并且位于臺灣北部新竹香山的隔離地區(qū)。在完成4周的致敏和加強免疫流程后，將SPF豬轉移到臺灣南部的另一個良好控制的農(nóng)場，用于攻擊研究。由于在臺灣流行美洲PRRSV毒株，因此，在這些攻擊研究中采用兩株美洲毒株，即MD-001和AMERVAC-PRRS。病毒攻擊后，采集血清樣品進行IFA和病毒血癥檢測。最后，將動物麻醉并進行總體檢查和病理學檢查?；谘芯吭O計將SPF小豬分組，每組5只動物。如表13所示采集血液樣品。通過PRRSV-0RF5IFA檢測(通過rVV-PRRS 0RF5表達方法)檢測采集的所有血清樣品。[0207]注射后的臨床觀察
[0208]在每次疫苗施用之前和之后，所有小豬進行臨床觀察以觀察局部反應(包括部位反應發(fā)生和過敏反應)和系統(tǒng)反應(包括呼吸困難、食欲、腹瀉、咳嗽、CNS/SS和過敏反應)。在研究過程中，發(fā)現(xiàn)與腫脹相關的偶然的局部部位反應發(fā)生，其持續(xù)不超過3-4天，并且恢復至正常情形，沒有觀察到進一步的不同。對由研究的所有動物沒有觀察到系統(tǒng)的不利反應。
[0209]病毒攻擊后的臨床觀察
[0210]在接受病毒攻擊后監(jiān)測的期間過程中，所有免疫的豬沒有表現(xiàn)出PRRS典型的臨床跡象。
[0211]在免疫和攻擊后的IFA檢測和 肺損傷
[0212]在免疫后產(chǎn)生特異性針對PRRSV的抗體，并且通過IFA檢測在4和6 wpi (免疫后的周數(shù))達到高滴度，如表14所示。如表14所示，甚至在PRRSV攻擊研究后，對照組中也沒有一只動物誘導針對PRRSV GP5蛋白的抗體，主要是由于當存在于攻擊病毒儲液中時PRRSVGP5蛋白的弱免疫原性性質。在病毒攻擊后在2 wpc (攻擊后的周數(shù))，接種的組保持高IFA滴度。在20頭用PRRSV GP 5B表位簇肽抗原疫苗制劑(4020KC用于組I和2，4052Kb用于組3和4)免疫的小豬中，有18頭被完全保護(保護率為90% )，沒有檢測到任何損傷。在組3和4中的小豬中有兩頭檢測到輕微的損傷。相比之下，發(fā)現(xiàn)80% (4/5)的豬具有嚴重的間質性肺炎損傷，如圖7A和7B所示?；谠贏TIT的PRRSV實驗室中進行的廣泛的攻擊檢測，較高的關于PRRSV GP5蛋白的IFA滴度與抵抗PRRSV攻擊的完全保護作用充分相關。
[0213]病毒血癥檢測
[0214]使用關于PRRSV病毒負荷檢測的PR-PCR方法，在所有接種的豬中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的病毒負荷。這表示于肺中的保護功效結果的一致性。盡管這兩種病毒毒株在感染后不引起嚴重的癥狀，但是，在18/20的接種的豬中缺乏病毒血癥和完全缺乏病理學結果證實了已證明的觀點:通過基于PRRSV GP5肽的疫苗制劑提供陽性保護功效。
[0215]實施例7
[0216]補充有PRRSV Th表位簇肽抗原的基于GP5來源的肽的PRRSV疫苗在單次和致敏-與-加強免疫方案后保護小豬免受高致病性PRRSV (NVDC-JXAl毒株)的攻擊
[0217]中國PRRSVTXAl攻擊樽型的背景:
[0218]2006年，在中國爆發(fā)了空前大規(guī)模的初始未知的但是所謂的“高熱”疾病，其具有PRRS的性質，其擴散到超過10個省(直轄市或自治區(qū))并且感染了超過2，000，000頭豬，致死病例大約有400，000例。與典型性PRRS不相似，很多成年母豬也感染了這種“高熱”疾病。這種非典型的PRRS流行病最初鑒定為豬霍亂樣疾病(hog cholera-like disease),表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀(例如，顫抖)，高熱(40-42°C ),熱燙皮疫紅斑(erythematous blanching rash)等等。與免疫性分子組合的尸體解剖清楚地表明多個器官感染了高度致病性的PRRSVs，觀察到嚴重的病理學變化。在 Kegong Tian 等(2007PLos0ne do1: 10.1371/journal,pone.0000526)關于致死性PRRSV變體的出現(xiàn):非典型PRRS在中國的空前爆發(fā)以及特有的標志的分子剖析(Emergence of Fatal PRRSV Variants:Unparalleled Outbreaks ofAtypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark)的共同努力下，在中國建立了豬感染模型，用來用三株不同來源PRRSV的代表性PRRSV分離株攻擊12頭SPF-豬(4頭小豬/組)再現(xiàn)分離的PRRSV的高致病性。
[0219]每組中，兩頭小豬靜脈內(nèi)注射，并且二者都在6-8周內(nèi)死亡，暗示所檢測的PRRSV毒株的毒力高。類似地，每組中另外兩頭小豬鼻內(nèi)接種，并且它們在3-6天內(nèi)發(fā)展了顯著的“高熱”疾病跡象(例如，高熱、血斑、瘀點(petechiae)、顫抖和lamping等)，并且都在感染后第10天死亡。隨后，從感染的豬成功回收病毒分離株并且通過PCR檢測和EM驗證。進行尸體解剖來評價免疫學作用和病理性損傷。觀察到與在“高熱”流行病期間致死的豬中幾乎相同的病理學變化(在肺、心臟、腦、腎、肝中等等)，因此證實2006年中國“高熱”疾病的爆發(fā)是由豬群體中的高度致病性的PRRSV感染引起的。一種PRRSV分離株，即JXA1，現(xiàn)在在標準化攻擊研究中用作標準病毒，以按照PRC指南驗證PRRSV疫苗在小豬中的保護功效。
[0220]按照PRC政府疫苗產(chǎn)品指南的有效的PRRSV攻擊和疫苗功效的定義
[0221]四周齡的小豬用基于肽的PRSRV疫苗制劑接種一次或以2周的時間間隔接種兩次，而一組保持為不接種的對照。所有的小豬在耳后用3mL PRRSVNVDC-JXA1高度致病性病毒(包含10E5 TCID50)肌內(nèi)攻擊。每日觀察體溫持續(xù)21天。當攻擊后5/5動物發(fā)病發(fā)熱并且至少2/5死亡時，認為攻擊是有效的。對于認為有保護性的疫苗，需要免疫的豬至少有4/5保持健康。 [0222]UBI與中國南京動物保健疫苗公司2011年合作進行的攻擊研究總結報告:
[0223]總共篩查35頭豬為血清陰性的，選擇其中的30頭用于如上述按照由中國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的指南進行本攻擊研究。詳細的動物選擇、隨機化、分組、免疫和攻擊研究、溫度觀察和記錄以及死亡率描述如下:
[0224]選擇來自中國江蘇省無錫農(nóng)場的28日齡的健康小豬。在南京基礎動物保健疫苗公司的疫苗功效/病毒攻擊檢測中心進行該試驗。使用PRRS抗體檢測試劑盒(LSI公司，法國)，lot#:2-VERPRA-001, Exp.2012-01 和 PRRS 抗原檢測試劑盒:PRRS RT-PCR 體外診斷試劑盒(NSP21594-1680變異毒株)來檢測不含PRRSV的動物。使用PRRS強毒毒株(NV⑶-JXA1)進行攻擊檢測，通過制備儲液的10倍稀釋液并且以每只動物3ml施用給動物而進行檢測。
[0225]從該農(nóng)場總共選擇35頭健康小豬用于篩選，并且30頭納入本研究。所有選擇的小豬在血清中檢測為PRRS抗原和抗體陰性。將所有納入研究的小豬隨機分成6組，即，組1-6;每組5只動物。在豬頸部肌肉上直接位于耳后的位點進行肌內(nèi)注射。免疫劑量和分組列在表15中(按照編號進行，從而是客觀的)。
[0226]組I用補充有20重量％的等比例PRRSV內(nèi)源性T輔助細胞表位肽(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于 JXAl 序列)匯集物的基于 PRRSV GP5 肽(GP5B表位簇肽抗原4094系列，SEQ ID No:43)的疫苗免疫。
[0227]對于組2-5，PRRSV GP5肽(GP5B表位簇肽抗原4124，SEQ ID No:42)用作免疫原。疫苗制劑中的最終肽濃度為30ug/mL。該制劑還包括等比例混合的PRRSV內(nèi)源性T輔助細胞表位肽(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于 JXAl 序列)的匯集物，并且對于組2、3和4，分別以10重量％ (即，27.5ug B:2.5ug T匯集物)，20重量％ (即，25ug B:5ug T匯集物)和50重量％ (即，20ug B:1Oug T匯集物)補充PRRSV B表位免疫原(SEQ ID No:42)。組5中的動物接受與組4相同的疫苗制劑，不同之處在于僅給予單次施用。[0228]組6是不用任何肽免疫的陰性對照組。
[0229]關于最初納入研究的所有30頭小豬的抗體篩查結果顯示在表16中。在免疫之前通過RT-PCR檢測所有來自豬的樣品的PRRSV抗原的結果表明30頭中有30頭是陰性的，而檢測試劑盒的陽性對照發(fā)現(xiàn)185堿基對的擴增條帶，這驗證了檢測系統(tǒng)。隨機化后的所有動物編號顯示在表17中。在表18中顯示初次免疫后第O天和第28天的PRRSV抗體OD值的結果。觀察PRRSVJXA1攻擊后的體溫和死亡率，溫度(單位為C)顯示在表19中。
[0230]總之，在病毒攻擊后的最初幾天內(nèi)，對照組(組6)中所有小豬發(fā)病，如表19所示，兩頭死亡(2/5 = 40%的死亡率)，如表20所示。在攻擊研究中沒有接受接種的對照組的結果滿足中國農(nóng)業(yè)部制定的攻擊研究的有效性標準和指南。與對照組相比，組I的動物得到保護，存活率為80% (4/5動物)，死亡率僅為20%。此外，組2-5中所有的動物(20/20)得到保護，因此產(chǎn)生100%的保護作用。
[0231]當組合所有25只接受基于GP5B表位簇肽抗原的疫苗制劑的動物作為一個主要的研究時(即，組1-5)，25只動物中有24只在高度致病性PRRSV病毒毒株JXAl攻擊后存活下來，死亡率僅為4%。與對照組相比，該結果是令人驚訝的，在對照組中，攻擊后所有五頭小豬發(fā)病，導致100 %的發(fā)病率，40 %的豬在早期時日死亡。
[0232]實施例8
[0233]多成分PRRSV肽疫苗誘導針對PRRSV的廣泛保護性的抗體
[0234]PRRSV在病毒體包膜上包含主要糖蛋白GP5，以及其他次要的糖蛋白，即GP2a、GP3和GP4，所有這些是產(chǎn)生感染性病毒體所必需的。發(fā)現(xiàn)在GP4與GP5蛋白之間存在強相互作用，而在其他次要的包 膜糖蛋白(GP2和GP3)與GP5之間也已經(jīng)檢測到弱的相互作用，這導致行程多蛋白復合物。總體而言，推論GP4蛋白對于調(diào)控糖蛋白間相互作用是至關重要的，并且，除GP5之外，還與GP2a —起作為病毒粘附蛋白，其負責調(diào)控與⑶163的相互作用，用于病毒進入易受影響的宿主細胞中。
[0235]由于PRRSV的高度變異性，開發(fā)廣泛有效的PRRSV疫苗需要保護多種病毒毒株。已經(jīng)證實的四種補充有內(nèi)源性PRRSV Th肽(對于匯集物I，為基于JXAl序列的SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，對于匯集物 2，為 SEQ ID Nos:80-90)的基于 GP5的PRRSV疫苗制劑(SEQ ID No:38的GP5B表位肽抗原4020Kc，SEQ ID No:41的肽抗原4052Kb, SEQ ID No:43 的 4094Kb 和 SEQ ID No:42 的 4124Kb)的保護性功效作為 PRRSV 標記疫苗成分的基石，高度理想地在肽混合物中結合代表證實的功能性中和/受體結合位點的抗原肽，以在多蛋白受體復合物中誘導多克隆抗體，從而允許開發(fā)具有寬泛的病毒覆蓋性的有力的多成分PRRSV疫苗。
[0236]使用表現(xiàn)出針對PRRSV的顯著中和特性的GP2、GP3和GP4抗原肽結合抗體⑶，設計在這些選擇區(qū)域周圍的肽抗原，并且如實施例5所示，從每種蛋白中篩選最有力的肽免疫原。這些肽免疫原引入到多種制劑中作為多成分PRRSV肽疫苗，目的在于寬泛的病毒毒株覆蓋性。利用精細的分析LC/MS/MS工具的可用性和充分控制的GMP肽制備方法，可以合理地開發(fā)定制為區(qū)域性應用的(例如，北美vs.歐洲)能繁殖的疫苗制劑。
[0237]實施例9
[0238]UBI DIVA系統(tǒng)和基于表位的標記疫苗用于鑒定感染PRRSV的動物、接種的但不含PRRSV的動物或接種的且感染PRRSV的動物的應用[0239]如實施例1中所示，通過組合兩種來自PRRSV核殼蛋白的抗原肽(4171e，SEQ IDNo:1和4172e，SEQ ID No:2)作為用于平板包被的混合物，然后使用蛋白-HR綴合物作為追蹤劑，建立UBI PRRSV NC ELISA檢測試劑盒，用來檢測感染PRRSV的動物。該測試可以與定制用于監(jiān)測有效的PRRSV標記肽疫苗的免疫原性的基于目標肽的ELISAs聯(lián)合使用，形成PRRSV DIVA系統(tǒng)，用來區(qū)分感染的和接種的動物。
[0240]如在圖5中所示，使用UBI PRRSV NC ELISA監(jiān)測，來自在進入PRRSV疫苗免疫原性研究之前通過之前的篩查已知是PRRSV陰性的正常的小豬(η = 109)的血清表現(xiàn)出高特異性(109-1/109 = 99% )0次于該組，來自已知具有針對GP5的高滴度抗體(如果通過基于目標肽的ELISA所顯示(LoglO滴度> =3))與針對天然PRRSV GP5蛋白的交叉反應性的接受PRRSV GP5標記疫苗制劑的豬的血清(η = 45)通過PRRSV NC ELISA測試評分為陰性，更進一步證明了該檢測的特異性。關于在中間顯示的三個血清組的ELISA讀數(shù)是來自獲自感染的動物的血統(tǒng)IFA陽性血清。這些動物表現(xiàn)出與IFA滴度平行的增加的ELSIA0D450nm讀數(shù)。來自遠右側的血清是從已知具有PRRSV感染的美國農(nóng)場采集的樣品(η =100)。使用UBI PRRSV NC ELISA發(fā)現(xiàn)血清陽性率> 56%，這指示在該農(nóng)場中PRRSV是高度流行的。
[0241]當在已知具有PRRSV感染的臺灣農(nóng)場中，UBI PRRSV NC ELISA和UBI基于PRRSVB表位標記疫苗目標肽的ELISAs聯(lián)合用于監(jiān)測PRRSV標記疫苗制劑的免疫原性時，獲得一些深刻的信息。
[0242]第一，如圖6Α和6Β所示，使用PRRSV NS ELISA發(fā)現(xiàn)所有納入PRRSV疫苗免疫原性研究的豬都是陽性的，s/c比率遠遠高于截點值。由于所有檢測的動物都被感染了，所以，這樣的感染在圖中以灰色背 景突出顯示。第二，盡管在這些小豬中存在高水平的PRRSV NC反應性抗體，主要是母體來源的(MDA)，但是，所有基于肽的PRRSV疫苗制劑表現(xiàn)出顯著的免疫原性，如通過基于各種目標肽的ELISAs所檢測的。如在圖6A和6B中所示，其中監(jiān)測每只動物針對包含在疫苗制劑中的成分肽抗原的肽特異性抗體滴度，所述疫苗制劑在初次免疫后的0、4和6周接受。在所述疫苗制劑(GP2+GP3，GP3，GP3+GP4, GP4或GP5肽抗原)中，每種每劑量總共包含30ug/mL，使用致敏和在O與4周的加強的方案，發(fā)現(xiàn)獨立的且高的免疫原性與幾乎所有來源于PRRSV GP2和GP3中和位點的肽疫苗制劑相關，其次是“僅有GP5肽”的疫苗制劑，GP4中和位點來源的肽抗原在與其他PRRSV (GP3)肽抗原組合時表現(xiàn)出略微削弱的免疫原性。
[0243]基于組合肽的PRRSV疫苗結合在來自GP2，GP3，GP4和GP5蛋白的中和與受體結合位點周圍設計的PRRSV B表位簇肽免疫原(用于誘導中和抗體)，補充有內(nèi)源性PRRSV T輔助細胞肽的混合物(用于促進細胞介導的免疫性)，該疫苗計劃用于PRRSVMD001和JXAl毒株(二者均為北美類型)的攻擊研究。
[0244]實施例10
[0245]采用UBI的基于PRRSV肽的標記疫苗及其診斷性DIVA系統(tǒng)來根除SPF農(nóng)場中的PRRSV感染
[0246]由于用于標記疫苗制劑的PRRSV B表位簇肽抗原不包含來自PRRSV核殼蛋白的抗原肽，而感染的豬典型地在早期發(fā)展針對該主要結構蛋白的抗體，所以，在用于區(qū)分感染的動物與接種的動物的診斷系統(tǒng)中結合PRRSV NC ELISA和基于PRRSV B表位標記疫苗目標肽的ELISAs是合理的，由此形成診斷性DIVA系統(tǒng)。
[0247]UBI的基于PRRSV肽的標記疫苗能夠誘導高滴度的IFA陽性針對PRRSV蛋白上的中和與受體結合位點的交叉反應性抗體。所述標記疫苗制劑能夠比基于MLV或病毒裂解物的PRRSV疫苗更有效地預防PRRSV感染，原因在于這些蛋白當以其目前的生物學疫苗形式存在時的免疫原性性質非常弱。
[0248]UBI的診斷性DIVA系統(tǒng)與其PRRSV標記疫苗的組合應用將在臺灣的SPF農(nóng)場基于下述策略實施，以去除該農(nóng)場長期的PRRSV感染問題。該SPF農(nóng)場一直保持對所有病原體的嚴格的監(jiān)測記錄，并且其僅具有PRRSV感染。該農(nóng)場不能在不招致顯著的生物安全性風險的前提下通過常規(guī)的生物學疫苗根除其當前的PRRSV感染。使用UBI的基于PRRSV肽的標記疫苗由于該疫苗的化學性質將不存在任何此類生物安全性危險。
[0249]在感染PRRSV的SPF農(nóng)場中根除PRRSV的策略
[0250]該農(nóng)場保持使用UBI的基于PRRSV肽的標記疫苗的接種程序至少兩年。使用0、4和8周的接種方案對該農(nóng)場中所有的豬進行接種，并且監(jiān)測至少六個月。通過包括PRRSV NCELISA、IFA和定量PCR(qPCR)的測定與PRRSV病毒血癥水平一起監(jiān)測針對NC和標記疫苗目標肽的血清抗體滴度。在進入接種程序六個月后，由接種的母親生出的小豬將不接受接種，并且通過UBI PRRSV NC監(jiān)測1-3個月，監(jiān)測這些小豬中的感染率。當用UBI PRRSV NCELISA證明所有小豬是陰性反應性的時，可以認為該農(nóng)場處于針對PRRSV感染的控制中。然后該農(nóng)場將淘汰所有之前感染過PRRSV的豬。直到這樣的淘汰之前，該農(nóng)場中所有的豬將持續(xù)用基于PRRSV肽的標記疫苗進行接種。
[0251]該農(nóng)場將持續(xù)用基于PRRSV肽的標記疫苗對所有的豬進行接種，以增強這些豬針對PRRSV的免疫原性。
[0252]當使用PRRSV NC ELISA，基于其血清陰性反應性發(fā)現(xiàn)新繁殖的小豬和大母豬是不含PRRSV的時，可以宣布該農(nóng)場是不含PRRSV的，因此該PRRSV根除計劃成功了。
[0253]用于監(jiān)測的指示劑:
[0254]UBI的PRRSV NC ELISA和基于PRRSV標記疫苗目標肽的ELISAs，由此的DIVA可以用來監(jiān)測農(nóng)場中所有動物的血清的反應性一致性。在接種和監(jiān)測過程中記錄來自PRRSVNC ELISA的陽性率百分數(shù)和平均OD值。
[0255]少于一月齡的小豬可能具有針對PRRSV NC蛋白的母體抗體，因此對PRRSV NCELISA表現(xiàn)為陽性的，其將隨著時間過去而減少。當在環(huán)境中沒有PRRSV傳播時，即，沒有新的感染，這些小豬也將成為不含PRRSV的。該農(nóng)場將加快淘汰感染PRRSV的大母豬。用PRRSV標記肽疫苗處理將進一步減少PRRSV由之前感染的大母豬釋放到環(huán)境中的殘余的危險，因此允許整個農(nóng)場達到不含PRRSV的狀態(tài)。表21設定了對于所述檢測在95%的置信水平檢測一頭PRRSV陽性豬的可能性的樣品大小要求。
[0256]使用DIVA和多成分基于PRRSV肽免疫原的疫苗制劑進行的試驗性PRRSV清除研究
[0257]在常規(guī)感染PRRSV的農(nóng)場中使用基于油包水(ISA50)乳液的包含多成分PRRSV肽免疫原的疫苗制劑進行試驗性PRRSV清除研究，研究通過經(jīng)由DIVA的血清學方式進行監(jiān)測，以評估這些接受了所述多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制劑的動物針對PRRSV NC抗體血清轉陰的潛力。[0258]更具體地，通過PRRSV NC ELISA檢測為陽性的總共15頭四周齡的小豬分成五個實驗組進行研究。所述小豬基于0，4，8周免疫和采血時間計劃進行免疫，并且從初次免疫那天其監(jiān)測為期 13 周的時間。來自 GP5 (SEQ ID No:42)，GP2 (SEQ ID No:44)，GP3 (SEQID No:45)和GP4(SEQ ID No:46)的PRRSV B肽免疫原以各組組.合(例如，對于組I和2，GP5, GP2, GP3和GP4 ;對于組3，GP5, GP3和GP4 ;對于組4，GP3和GP4)等比例混合，對于PRRSV B肽免疫原每劑量共25ug/mL。該制劑進一步補充有20重量％ (即每劑量5ug/mL)的 PRRSV Th 肽(也是以等比例混合的 SEQ ID.Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76)(對于組2)，以及PRRSV Th組合肽(SEQ ID NOs:80-90)(對于組1、2和3)。通過PRRSV NC ELISA監(jiān)測針對NC的血清抗體應答性，從而確定PRRSV感染，而通過相對應的基于PRRSV GP2，GP3，GP4和GP5肽的ELISAs監(jiān)測針對PRRSV標記肽疫苗B表位成分的血清抗體滴度，以確定由各種疫苗制劑提供的免疫原性。組5中的動物不接受基于PRRSV肽的疫苗制劑，并且作為陰性對照組。
[0259]組1-4的所有豬產(chǎn)生了針對其各自的標記疫苗目標PRRSV B GP2，GP3，GP4和GP5肽的抗體，如通過基于各種PRRSV肽的ELISAs所檢測到的，在初次免疫后4周的第二次免疫后，特異性抗體滴度高于3LoglO，并且在所監(jiān)測的整個13周期間保持為高的。然而，針對PRRSV NC蛋白的抗體應答性在初次免疫后約6-8周增加至峰值反應性，然后到初次免疫后10周時下降至基線附近，并且在監(jiān)測期間在初次免疫后13周保持在基線，如表22所示。
[0260]相比之下，來自沒有接受包含基于PRRSV肽的免疫原的疫苗制劑的組5動物的血清均保持與PRRSV NC的高反應性。由于已知在感染的豬種存在針對PRRSV NC蛋白的抗體，在用多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制劑接種的豬中關于PRRSV NC的這樣的血清轉陰的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)進一步驗證了所述多成分的基于PRRSV肽的疫苗制劑的功效。因此，DIVA和多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制劑的應用具有寬泛的應用，并且滿足監(jiān)測、預防、清除和根除PRRSV感 染的緊急需求。
[0261]
【權利要求】
1.豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)疫苗組合物，其包含肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，其中所述肽抗原包含選自由下列各項組成的組的氨基酸序列: a)SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO: 12，及其任意組合； b)(a)的同源物；和 c)(a)或(b)的任意組合。
2.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:9的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID N0:10的氨基酸序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:11的氨基酸序列。
5.根據(jù)權利要求1所 述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:12的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原通過添加或缺失1-5個氨基酸而改變。
7.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其還包含共價連接到所述肽抗原的氨基端或羧基端的T輔助細胞表位。
8.根據(jù)權利要求7所述的PRRS疫苗，其中所述T輔助細胞表位是SEQID NOs:35。
9.根據(jù)權利要求7所述的PRRS疫苗，其中所述T輔助細胞表位通過包含ε賴氨酸殘基的間隔區(qū)共價連接到所述肽抗原。
10.根據(jù)權利要求9所述的PRRS疫苗，其中所述間隔區(qū)是SEQID NO:36。
11.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其還包含不與所述抗原肽連接的T輔助細胞表位，其中所述T輔助細胞表位選自由SEQ ID NOs:47-90組成的組。
12.根據(jù)權利要求1任一項所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原的總量為約10μ g至約Img0
13.根據(jù)權利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述遞送載體和佐劑選自由下列各項組成的組:Montanide ISA 50V,聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯和CpG寡核苷酸。
14.用于保護小豬抵抗PRRS感染的方法，所述方法包括施用權利要求1所述的疫苗。
15.PRRS疫苗組合物，其包含: a)肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，b)包含選自由SEQID Nos:10，11，12，31及其組合組成的組的氨基酸序列的肽抗原，和 c)選自由SEQID NOs:80-90及其組合組成的組的PRRSV Th肽。
16.PRRS疫苗組合物，所述組合物包含: a)肽抗原和獸醫(yī)學可接受的遞送載體或佐劑，b)包含選自由SEQID Nos:42，44，45，46及其組合組成的組的氨基酸序列的肽抗原，和 c)選自由SEQID NOs:80-90及其組合組成的組的PRRSV Th肽。
17.用于診斷PRRS感染的方法，所述方法包括下述步驟:a)將SEQID NO:1與SEQ ID NO:2的混合物連接到固體支持物上， b)將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品，和 c)檢測與連接到所述固體支持物上的所述肽結合的抗體的存在。
18.用于測試抗-PRRSV抗體存在的ELISA免疫測定法，其包括下述步驟: a)將SEQID NO:7與SEQ ID NO:8的混合物連接到固體支持物上， b)將連接到所述固體支持物上的所述肽在有助于抗體與所述肽結合的條件下暴露于包含所述抗體的豬血液、血清或血漿樣品，和 c)檢測與連接到所述支持物上的所述肽結合的抗體的存在。
【文檔編號】A61K39/12GK103648527SQ201180071961
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2011年12月30日 優(yōu)先權日:2011年12月30日
【發(fā)明者】王長怡 申請人:美國聯(lián)合生物醫(yī)學公司