專利名稱：在制備抗毒素、抗血清中去除病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種去除病毒的方法，尤其是一種在制備抗毒素、抗血清制品過程中， 同時去除殘留病毒的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
自2003年以來，國家要求生物行業(yè)要對生物提取產(chǎn)品要進行病毒的滅活/去除。 目前對于人血液制品，國內外較為成熟的病毒滅活/去除方法，主要有物理和化學法兩大類，其中物理法包括加熱、巴氏滅活、光照、納米膜過濾等等，由于多數(shù)蛋白在前三者條件下不穩(wěn)定，所以應避免采用，納米膜過濾技術雖有很好的病毒去除作用，但因使用范圍受限， 僅適用于分子較小(直徑較小)的蛋白，且價格昂貴，因此不實用?；瘜W法主要包括有機溶劑/去污劑(S/D)法、辛酸鈉法、低pH法等等，其中S/D法最早用于人血液制品的病毒滅活，但在室溫下需要6小時才能滅活病毒，不僅對產(chǎn)品收率有影響，而且有機溶劑/去污劑去除較為麻煩；辛酸鈉法是新開發(fā)的病毒滅活方法，具有安全、快速和高效的特點；低PH法僅適用于對酸不敏感的樣品，一般需要較長的滅活時間。對于動物血清來源的抗毒素、抗血清類生物制品，由于其純化過程異常復雜，質量控制較難，因此在以動物血液為原料的抗毒素、抗血清(IgG或F(ab’ ) 2)的生產(chǎn)過程中，設置病毒的去除/滅活是非常重要的，只有這樣才能保證抗毒素、抗血清類生物制品的安全。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、經(jīng)濟適用的，在制備抗毒素、抗血清過程中，同時能徹底去除血漿中殘留病毒的方法。本發(fā)明通過下列技術方案完成一種在制備抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，其特征在于包括下列步驟
A、將免疫血漿稀釋2 4倍體積后，調節(jié)稀釋液pH值至2.8 3. 6 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.1 Ig胃酶，于四 31°C下消化1 3小時，得消化液；
C、按每IOOml消化液加入13 17g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并調節(jié)溶液PH值為4. 8 5. 6，然后將混懸液加溫至57 59 °C后，保持20 40分鐘，再降溫至20 35°C，過濾取上清液；
D、將步驟C的上清液pH值調整至7.0 7. 4，并按每IOOml上清液加入15 25g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置90 180分鐘后，過濾取沉淀物；
E、將步驟D的沉淀物稀釋至蛋白含量低于20g/L，調整稀釋液pH值為7.7 7. 9，并按每IOOml稀釋液加入0. 6 1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置60 120 分鐘后，過濾得上清液；F、將步驟E的上清液，按常規(guī)濃縮后，得到抗毒素、抗血清中間原液；
G、將步驟F的抗毒素、抗血清中間原液的蛋白濃度調至10 100g/L，通過裝填有陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣，之后用磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；
H、將步驟G收集的穿透液按常規(guī)調整效價、蛋白含量、pH值、滲透壓，并按常規(guī)量加入防腐劑后，經(jīng)常規(guī)除菌、過濾，分裝得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。所述步驟A、E的稀釋是用注射用水或者質量濃度為0. 8 1. 0%的氯化鈉溶液進行稀釋的。所述步驟A、C、D、E的pH值調整采用1 4mol/L的HCl或NaOH調整。所述步驟G的上樣時間為1 3小時。所述步驟G的磷酸鹽緩沖液的濃度為10 50mM，pH值為6. 0 8. 0。所述步驟G 的陰離子交換劑，優(yōu)選 Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一種。所述抗血清制品包括破傷風抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。所述步驟F的上清液還可按下列方法處理將上清液通過3 5萬分子量的膜，濃縮體積至五分之一時，在濃縮液中加入20 30mM (毫摩爾)、pH值為6. 0 8. 0、加入量是步驟A的原料血漿體積的2 4倍的PB，進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1. 0 g/L，即得抗毒素、抗血清中間原液。所述步驟H收集的穿透液還可按下列方法處理在穿透液中，加入注射用水調整蛋白含量至<100 g/L，再加入氯化鈉使氯化鈉含量為3.0 6.0 g/L，調節(jié)滲透壓至 260 400 mOsmol/kg，再加入間甲酚使間甲酚含量< 2. 5 g/L，調整pH值至6. 0 7. 0 ；用 0. 22 μ m的除菌過濾器進行澄清除菌過濾，制成抗毒素、抗血清原液，在冷暗處保存至少1 個月，使原液穩(wěn)定后，按常規(guī)用注射用水稀釋后，調整效價、蛋白質濃度、PH值、氯化鈉含量以及滲透壓，用0. 22 μ m的除菌過濾器進行除菌過濾，按《生物制品分裝規(guī)程》進行分裝，得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案，可在制備抗毒素、抗血清制品過程中，同時去除可能存在或污染的病毒，不需要增加額外的工藝步驟，操作簡單，穩(wěn)定性好，不會引入對人體有害的物質，確保制品在臨床應用過程中的安全性，也最大限度地保證了制品的生物活性。經(jīng)檢驗，本發(fā)明去除病毒的方法可分別將樣品中8.5 logs水皰性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus, VSV)和 9. 0 logs 的脊髄灰質炎病毒(Poliovirus, PV-I )降到2. 0 2. 3 logs,下降滴度均大于4 logs,證明去除病毒工藝有效，實用價值高?？苟舅?、抗血清制品的質量，包括蛋白濃度、比活、純度等，較國家標準有了較大提高。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作更詳細的介紹。實施例1
在制備破傷風抗毒素中去除病毒的方法，包括下列步驟
A、將免疫血漿用注射用水稀釋2倍體積后，用2mol/L的HCl調節(jié)稀釋液pH值至2.8 ；
B、在每100ml步驟A的稀釋液中，加入0.Ig胃酶，于下消化3小時，得消化液；
C、按每100ml消化液加入13g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并用anol/L的HCl調節(jié)溶液pH值為4. 8，然后將混懸液加溫至57°C后，保持20分鐘， 再降溫至20°C，過濾取上清液；
D、用2mol/L的NaOH，將步驟C的上清液pH值調整至7.0，并按每IOOml上清液加入 15g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置90分鐘后，過濾取沉淀物；
E、將步驟D的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用2mol/L的NaOH調整稀釋液PH值為7. 7，并按每IOOml稀釋液加入0. 6g明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置120分鐘后，過濾得上清液；
F、將步驟E的上清液按下列方法處理將上清液通過3萬分子的膜，濃縮體積至五分之一時，在濃縮液中加入20mM (毫摩爾)、pH值為6. 0、加入量是步驟A的原料血漿體積的4倍的PB，進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1. Og/L,即得破傷風抗毒素中間原液。G、將步驟F的破傷風抗毒素中間原液的蛋白濃度調至40g/L，通過裝填有DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣1小時，之后用濃度為10mM，pH 值為6. 0的磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；
H、在步驟G收集的穿透液按下列方法處理在穿透液中，加入注射用水調整蛋白含量至40 g/L，再加入氯化鈉使氯化鈉含量為3.0 g/L，調節(jié)滲透壓為沈0 mOsmol/kg，再加入間甲酚使間甲酚含量為2.0 g/L，用2mol/L的NaOH調整pH值至6. 0 ；用0. 22 μ m的除菌過濾器進行澄清除菌過濾，制成破傷風抗毒素原液，在冷暗處保存至少1個月，使原液穩(wěn)定后，按常規(guī)用注射用水稀釋后，調整效價、蛋白質濃度、PH值、氯化鈉含量以及滲透壓，用 0. 22 μ m的除菌過濾器進行除菌過濾，按《生物制品分裝規(guī)程》進行分裝，得去除病毒的破傷風抗毒素制品。實施例2
在制備抗狂犬病血清中去除病毒的方法，包括下列步驟
A、將免疫血漿用注射用水稀釋4倍后，用2mol/L的HCl調節(jié)稀釋液pH值至3.6 ；
B、在每100ml步驟A的稀釋液中，加入Ig胃酶，于31°C下消化1小時，得消化液；
C、按每100ml消化液加入17g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并用2mol/L的NaOH調節(jié)溶液pH值為5. 6，然后將混懸液加溫至59°C后，保持30分鐘，再降溫至35°C，過濾取上清液；
D、用2mol/L的NaOH，將步驟C的上清液pH值調整至7.4，并按每100ml上清液加入 25g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置180分鐘后，過濾取沉淀物；
E、將步驟D的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用2mol/L的NaOH調整稀釋液PH值為7. 9，并按每100ml稀釋液加入1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置60分鐘后，過濾得上清液；
F、將步驟E的上清液按下列方法處理即將上清液通過5萬分子量的膜，濃縮體積至五分之一時，在濃縮液中加入30mM(毫摩爾)、pH值為8. 0的PB，進行置換、濃縮至硫酸銨含量低于0. lg/ml, PB的加入量是步驟A的原料血漿體積的2倍，即得抗狂犬病血清中間原液；
G、將步驟F的抗狂犬病血清中間原液的蛋白濃度調至100g/L，通過裝填有DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣3小時，之后用濃度為50mM，pH 值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；
H、將步驟G收集的穿透液按下列方法處理在穿透液中，加入注射用水調整蛋白含量
5至60 g/L，再加入氯化鈉使氯化鈉含量為6.0 g/L，調節(jié)滲透壓為400 mOsmol/kg，再加入間甲酚使間甲酚含量為2. 2 g/L,用2mol/L的NaOH調整pH值至7. 0 ；用0. 22 μ m的除菌過濾器進行澄清除菌過濾，制成抗狂犬病血清原液，在冷暗處保存至少1個月，使原液穩(wěn)定后，按常規(guī)用注射用水稀釋后，調整效價、蛋白質濃度、PH值、氯化鈉含量以及滲透壓，用 0. 22 μ m的除菌過濾器進行除菌過濾，按《生物制品分裝規(guī)程》進行分裝，得去除病毒的抗狂犬病血清制品。實施例3
在制備抗狂犬病血清中去除病毒的方法，包括下列步驟
A、將免疫血漿用注射用水稀釋3倍后，用質量濃度為1.0%的氯化鈉溶液調節(jié)稀釋液pH 值至3. 2 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.5g胃酶，于30°C下消化2小時，得消化液；
C、按每IOOml消化液加入15g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并用質量濃度為1. 0%的氯化鈉溶液調節(jié)溶液pH值為5. 2，然后將混懸液加溫至58°C 后，保持25分鐘，再降溫至30°C，過濾取上清液；
D、用質量濃度為1.0%的氯化鈉溶液，將步驟C的上清液pH值調整至7. 2，并按每IOOml 上清液加入20g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置150分鐘后，過濾取沉淀物；
E、將步驟D的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用質量濃度為1.0%的氯化鈉溶液調整稀釋液PH值為7. 8，并按每IOOml稀釋液加入0. Sg明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置90分鐘后，過濾得上清液；
F、將步驟E的上清液按下列方法處理即將上清液通過5萬分子的膜，濃縮體積至五分之一時，在濃縮液中加入30mM(毫摩爾)、pH值為7. 0的PB，進行置換、濃縮至硫酸銨含量低于0. lg/ml, PB的加入量是步驟A的原料血漿體積的3倍，即得抗狂犬病血清中間原液；
G、將步驟F的抗狂犬病血清中間原液的蛋白濃度調至100g/L，通過裝填有DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣3小時，之后用濃度為30mM，pH 值為7. 0的磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；
H、將步驟G收集的穿透液按下列方法處理在穿透液中，加入注射用水調整蛋白含量至60 g/L，再加入氯化鈉使氯化鈉含量為4. 5 g/L，調節(jié)滲透壓為300 mOsmol/kg，再加入間甲酚使間甲酚含量為2. 0 g/L，用質量濃度為1. 0%的氯化鈉溶液調整pH值至6. 5 ；用 0. 22 μ m的除菌過濾器進行澄清除菌過濾，制成抗狂犬病血清原液，在冷暗處保存至少1個月，使原液穩(wěn)定后，按常規(guī)用注射用水稀釋后，調整效價、蛋白質濃度、PH值、氯化鈉含量以及滲透壓，用0. 22 μ m的除菌過濾器進行除菌過濾，按《生物制品分裝規(guī)程》進行分裝，得去除病毒的抗狂犬病血清制品。實施例4
在制備抗蛇毒血清中去除病毒的方法，包括下列步驟
A、將免疫血漿用注射用水稀釋3倍后，用質量濃度為0.8%的氯化鈉溶液調節(jié)稀釋液pH 值至3. 4 ；
B、在每100ml步驟A的稀釋液中，加入0.3g胃酶，于下消化3小時，得消化液；
C、按每100ml消化液加入13g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并用質量濃度為0. 8%的氯化鈉溶液調節(jié)溶液pH值為5. 0，然后將混懸液加溫至57°C 后，保持35分鐘，再降溫至，過濾取上清液；
D、用質量濃度為0.8%的氯化鈉溶液，將步驟C的上清液pH值調整至7. 0，并按每IOOml 上清液加入18g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置90分鐘后，過濾取沉淀物；
E、將步驟D的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用質量濃度為0.8%的氯化鈉溶液調整稀釋液PH值為7. 7，并按每IOOml稀釋液加入0. 6g明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置60分鐘后，過濾得上清液；
F、將步驟E的上清液，按常規(guī)濃縮后，得到抗蛇毒血清中間原液；
G、將步驟F的抗蛇毒血清中間原液的蛋白濃度調至80g/L，通過裝填有QSepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣2小時，之后用濃度為30mM，pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；
H、將步驟G收集的穿透液按常規(guī)調整效價、蛋白含量、pH值、滲透壓，并按常規(guī)量加入防腐劑后，經(jīng)常規(guī)除菌、過濾，分裝得去除病毒的抗蛇毒血清制品。下面是利用本發(fā)明的方法進行病毒去除以及對去除效果的檢測實例，去除效果的檢測依據(jù)為國藥監(jiān)注[2002]第160號文，驗證實驗由本公司與武漢大學一中國典型培養(yǎng)物保藏中心完成。1.各取三批破傷風免疫血漿(蛋白濃度50 80g/L)，分別加入水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV，滴度為8. 0 TCID50/ml)和脊髄灰質炎病毒 (Poliovirus，PV-1，滴度為:9.0 TCID50/ml)為指示病毒，混勻；
2.將上述含有指示病毒的破傷風免疫血漿，照本發(fā)明實施例1的方法進行破傷風抗毒素的制備，同時進行去除病毒驗證；
3.取樣進行病毒滴度檢測；
4.同時留存部分病毒作對照；
5.病毒檢測
采用96孔培養(yǎng)板微量法培養(yǎng)4天觀察，用Karber法計算病毒滴度，以評估去除/滅活病毒效率。病毒去除驗證方案設未處理的含病毒陽性對照、系統(tǒng)空白對照(含病毒)。驗證結果見表1、表2。滴度計量單位TCID50/ml。結論本去除病毒工藝可分別將樣品中8.5 logs水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和 9· 0 logs 的脊髄灰質炎病毒(Poliovirus，PV-1 )降到 2.0 2. 3 logs，且重復三次檢測數(shù)據(jù)相近，證明去除病毒方法有效。
表1.去除VSV病毒結果
權利要求
1.一種在制備抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，其特征在于包括下列步驟A、將免疫血漿稀釋2 4倍體積后，調節(jié)稀釋液pH值至2.8 3. 6 ；B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.1 Ig胃酶，于四 31°C下消化1 3小時，得消化液；C、按每IOOml消化液加入13 17g硫酸銨的量，在步驟B的消化液中，加入硫酸銨至形成混懸液，并調節(jié)溶液PH值為4. 8 5. 6，然后將混懸液加溫至57 59 °C后，保持20 40分鐘，再降溫至20 35°C，過濾取上清液；D、將步驟C的上清液pH值調整至7.0 7. 4，并按每IOOml上清液加入15 25g硫酸銨的量，在上清液中加入硫酸銨進行沉淀，靜置90 180分鐘后，過濾取沉淀物；E、將步驟D的沉淀物稀釋至蛋白含量低于20g/L，調整稀釋液pH值為7.7 7. 9，并按每IOOml稀釋液加入0. 6 1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬進行沉淀，靜置60 120 分鐘后，過濾得上清液；F、將步驟E的上清液，按常規(guī)濃縮后，得到抗毒素、抗血清中間原液；G、將步驟F的抗毒素、抗血清中間原液的蛋白濃度調至10 100g/L，通過裝填有陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣，之后用磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液；H、將步驟G收集的穿透液按常規(guī)調整效價、蛋白含量、pH值、滲透壓，并按常規(guī)量加入防腐劑后，經(jīng)常規(guī)除菌、過濾，分裝得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A、E的稀釋是用注射用水或者質量濃度為0. 8 1. 0%的氯化鈉溶液進行稀釋的。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A、C、D、E的pH值調整采用1 4mol/L 的 HCl 或 NaOH 調整。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟G的磷酸鹽緩沖液的濃度為10 50mM, pH 值為 6. 0 8. 0。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟G的上樣時間為1 3小時，陰離子交換劑為 Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一禾中。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟F的上清液按下列方法處理將上清液通過3 5萬分子量的膜，濃縮體積至五分之一時，在濃縮液中加入20 30mM、pH值為6. 0 8. 0、加入量是步驟A的原料血漿體積的2 4倍的PB，進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1.0 g/L，即得抗毒素、抗血清中間原液。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟H收集的穿透液按下列方法處理在穿透液中，加入注射用水調整蛋白含量至< 100 g/L，再加入氯化鈉使氯化鈉含量為 3.0 6.0 g/L，調節(jié)滲透壓至260 400 mOsmol/kg，再加入間甲酚使間甲酚含量< 2. 5 g/ L，調整pH值至6. 0 7. 0 ；用0. 22 μ m的除菌過濾器進行澄清除菌過濾，制成抗毒素、抗血清原液，在冷暗處保存至少1個月，使原液穩(wěn)定后，按常規(guī)用注射用水稀釋后，調整效價、蛋白質濃度、PH值、氯化鈉含量以及滲透壓，用0. 22 μ m的除菌過濾器進行除菌過濾，分裝，得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在制備抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，它將免疫血漿稀釋并調節(jié)pH值后，經(jīng)胃酶消化、加溫變性、明礬吸附、超濾濃縮/脫鹽、離子交換層析得收集液，經(jīng)除菌過濾后，分裝得抗毒素、抗血清制品。這樣即可在制備抗毒素、抗血清過程中，同時除去原料血漿中可能存在的病毒。本發(fā)明所提供的抗毒素、抗血清的病毒去除方法具有簡單、快速、經(jīng)濟適用的特點，在生產(chǎn)過程中能徹底去除原料血漿中可能存在的病毒，保證產(chǎn)品的質量。
文檔編號A61K35/16GK102512449SQ201210004549
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權日2012年1月9日
發(fā)明者吳笛, 楊冬, 羅靖雄 申請人:玉溪九洲生物技術有限責任公司