專利名稱：一種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑菌避孕材料，具體涉及ー種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料。
背景技術(shù)：
子宮頸炎anflammation of Cervix)是女性生殖系統(tǒng)最為常見的炎癥性疾病， 以細(xì)菌性陰道病原體感染為主要原因，其致病菌主要是淋病雙球菌、金黃葡萄球菌以及溶血性鏈球菌，其中淋球菌更是黏液膿性宮頸炎的主要病原體(Sarabeth B, Jennifer L, Devon j, et al. Cervicitis in Adolescents: Do We Know Correct Diagnosis ana Treatment Guidelines Journal of Pediatric and Adolescent Gynecology, 2010； 23(2) : 67)，此外與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染也密切相關(guān)(Harald zur Hausen. HPV Today [Z/0L]. Newsletter on Human Papillomavirus. 2009)，已知 90% 以上宮頸癌患者伴有高危型 HPV 感染(LE J. Gynecology and Obstetrics. 7th ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2008)。該病在已婚或有性生活的婦女中發(fā)病率高達(dá)50%以上，是宮頸癌發(fā)病的高危因素之一(杜小麗.復(fù)方莪術(shù)油栓治療慢性宮頸炎.醫(yī)藥論壇雜志，2008; 29(15) 81-82)。目前，宮頸炎的治療主要有4種方法物理治療、藥物治療、免疫治療和手術(shù)治療， 其中藥物治療最為常用。重組人干擾素α加具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能， 已批準(zhǔn)適用于治療陰道病毒性感染引起的慢性宮頸炎(陳萍.奧平栓治療慢性宮頸炎42 例療效觀察.中國(guó)醫(yī)療前沿，2010; 5(4): 35; 47)、宮頸糜爛(丁書貴.奧平栓治療宮頸糜爛療效觀察.中原醫(yī)刊，2007; 34(18): 61-62)、陰道炎(胡東，王琛.奧平栓治療慢性宮頸炎陰道炎65例療效觀察.實(shí)用醫(yī)技雜志，2007; 14(30): 4161)，預(yù)防宮頸癌，有效率為90%以上(王燕嬌，莫秀瑛.慢性宮頸炎的治療研究進(jìn)展.中國(guó)醫(yī)藥指南. 2011; 9(6): 50-51)。將抗病毒藥物以外用的方式應(yīng)用于婦科，無(wú)耐藥性，使用方便，無(wú)明顯副反應(yīng)，是近年藥物治療慢性宮頸炎比較滿意的藥物(羅賽群.微波聯(lián)合重組人干擾素 α-2a治療慢性宮頸炎臨床療效觀察.中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健.2010; 24(1): 91_92)。宮頸炎病患者通常不同程度地減少性生活，使用避孕套可以降低宮頸和外陰陰道 HPV 感染的風(fēng)險(xiǎn)(Winer R. L, Hughes J. P, Feng Q, et al. Condom use and the risk of genital human papillompirus infection in young women. New Engl, MED, 2006； 354(25):沈45.)。而一般安全套作用僅限于避孕，不能針對(duì)性地抑菌，所以一種有效的抑菌避孕套材料的研制尤為重要。關(guān)于避孕套材料方面的研究報(bào)道不多，目前報(bào)道的用于避孕套的材料有乳膠、聚氨酷、合成橡膠，能用于避孕套的材料很少，這與成熟的橡膠エ業(yè)和高速發(fā)展的高分子材料形成了鮮明的對(duì)比(陳國(guó)軍.避孕套材料的研究進(jìn)展.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志.2009; (3): 190-192)。自19世紀(jì)后期，第一種乳膠材料被開發(fā)出來(lái)，用其生產(chǎn)的安全套，比橡膠膜薄且軟，而到了上世紀(jì)三十年代，安全套的制造技術(shù)再次革新，液態(tài)乳膠取代了傳統(tǒng)的橡膠片，直到今天仍是安全套的基礎(chǔ)原料。乳膠(Latex)主要成分為聚異戊ニ烯，含量在90%以上， 它的結(jié)構(gòu)式(CH2=C-CH=CH2)n,分子量在1(Γ180萬(wàn)(陳國(guó)軍.避孕套材料的研究進(jìn)展.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志.2009; (3): 190-192)。上海名邦橡膠制品有限公司生產(chǎn)的乳膠安全套目前是全國(guó)銷量第一，性價(jià)比僅次于日本。該公司欲與本實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)ー種新型的抗菌乳膠避孕材料，滿足國(guó)民需要，提高我國(guó)行業(yè)品牌、提高在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力、利于擴(kuò)大出口貿(mào)易、利于調(diào)整經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)。含藥物的避孕套在潤(rùn)滑劑中加入藥物成分，用于避孕目的和防止性傳播疾病 (王昕，施燕平，朱雪濤，等.具藥天然膠乳橡膠避孕套的細(xì)胞毒性試驗(yàn).齊魯藥事，2005; (11): 677-678)。上世紀(jì)九十年代，ー種新型的聚氨酯材料由于具有強(qiáng)度高、 導(dǎo)熱性好、耐老化性好、舒適性好、不致敏性好等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注。2006年，我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了ー種納米級(jí)抗菌抗病毒聚氨酯避孕套(關(guān)燕清，彭長(zhǎng)連，李岳川.一種納米級(jí)抗菌抗病毒避孕套.中國(guó)200610036660，
公開日2007年2月觀日)。該發(fā)明通過光化學(xué)固定技術(shù)將干擾素α接枝在材料上，這比將干擾素直接涂抹在材料上具有更好的殺菌效果，顯示出3倍的抑菌活性，從而賦予避孕套這一重要的節(jié)育工具更多的功能，甚至協(xié)助治療婦科炎癥。盡管聚氨酯材料的拉伸強(qiáng)度是橡膠膜的兩倍，但經(jīng)過測(cè)試，OST實(shí)驗(yàn)室報(bào)告及相關(guān)研究結(jié)果表明，其滑脫和破裂的比率，細(xì)菌透過率，避孕和性病屏蔽作用都與橡膠避孕套相似，且成本較高，主要用于女用避孕套(唐文豪，谷翊群，陳振文.男性節(jié)育方法研究回顧與展望.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志.2002; 10(5): 312-314 ；Nicholas D. W, David Μ. H， Stefien B. Male condoms that break in use do so mostly oy a “blunt puncture，，mechanism. Contraception. 2008； 77(5): 360-365 ；Mags B，Jenni S， Zonke M， et al. Performance of the Reality polyurethane female condom and a synthetic latex prototype: a randomized crossover trial among South African women. Contraception. 2006; 73 (4) : 386-393)。由于上述這些原因，它在市場(chǎng)上的份額不大，所以目前國(guó)內(nèi)仍普遍使用橡膠材料。早在上世紀(jì)90 年代初，由 Matsuda 等人(Sugawara Tj Matsuda T. 1994; Matsuda Tj Sugawara T. 1995 a ； Sugawara Tj Matsuda T. 1995 b ； Matsuda Tj Sugawara T. 1996)為代表的幾個(gè)研究小組首先提出光化學(xué)固定法，該法是所有的用于生物醫(yī)用高分子材料表面改性的方法中，生物相容性最理想、通用性最強(qiáng)、最簡(jiǎn)單實(shí)用的ー種新方法。這種光化學(xué)固定方法及其固定的新的生物材料已經(jīng)成為生物材料學(xué)家所關(guān)注和研究的焦點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，是由IFN-α接枝固定到乳膠避孕材料表面形成。上述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，是采用光化學(xué)固定法將IFN-α接枝固定到乳膠避孕材料表面上。CN 102532579 A光化學(xué)固定法是指利用紫外或可見光QOO-SOOnm)將具有特定功能的分子或組分偶聯(lián)到材料表面的方法，其原理是利用帶有雙官能團(tuán)(一般來(lái)說，其ー為熱活性基團(tuán)，另 ー為光活性基團(tuán))的光偶聯(lián)劑將生物活性化合物分子偶聯(lián)到材料表面來(lái)達(dá)到改性表面的目的。目前，光化學(xué)固定化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)可對(duì)有益的各種生物大分子表面進(jìn)行固定化修飾，并接枝在生物相容性材料的表面，由于獨(dú)立的有機(jī)官能團(tuán)的存在， 從而可以大大提高生物大分子的活性。光活性IFN-α通過疊氮基斷裂將IFN-α連接到(4_疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的熱活性基團(tuán)上，芳香疊氮基團(tuán)經(jīng)過UV輻射激發(fā)，發(fā)生不可逆光分解，疊氮基分解為氮?dú)夂突钚阅芰繕O高的氮烯中間物，這種中間物將高分子中碳?xì)滏I打開，氮和碳發(fā)生親核反應(yīng)，并奪去的氫與碳原子形成仲胺，結(jié)果使目的分子(IFN-α)以共價(jià)鍵接到高分子材料 (乳膠)表面上，如圖1。上述光化學(xué)固定法的具體步驟如下將IFN- α加入到含有琥珀亞酰胺的ニ甲基酰胺溶液中，在4°C攪拌反應(yīng)48h，合成光活性IFN-α，將光活性IFN-α涂抹在乳膠避孕材料表面，避光冷凍干燥后，進(jìn)行紫外照射。紫外照射時(shí)間優(yōu)選20min，最好在距離15W紫外燈下2cm處進(jìn)行照射。上述制備方法中，還包括合成光活性IFN-α進(jìn)行離心純化的步驟，具體為采用超過濾膜(超濾離心管<Milipore Molecut II，10KNa>)，在4000 rpm轉(zhuǎn)速下間斷離心，以使合成的光活性IFN-α純度更高。本發(fā)明的接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，具有較高的抑菌性能，除可以作為避孕套等避孕材料外，還可以制作成其他婦科用品如改良節(jié)育環(huán)、子宮帽等等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
聚氨酯材料只能適合女性避孕工具的設(shè)計(jì)，在使用上受限，目前使用最廣泛的仍然是乳膠避孕套，市場(chǎng)上份額很大，因此對(duì)其性能改進(jìn)具有重要意義。本發(fā)明針對(duì)更廣大的男性避孕工具使用群體，設(shè)計(jì)了接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，IFN-α顆粒為納米級(jí)，均勻地排列在乳膠薄膜上，結(jié)果顯示其抑菌效果明顯優(yōu)于直接涂抹IFN-α的乳膠材料，賦予避孕套這一重要的節(jié)育工具更多的功能，甚至協(xié)助治療婦科炎癥。而接枝IFN-a 的乳膠材料不僅可以作為避孕材料，還可以制作成為其他婦科用品，可以預(yù)見新型保健避孕材料可以配合傳統(tǒng)藥物共同預(yù)防甚至治療宮頸炎。本發(fā)明在乳膠生物材料的制備和表征過程中，分別進(jìn)行了紫外、熒光光譜和紅外光譜的分析，數(shù)據(jù)十分系統(tǒng)和嚴(yán)謹(jǐn)，在材料表面的分析中，用原子力顯微鏡代替共聚焦顯微鏡(ニ維)進(jìn)行材料表面的三維觀察，對(duì)材料的表面特征描述顧問為充分和詳實(shí)。在本發(fā)明的抗菌實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，沒有采用直接把生物材料(表面涂覆細(xì)菌)放在培養(yǎng)基里面培養(yǎng)的方式，而是采用改善后的間接培養(yǎng)方式，這樣便于更清楚地觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，從實(shí)施例可以看出，用生物材料攜帯細(xì)菌到一個(gè)新的培養(yǎng)基中后，在新的培養(yǎng)基里面15 小時(shí)表現(xiàn)不明顯，24小時(shí)后空白材料和游離藥物材料表面都重新長(zhǎng)滿了細(xì)菌，而接枝干擾素的乳膠材料表面可以看到清晰干凈的表面，沒有細(xì)菌生長(zhǎng)，因此本發(fā)明的避孕材料具有更強(qiáng)的抑菌效果，能夠得到更廣泛的應(yīng)用。


圖1.光化學(xué)固定法制備接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料原理圖，其中A 為光活性IFN-α合成，B為接枝IFN-α的乳膠合成，C為實(shí)驗(yàn)過程流程圖。圖2.光活性IFN-α的紅外光譜、紫外位移和熒光位移圖。圖3.場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下的無(wú)接枝的乳膠(A)以及接枝干擾素α的乳膠(B)表面形態(tài)的電鏡圖。圖4.掃描探針顯微鏡下的乳膠(A)和接枝干擾素α的乳膠(B)表面形態(tài)圖 (IOymXlOym)。圖5.接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料抑菌試驗(yàn)流程圖。圖6.培養(yǎng)1 及24h后，無(wú)接枝乳膠、涂抹游離IFN-α的乳膠、接枝各種濃度的乳膠表面淋球菌粘附情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式試劑及材料
奧平栓(干擾素_a2a)購(gòu)自廣州寶芝林大藥房(武漢維奧制藥有限公司)；二甲基甲酰胺(DMF)，#-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺購(gòu)自Sigma公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購(gòu)自威佳生物工程公司(AMRESC0公司產(chǎn)品)。M孔組織培養(yǎng)板(BI0FIL公司產(chǎn)品)。乳膠橡膠避孕套由上海名流公司提供。淋病雙球菌(標(biāo)準(zhǔn)株)由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科實(shí)驗(yàn)室提供；TM培養(yǎng)基購(gòu)自江門凱林貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器
78-1磁力攪拌器；HY-5調(diào)速多用振蕩器；超速冷凍離心機(jī)(Mikro22R)；德國(guó)Bruker EQUINOX 55傅里葉變換紅外光譜-紅外顯微鏡聯(lián)用儀；SHIMADZU CORPORATION紫外光譜儀 (島津UVM50)；德國(guó) PerkinElmer 熒光光譜儀(LS55)；美國(guó)(Bioscope Catalyst, Veeco) 原子力顯微鏡；日本電子株式會(huì)社JSM-6330F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；HV85高壓滅菌鍋； 無(wú)菌操作臺(tái)(AIRTECH BHC-1300)；美國(guó)THERMO公司微生物CO2培養(yǎng)箱。實(shí)施例1接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備 1.光活性IFN-α的制備與檢測(cè)
將 IFN- α (30 μ g, 0. 002 μ mol)加入 5ml 含有琥珀亞酰胺 04 μ g, 0. 14 μ mol)的ニ甲基酰胺DMF/PBS(pH=7.4，體積比為4:1)溶液中，在4°C的條件下(冰浴)攪拌反應(yīng)48h。合成結(jié)束后，用超過濾膜(MiliporeMolecut II，IOk Na)，在4000rpm 的轉(zhuǎn)速下，間斷離心4h純化疊氮苯基衍生的IFN-α，加入PBS(-)溶液溶解，并調(diào)整至若干濃度，冷凍保存?zhèn)溆谩Ｓ捎诏B氮基具有光吸收特征峰，所以我們對(duì)樣品作IR、UV和XPF分折。IR/UV/XPF 光譜圖由 Origin Pro 7· 5 進(jìn)行繪圖分析，F(xiàn)ESEM 圖片由 Image pro plus 6. 0 WifyMfi, AFM (Bioscope Catalyst, Veeco, USA) Nanoscope Analysis $a 件進(jìn)行分析。IFN-α的紅外光譜圖(FT-IR)、紫外光譜圖(UV)和熒光光譜圖(XPF)見圖2。 IFN-α分子量約為1.9 X IO4左右，有不同亞型，由166/165個(gè)氨基酸組成，無(wú)糖基。IFN-α 分子的自由氨基可以和疊氮基對(duì)位芳香環(huán)上的活化羧酸基發(fā)生反應(yīng)，脫去一分子水形成酰胺鍵。芳香疊氮化合物和賴氨酸的反應(yīng)活性比其他氨基酸的反應(yīng)活性高，所以可以估計(jì)酰胺鍵可能發(fā)生在賴氨酸的氨基上。圖2 (a, b, c)分別為光合成反應(yīng)前和反應(yīng)后的IFN-α的紅外光譜圖，查閱《分折化學(xué)手冊(cè)》(Dean J. Α.分析化學(xué)手冊(cè).科學(xué)出版社，2003)及文獻(xiàn)(Abhi jit V. J， Chris G. G, Anna D. G. synthesis and properties of poly、aniiine-co_azidoaniline)· European Polymer Journal, 2007; 43(6): 2594ヮ603)，可見在2139CHT1 出現(xiàn)了疊氮基的紅外特征吸收峰，這表明IFN-α已經(jīng)被疊氮基修飾。圖2(d，e, f)分別為光合成反應(yīng)前和反應(yīng)后的IFN-α以及疊氮苯甲酸的紫外光譜圖，可知疊氮苯甲酸在271nm左右出現(xiàn)了疊氮基的紫外特征吸收峰，IFN-α在 210nm處有吸收峰，而光活性IFN-α的吸收峰移動(dòng)至221nm，有人認(rèn)為這種紫外位移可能是由于酰胺鍵的形成改變了疊氮基中3個(gè)N的排列結(jié)構(gòu)(Abhijit V. J, Chris G. G, Anna D. G. synthesis and properties of poly (aniline-co-azidoanilineハ European Polymer Journal, 2007; 43(6) : 2594-2603 ；Kang IK, Kim G. J, Kwon OH, et al. Co-culture of hepatocytes and fibroblasts by micropatterned immobilization of beta-galactose derivatives. Biomaterials 2004; 25(18) : 4225—4232)，這表明 IFN-α已經(jīng)被疊氮基修飾。圖2(g，h, i)分別為光合成反應(yīng)前和反應(yīng)后的IFN-α以及疊氮苯甲酸的熒光光譜圖，利用熒光光譜儀分析得知，在341nm激發(fā)光下，疊氮苯甲酸的熒光吸收峰在400nm 處，IFN-α的熒光吸收峰出現(xiàn)在440nm左右，而光活性IFN-α的熒光吸收峰遷移至386nm 左右。對(duì)于這種熒光位移，有人認(rèn)為這是由于微環(huán)境中的IFN-α使得疊氮基發(fā)生共軛改變 (Kang IK, Kim G. J, Kwon OH, et al. しo—culture οι hepatocytes and fibroblasts by micropatterned immobilization of beta-galactose derivatives. Biomaterials 2004; 25(18) : 4225-4232)。這再一次表明IFN-α已經(jīng)被疊氮基修飾。FT-IR、UV、XPF檢測(cè)證明光活性IFN- α合成成功。2.光固定化乳膠材料的制備
將乳膠避孕套剪成直徑為IOmm的若干圓形片狀，放置于M孔組織培養(yǎng)板，之后作以下處理分別將光活性IFN- α以5種濃度(0. 01 μ g/mL, 0. 025 μ g/mL, 0. 05 μ g/mL, 0. 075yg/mL, 0. 1 μ g/mL)加入M孔組織培養(yǎng)板中，置于4°C冰箱中避光冷凍干燥后，在紫外燈(15W)下2cm處照射20min，利用疊氮基十分活潑的特性，將光活性IFN-α固定到乳膠材料上。光固定化后，用PBS(-)溶液(pH7.4)反復(fù)洗滌5次。3.光固定化乳膠材料上的IFN-a的形態(tài)表征(FESEM/AFM)
光固定化乳膠材料經(jīng)過低溫干燥噴金后，轉(zhuǎn)移到場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)下觀察IFN-a在乳膠材料表面形態(tài)和分布，并計(jì)算參數(shù)。用蒸餾水反復(fù)洗滌制備好的光固定化IFN- α乳膠材料5次后，置于4°C冰箱冷凍干燥后，轉(zhuǎn)移到原子力顯微鏡(AFM)下觀察 IFN-a在乳膠材料表面形態(tài)及蛋白質(zhì)大小和高度。無(wú)接枝的乳膠㈧以及接枝干擾素α的乳膠表面形態(tài)見圖3，圖3的A，B分別為場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察到的無(wú)接枝的乳膠和接枝IFN-a后的乳膠表面形態(tài)?？梢钥吹?，無(wú)接枝的乳膠表面光滑無(wú)物，而經(jīng)過接枝固定后的可以看到IFN-a在乳膠表面形成ー層分布均勻有序的蛋白質(zhì)層。使用Image pro plus 6. 0對(duì)電鏡圖片進(jìn)行分析。計(jì)算機(jī)對(duì)圖中的60686個(gè)對(duì)象進(jìn)行了掃描分析，符合IFN的典型顆粒有30515個(gè)，顆粒直徑介于223nm與998nm，平均直徑為572nm。一個(gè)視野內(nèi)的單個(gè)分子顆粒數(shù)大約為51535個(gè)，顆粒團(tuán)聚有9531處。而圖3A的無(wú)接枝乳膠表面非常光滑，表面原子數(shù)的增加導(dǎo)致了乳膠性質(zhì)的急劇變化，這種表面原子數(shù)隨納米粒子尺寸減小而急劇增大后引起的性質(zhì)稱為表面效應(yīng)(Swarup K. M, Nillohit M, Anup M, et al. synthesis and cnaracterization of nanocrystal1 me zinc sulfide via zinc thiobenzoate—lutiaine single-source precursor. Inorganica Chimica Acta, 2011; 371(1): 20-26)。我們認(rèn)為接枝IFN- α乳膠是納米級(jí)生物活性材料，將干擾素顆粒分散至納米級(jí)別，使表面原子數(shù)迅速増加，比表面積、表面積及表面結(jié)合能迅速増大。從化學(xué)角度來(lái)看，表面原子數(shù)的増加、原子配位的不足還有表面原子所處的鍵合狀態(tài)或鍵合環(huán)境與原來(lái)的干擾素分子和乳膠分子有很大的差異，常常處于不飽和狀態(tài)，導(dǎo)致納米材料具有極高的表面活性，很容易與其它原子結(jié)合，具備游離純干擾素所不具備的ー些其他特性，比如能夠在一定條件下光分解仲胺鍵逐步釋放干擾素。納米顆粒表現(xiàn)出來(lái)的高催化活性和高反應(yīng)性，納米粒子易于團(tuán)聚等均與此有關(guān)。圖4顯示了乳膠表面(A)和接枝IFN-α的乳膠表面(B)的原子力顯微圖像，掃描范圍為10 μ mX 10 μ m，粗糙度分別為53. 3 nm(A)和71. 3 nm(B)。接枝IFN-α的乳膠表面上IFN-α顆粒直徑介于200nm與lOOOnm，平均直徑約為600nm。與電鏡結(jié)果基本吻合， 證明IFN-α成功接枝在乳膠表面。實(shí)施例2接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的抑菌實(shí)驗(yàn)
宮頸炎主要致病菌之一——淋病雙球菌可以在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基以及適宜的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)成具有一定特征性的菌落。淋病雙球菌菌落典型形態(tài)為圓形、細(xì)小、凸起、 光滑、濕潤(rùn)、半透明或灰白色菌落。菌落邊緣成花瓣?duì)?、直徑?. 5-lmm，易乳化，有黏性。本實(shí)施例通過將材料接枝面覆蓋在TM培養(yǎng)基上作用于淋病雙球菌，一段時(shí)間后觀察材料表面的淋病雙球菌菌落區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)流程圖見圖5。1.擴(kuò)散法測(cè)試
參考日本抗菌劑的代表性評(píng)價(jià)法，借鑒食品和衛(wèi)生防疫部門的細(xì)菌檢驗(yàn)方法及《消毒技術(shù)規(guī)范》(消毒技術(shù)規(guī)范.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2002)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)IS0846 (EN ISO 846 Plastics - Evaluation of the action of micro organisms [R」(ISO, 1997)パ 以宮頸炎主要致病菌淋病雙球菌(N. gonorrhea)(標(biāo)準(zhǔn)株)作為試驗(yàn)菌，拍照定性觀察接枝IFN-α的抑菌乳膠材料周圍及表面的細(xì)菌生長(zhǎng)情況；采用TM (Thayer-Martin)選擇性培養(yǎng)基測(cè)定。2.淋病雙球菌的培養(yǎng)
將保存于脫脂牛奶中的淋病雙球菌接種于室溫平衡的TM培養(yǎng)基，置于36°C、5%C02、 >70%wet的微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，每24h傳代一次。3.測(cè)試抑菌能力
對(duì)所有實(shí)驗(yàn)用品進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，用接種環(huán)挑取經(jīng)TM培養(yǎng)基平板純化后的淋病雙球菌(約半環(huán))置入無(wú)菌生理鹽水OmL)，用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行對(duì)比，稀釋為約IO5CFU/ mL左右的菌懸液，用棉拭子均勻涂布于培養(yǎng)基表面，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，使用無(wú)菌鑷子將 5 個(gè)濃度(0.01 μ g/mL, 0. 025 μ g/mL, 0. 05 μ g/mL,0. 075yg/mL, 0. 1 μ g/mL)的材料接枝面朝下放置TM培養(yǎng)基表層，相當(dāng)于模擬體內(nèi)有菌環(huán)境，使材料上的IFN-α作用于淋病雙球菌。同時(shí)設(shè)置空白組(無(wú)接枝乳膠/細(xì)菌共培養(yǎng)) (圖6 a，c的上方材料)和游離組(涂抹0.25 μ g/mL游離AzPhIFN-α的乳膠/細(xì)菌共培養(yǎng))(圖6 a，c的下方材料)，而實(shí)驗(yàn)組(5組)接枝IFN- α (5種濃度)乳膠分別與細(xì)菌共培養(yǎng)(圖6 b，d上的材料)。作用1 后，將粘附有淋球菌的各組材料轉(zhuǎn)移至新的TM培養(yǎng)基，接枝面朝上，并在材料表面涂抹ー層培養(yǎng)基，給予淋球菌再生長(zhǎng)環(huán)境，重新培養(yǎng)15h(如圖6 a, b)及Mh(如圖6 c，d)后，拍照觀察各組材料表面菌落情況。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，培養(yǎng)1 后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中各種材料表面及周圍菌落生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異；培養(yǎng)24h后，對(duì)照組中無(wú)接枝乳膠以及直接涂抹游離IFN-α的乳膠表面覆滿淋球菌。而實(shí)驗(yàn)組中接枝各種濃度的乳膠表面并沒有像無(wú)接枝乳膠ー樣被菌覆蓋，也不像直接涂抹游離IFN-α的乳膠ー樣周圍有明顯ー圏。5.討論
宮頸糜爛是女性生殖系統(tǒng)ー種慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)理與病毒密切相關(guān)，長(zhǎng)期的宮頸炎可誘發(fā)宮頸癌。奧平栓具有抗病毒和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，是經(jīng)陰道給藥直接作用于病變部位及鄰近的正常組織細(xì)胞，作用機(jī)理主要有(1)抗病毒干擾素-α分子與細(xì)胞相互作用，使干擾素分子與靶細(xì)胞表面上的受體相結(jié)合，使細(xì)胞膜發(fā)生變化，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因而指導(dǎo)合成抗病毒蛋白，由抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用，使靶細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)。(2)免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)特異性免疫功能，增加吞噬細(xì)胞的吞噬作用，提高NK細(xì)胞、K細(xì)胞的殺傷活性，誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生。( 抑制其他微生物(鄭玉鳳鄒紅梅. 奧平栓治療宮頸糜爛臨床分析.中華中西醫(yī)雜志，2004; 5(11):64-68). (4)抗腫瘤。 (5)激素樣作用干擾素_α還能降低婦女患者體內(nèi)血清中的雌ニ醇和孕酮水平，使宮頸分泌物減少，此即其改善臨床癥狀較糜爛面愈合為快的原因。經(jīng)臨床觀察(李艷榮，趙西俠，王國(guó)慶.宮頸癌隨診患者HPV陽(yáng)性?shī)W平栓置放后的療效觀察.Modern oncology, 2011; 19(2) 340-341 )，奧平栓治療宮頸糜爛的效果與其分類關(guān)系密切，糜爛面積越小，痊愈率越高；對(duì)單純型糜爛顯著優(yōu)于顆粒型及乳頭型， 顆粒型優(yōu)于乳頭型?？傊?，無(wú)論哪種類型宮頸糜爛，奧平栓均具有顯著改善癥狀及陰道清潔的作用。現(xiàn)行市場(chǎng)上有含其他抗生素的避孕套，用來(lái)抑制淋球菌等病原體，但使用表面直接涂有添加劑的避孕套時(shí)，部分添加劑(如滑石粉)可能在性交中通過女性陰道進(jìn)入其腹腔，并可能造成慢性損害(范雅文，黃鴻新.天然膠乳橡膠避孕套質(zhì)量檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)分析. 中國(guó)醫(yī)療器械信息，2010; 16(3): 51-54)0本發(fā)明將IFN-α固定化在乳膠避孕材料上， 結(jié)果顯示其抑菌效果明顯優(yōu)于直接涂抹IFN-α的乳膠材料，賦予避孕套這一重要的節(jié)育工具更多的功能，甚至協(xié)助治療婦科炎癥。而接枝IFN-α的乳膠材料不僅可以作為避孕材料，也可以制作成為其他婦科用品，如改良節(jié)育環(huán)的設(shè)計(jì)，子宮帽等等，可以預(yù)見新型保健避孕材料可以配合傳統(tǒng)藥物共同預(yù)防甚至治療宮頸炎。6.結(jié)論
IFN-α顆粒為納米級(jí)，均勻地排列在乳膠薄膜上。接枝IFN-α的乳膠材料能長(zhǎng)效并集
9中抑制導(dǎo)致宮頸炎的主要微生物——淋病雙球菌。
權(quán)利要求
1.一種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，其特征在于由IFN-α接枝固定到乳膠避孕材料表面形成。
2.權(quán)利要求1所述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，其特征在于采用光化學(xué)固定法，將IFN-α接枝固定到乳膠避孕材料表面上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，其特征在于具體步驟如下將IFN-α加入到含有Λ/-琥珀亞酰胺的ニ甲基酰胺溶液中，在4°C攪拌反應(yīng)48h，合成光活性IFN-α，將光活性IFN-α涂抹在乳膠避孕材料表面，避光冷凍干燥后， 紫外照射。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，其特征在于合成光活性IFN-α后，還包括對(duì)合成光活性IFN-α進(jìn)行離心純化的步驟，具體為采用超過濾膜，在4000 rpm轉(zhuǎn)速下間斷離心。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，其特征在于所述紫外照射時(shí)間為20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料的制備方法，其特征在于紫外照射為在距離15W紫外燈下2cm處進(jìn)行照射。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，該材料是由IFN-α接枝固定到乳膠避孕材料表面形成的。本發(fā)明還公開了該材料的制備方法，是采用光化學(xué)固定法，具體步驟為將IFN-α加入到含有N-琥珀亞酰胺的二甲基酰胺溶液中，在4℃攪拌反應(yīng)48h，合成光活性IFN-α，將光活性IFN-α涂抹在乳膠避孕材料表面，避光冷凍干燥后，紫外照射。本發(fā)明的接枝納米級(jí)IFN-α的抑菌乳膠避孕材料，IFN-α顆粒為納米級(jí)，均勻地排列在乳膠薄膜上，抑菌效果明顯優(yōu)于直接涂抹IFN-α的乳膠材料，接枝IFN-α的乳膠材料不僅可以作為避孕材料，還可以制作成為其他婦科用品，可以配合傳統(tǒng)藥物共同預(yù)防甚至治療宮頸炎。
文檔編號(hào)A61F6/04GK102532579SQ201210006709
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者關(guān)燕清, 劉俊明, 張琳 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)