專利名稱：蛋白激酶Mnk2a的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白激酶Mnk2a的新用途。
發(fā)明背景帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的神經(jīng)退行性變性疾病， 其發(fā)病率在神經(jīng)變性疾病中居第二，僅次于Alzheimer病(老年癡呆癥)。PD患者的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性壞死和病人腦內(nèi)Lew小體(Lewy ’s body, LB)的形成。但是，導(dǎo)致多巴胺能細(xì)胞選擇性凋亡和路易小體形成的機(jī)制尚不清楚。
一般認(rèn)為α -synuclein過表達(dá)或突變會(huì)引起α -synuclein聚集從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的選擇性凋亡，而這種α-synuclein聚集物正是黑質(zhì)中的路易小體(LB)的主要成分，但是什么機(jī)制引發(fā)了 α-synuclein聚集形成了有毒性的物質(zhì)，目前研究尚不清楚。已有的研究顯示α-synuclein的磷酸化在這個(gè)聚集過程中具有很重要的作用。尤其是第1 位絲氨酸的磷酸化，它是唯一廣泛分布于帕金森病患者大腦中的位點(diǎn)，這暗示著α-synuclein 1 位絲氨酸的磷酸化在PD發(fā)病過程中起著一定的作用。
如今，已發(fā)現(xiàn)的可以磷酸化α -synuclein絲氨酸第1 位的激酶有酪蛋白激酶 (CKl和CK2)以及G蛋白偶聯(lián)受體激酶家族(GRK2，GRK3, GRK5和GRK6)等，涉及到PD發(fā)病過程的機(jī)制有泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等，然而對(duì)于導(dǎo)致PD發(fā)病的相關(guān)基因和分子機(jī)制仍沒有很全面的論述。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白激酶Mnl^a在制備治療帕金森氏病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明主要包括構(gòu)建細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3. 1_ α -synuclein, pcDNA3. 1-α -synuclein_S129A 以及 pcDNA3. 1-Mnk2a_myc ；western 檢測(cè) α -synuclein 蛋白表達(dá)水平和其1 位絲氨酸磷酸化的水平；免疫細(xì)胞熒光的手段檢測(cè)MriMa對(duì) α -synucleinl29絲氨酸的磷酸化在SH-5Y-5Y細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出來的生理學(xué)變化。
果蠅蛋白激酶LK6可以通過ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)α-synuclein 1 位絲氨酸的磷酸化，本發(fā)明們克隆了 LK6的人源同源基因Mnk^i即MAI3K相互作用的激酶-2的一個(gè)可變剪接體。通過western手段鑒定出MnMa可以通過ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)α-Synucleinl29 位絲氨酸的磷酸化，于此同時(shí)，通過細(xì)胞免疫熒光的手段檢測(cè)到在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 (SH-5Y-5Y)核內(nèi)，Mnk^i會(huì)加劇類似于路易士小體的α -synuclein顆粒狀聚集物的形成。 這為全面研究PD的發(fā)病病因提供了進(jìn)一步的依據(jù)和作用機(jī)制。


圖1為HEK293T細(xì)胞內(nèi)α -synuclein的表達(dá)水平和磷酸化的情況圖2為Mnk^^i α -synucleinU9位絲氨酸磷酸化水平的鑒定。其中A為Western-blot 結(jié)果，蛋白總量一致，α-synuclein作為內(nèi)參；B為α-synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的變化的統(tǒng)計(jì)圖(p<0. 05)。
圖3為MnMa對(duì)α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化的作用導(dǎo)致SH-5Y-5Y細(xì)胞內(nèi) α-synuclein顆粒狀聚集物的形成.(A)細(xì)胞免疫熒光圖。(B)過表達(dá)a-synuclein以及Mnk2a與α-synuclein，細(xì)胞核內(nèi)小顆粒數(shù)目變化統(tǒng)計(jì)圖(**P<0. 001 ；*P<0. 01)。
圖4為MnMa通過ERK信號(hào)通路磷酸化α -synuclein的129位絲氨酸。其中A 為Western-blot結(jié)果，蛋白總量一致，α-synuclein作為內(nèi)參；B為α-synuclein第129 位絲氨酸磷酸化的變化的統(tǒng)計(jì)圖(P<0. 05)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一檢測(cè)MnMa對(duì)α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化的效果1. ^ ii i(； # pcDNA3. 1-α-synuclein, pcDNA3. 1-α-Synuclein-S129A ( α -synucleinl29位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?以及pcDNA3. 1-Mnk2a_myc的構(gòu)建用特定引物做PCR分別從表達(dá)人源α -synuclein的果蠅中克隆出α -synuclein以及α -synuclein-S129A基因，從HEK293T細(xì)胞內(nèi)克隆出MnMa基因，然后分別構(gòu)建到 pcDNA3. 1與pcDNA3. 1-myc空載中，送出去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比較，證實(shí)構(gòu)建的載體成功。
用于克隆Mnk2a目的基因的上游引物序列為5’ -cccaagcttaccatgcccgccagccag cccattg -3'下游弓丨物序列為5' -ccgctcgagtcaggcgtggtctcccaccag-3， Mnk2a目的基因的全長(zhǎng)序列為atgcccgccagccagcccattgacatcccggacgccaagaagaggggcaagaagaagaagcgcggccgggcc accgacagcttctcgggcaggtttgaagacgtctaccagctgcaggaagatgtgctgggggagggcgctcatgcccg agtgcagacctgcatcaacctgatcaccagccaggagtacgccgtcaagatcattgagaagcagccaggccacattc ggagcagggttttcagggaggtggagatgctgtaccagtgccagggacacaggaacgtcctagagctgattgagttc ttcgaggaggaggaccgcttctacctggtgtttgagaagatgcggggaggctccatcctgagccacatccacaagcg ccggcacttcaacgagctggaggccagcgtggtggtgcaggacgtggccagcgccttggactttctgcataacaaag gcatcgcccacagggacctaaagccggaaaacatcctctgtgagcaccccaaccaggtctcccccgtgaagatctgt gacttcgacctgggcagcggcatcaaactcaacggggactgetcccctatctccaccccggagctgctcactccgtg cggctcggcggagtacatggccccggaggtagtggaggccttcagcgaggaggctagcatctacgacaagcgctgcg acctgtggagcctgggcgtcatcttgtatatcctactcagcggctacccgcccttcgtgggccgctgtggcagcgac tgcggctgggaccgcggcgaggcctgccctgcctgccagaacatgctgtttgagagcatccaggagggcaagtacga gttccccgacaaggactgggcccacatctcctgcgctgccaaagacctcatctccaagctgctggtccgtgacgcca agcagaggctgagtgccgcccaagtcctgcagcacccctgggttcaggggtgcgccccggagaacaccttgcccact cccatggtcctgcagaggaacagctgtgccaaagacctcacgtccttcgcggctgaggccattgccatgaaccggca gctggcccagcacgacgaggacctggctgaggaggaggccgcggggcagggccagcccgtcctggtccgagctacct cacgctgcctgcagctgtctccaccctcccagtccaagctggcgcagcggcggcaaagggccagtctgtcctcggcc ccagtggtcctggtgggagaccacgcctga表達(dá)載體使用的是空載pcDNA3. 1-myc，雙酶切位點(diǎn)分別是Hind III，Β ο I。
2.轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的表達(dá)載體進(jìn)入HEK293T細(xì)胞將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)后，抽蛋白做western分析。具體步驟為a).比較不做任何處理的HEK293T細(xì)胞和單獨(dú)轉(zhuǎn)染α -synuclein的細(xì)胞 α -synuclein蛋白的表達(dá)量以及其1 位絲氨酸磷酸化的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HEK293T細(xì)胞內(nèi)α-synuclein蛋白的表達(dá)量較低檢測(cè)不到，并且HEK293T細(xì)胞內(nèi)本身存在著可以磷酸化a-SynucleinU9位絲氨酸的激酶。結(jié)果見圖1。
b).比較共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體a -synuclein與Mnk2a以及單獨(dú)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體 a-synuclein的細(xì)胞蛋白在a-synucleinU9位的磷酸化情況。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染MnMa和 α -synuclein后，Mnk2a使α -synuclein的1 位絲氨酸的磷酸化水平提高了 1. 41倍。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mnk^i可以使α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化。結(jié)果見圖2。
3. 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)用α -synuclein的抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α -synuclein的表達(dá)量以及分布情況，其熒光標(biāo)記物為FITC綠色熒光蛋白。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-5Y-5Y)，共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體α-synuclein與Mnk2a明顯比單獨(dú)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體α-synuclein在細(xì)胞核內(nèi)形成的α-synuclein顆粒的數(shù)量多，而共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體 α -synuClein-S129A與Mnk^i并沒有在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)類似的顆粒狀聚集物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Mnk2a促進(jìn)了 α -Synucleinl29位的磷酸化以及這種磷酸化作用會(huì)加劇類似于路易士小體的α-synuclein顆粒狀聚集物的形成。結(jié)果見圖3。
實(shí)施例二 檢測(cè)ERK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)MnMa對(duì)α -Synucleinl29位的磷酸化作用使用ERK信號(hào)通路的激活劑PMA和抑制劑PD98059分別對(duì)共轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體 α -synuclein與Mnk2a的細(xì)胞進(jìn)行處理，然后抽提細(xì)胞蛋白，用于western手段分析。使用了 PMA處理的細(xì)胞α -synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的水平提高了 1. 65倍，使用了 PD98059處理的細(xì)胞α -synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的水平降低了 0. 80倍，而PMA的激活作用可以被PD98059處理后顯著的降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MriMa可能是通過ERK信號(hào)通路來調(diào)節(jié)α-synuclein第1 位絲氨酸的磷酸化。結(jié)果參見圖4。
權(quán)利要求
1. 一種蛋白激酶MriMa在制備治療帕金森氏病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白激酶Mnk2a的新用途，本發(fā)明通過western手段鑒定出Mnk2a可以通過ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)α-synuclein129位絲氨酸的磷酸化，于此同時(shí)，通過細(xì)胞免疫熒光的手段檢測(cè)到在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-5Y-5Y)核內(nèi)，Mnk2a會(huì)加劇類似于路易士小體的α-synuclein顆粒狀聚集物的形成。這為全面研究PD的發(fā)病病因提供了進(jìn)一步的依據(jù)和作用機(jī)制。
文檔編號(hào)A61P25/16GK102526713SQ20121000810
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者夏瑩, 文鐵橋 申請(qǐng)人:上海大學(xué)