專利名稱：一種用于基因治療的細胞的構建方法及制得的細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于基因治療的細胞的構建方法，及使用該方法構建得到的細胞。
背景技術：
基因治療是區(qū)別于傳統(tǒng)藥物治療和手術治療的一種新興疾病療法。主要是指利用基因工程的手段，改造遺傳信息，從而起到改變疾病表形，治療疾病的作用。自從上世紀第一例利用腺病毒載體進行的基因治療以來，該項技術已經在全球生物醫(yī)學領域得到廣泛應用。雖然FDA尚未批準基因治療，但臨床前景仍很廣闊?；蛑委煹陌袠酥饕沁z傳性疾病，或稱分子病，指的是患者的遺傳信息發(fā)生改變。常見的分子病包括地中海貧血、重癥肌無力等?，F有的基因治療主要策略是病毒療法或是核酸療法。具體來說，腺病毒應用最廣。 腺病毒基因組大小適中，易于操作；同時腺病毒具有非基因組整合性，不會隨宿主基因組復制而同步復制，同慢病毒或逆轉錄病毒相比大大提高了安全系數。細胞是病毒的天然宿主， 因此基因表達效率較常規(guī)轉染手段高。核酸療法主要是反義核酸和小分子siRNA藥物。由于此類RNA分子小，易于給藥，貯存方便，安全性高，已有部分通過FDA批注得以上市?，F有的基因治療方法，一般通過引入外源載體或核酸，在體內表達具有正常功能的蛋白，或使致病基因沉默，以實現基因治療的目的。這些療法或制劑都無法將含有致病基因的細胞修復為正常的細胞，實現真正意義上的基因治療。由于無法將突變基因修改，也就無法實現正常的蛋白表達調控，現有的基因療法也存在一定的風險。SiRNA雖然安全性更高，但是其應用范圍有限，且需要長期用藥，這也加重了客戶的經濟壓力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于基因治療的細胞的構建方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供采用上述方法構建得到的細胞。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種用于可用于地中海貧血治療的細胞的構建方法。本發(fā)明所采取的技術方案是
一種用于基因治療的細胞的構建方法，包括如下步驟
1)將載體中引入重組酶識別序列，在識別序列間插入正?；蛐蛄?，得到修復載體；
2)將正?；蛐蛄信c線性化酶切位點引入載體中，得到同源敲除載體；
3)將敲除載體線性化，加入同源正常基因序列特異性的鋅指核酸酶，共轉染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突變基因，篩選出至少一條同源突變基因被敲除的陽性iPSC細胞；
4)將修復載體、表達重組酶的載體共轉入篩選得到的iPSC細胞，基于重組酶識別序列和重組酶，進行基因的置換修復，得到可用于基因治療的陽性iPSC細胞。
優(yōu)選的，修復載體中還連接有篩選基因。優(yōu)選的，同源敲除載的正常基因序列和線性化酶切位點之間插入有重組酶識別序列，重組酶識別序列之間連接有篩選基因。優(yōu)選的，篩選基因為抗生素抗性基因。優(yōu)選的，篩選基因兩側設有重組酶識別序列。優(yōu)選的，修復載體由兩種不同的修復載體組成，兩種修復載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。優(yōu)選的，敲除載體由兩種不同的敲除載體組成，兩種敲除載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。一種可用于β -地中海貧血治療的細胞的構建方法,包括如下步驟
1)將第一組重組酶識別序列插入到載體中，在兩個識別序列之間插入正常β-地中海貧血珠蛋白基因，在識別序列和正常β-地中海貧血珠蛋白基因之間插入第二組重組酶識別序列，第二組重組酶序列中插入有抗性篩選基因，該得到修復載體對，修復載體之間的區(qū)別僅在于其抗性篩選基因不同；
2)將線性化酶、地中海貧血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到載體中，在5’臂和 3’臂之間插入第一組重組酶識別序列，第一組重組酶識別序列之間插入有第二組重組酶識別序列，第二組重組酶識別序列之間插入有篩選基因，第一組和第二組重組酶識別序列之間還插入有熒光蛋白序列，得到2個同源敲除載體，2個同源敲除載體之間的區(qū)別僅在于其篩選基因不同；
3)將同源敲除載體線性化，加入β_地中海貧血珠蛋白基因序列特異的鋅脂核酸酶， 共同轉入地中海貧血患者的iPSC，加入篩選因子篩選出致病的β-地中海貧血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到陽性iPSC ；
4)將修復載體、表達第一組重組酶的載體共轉入篩選得到的陽性iPSC中，進行重組修復，篩選出陽性克隆細胞株，該細胞株經擴增、誘導分化即可得到用于治療β_地中海貧血的造血干細胞。優(yōu)選的，篩選出陽性克隆細胞株之后，敲除其中的篩選基因。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明方法可以快速，簡便的得到大量的可用于基因治療的iPSC，不同的帶有致病基因的iPSC細胞可以采用基本相同的方法構建得到，有效地避免了針對特定疾病設計特定構建方法，大大減少了可用于基因治療的細胞的難度。使用本發(fā)明的方法，可以在體外同時進行多位點基因突變的修復，如多位點的點突變，缺失突變等，可以快速、有效的修復患者的帶病干細胞，將修復后的細胞經誘導為單能干細胞之后，回輸至患者可以有效的地治療相應的基因相關疾病，克服了現有技術操作復雜，修復效率低等缺陷。將其誘導為相應的單能干細胞之后，再注入到人體內，可以完成基因治療?？捎行У販p輕患者的負擔。由于使用的是患者自身的iPSC細胞，在進行基因治療的同時，避免了使用異種細胞或載體可能對人體造成的危害。修復后的細胞受到與正常細胞相同的調控， 避免了基因過量表達或表達不足的缺陷。


圖I :1號打靶刪除載體示意圖2:2號打靶刪除載體示意圖3:1號修復載體示意圖4:2號修復載體示意圖5:3號修復載體示意圖6 :4號修復載體不意圖。
具體實施例方式一種用于基因治療的細胞的構建方法，包括如下步驟
1)將載體中引入重組酶識別序列，在識別序列間插入正?；蛐蛄校玫叫迯洼d體；
2)將正?；蛐蛄信c線性化酶切位點引入載體中，得到同源敲除載體；
3)將敲除載體線性化，加入同源正?；蛐蛄刑禺愋缘匿\指核酸酶，共轉染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突變基因，篩選出至少一條同源突變基因被敲除的陽性iPSC細胞；
4)將修復載體、表達重組酶的載體共轉入篩選得到的iPSC細胞，基于重組酶識別序列和重組酶，進行基因的置換修復，得到可用于基因治療的陽性iPSC細胞。優(yōu)選的，修復載體中還連接有篩選基因。優(yōu)選的，同源敲除載的正?；蛐蛄泻途€性化酶切位點之間插入有重組酶識別序列，重組酶識別序列之間連接有篩選基因。通過插入篩選基因，可以方便地通過設置篩選條件，篩選出所需要的陽性細胞，大大簡化了篩選的難度。優(yōu)選的，篩選基因為抗生素抗性基因，這樣就可以簡單通過在培養(yǎng)基中添加相應的抗生素來篩選出所需要的細胞。優(yōu)選的，篩選基因兩側設有重組酶識別序列。這樣可以簡單通過加入重組酶或表達重組酶的載體，對重組酶識別序列之間的篩選基因進行替換，大大降低了修復載體、敲除載體構建時的工作量，有利于快速、簡便地替換不同的篩選基因。優(yōu)選的，修復載體由兩種不同的修復載體組成，兩種修復載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。優(yōu)選的，修復載體和/或同源敲除載體中還插入有熒光蛋白基因，這樣可以簡單通過熒光檢測，判斷所需要的核酸序列是否已經表達，進而篩選出所需要的細胞，或者選擇出修復后可更好表達的細胞。優(yōu)選的，敲除載體由兩種不同的敲除載體組成，兩種敲除載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。通過使用不同的篩選基因，同時添加多種篩選條件，可以方便的得到同源基因都被刪除或修復的細胞。為避免將篩選基因，特別是抗生素抗性基因引入患者體內造成潛在的危害，將最終得到的陽性iPSC細胞中的篩選基因敲除。一種可用于β -地中海貧血治療的細胞的構建方法,包括如下步驟
I)將第一組重組酶識別序列插入到載體中，在兩個識別序列之間插入正常β-地中海貧血珠蛋白基因，在識別序列和正常地中海貧血珠蛋白基因之間插入第二組重組酶識別序列，第二組重組酶序列中插入有抗性篩選基因，該得到修復載體對，修復載體之間的區(qū)別僅在于其抗性篩選基因不同；
2)將線性化酶、地中海貧血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到載體中，在5’臂和 3’臂之間插入第一組重組酶識別序列，第一組重組酶識別序列之間插入有第二組重組酶識別序列，第二組重組酶識別序列之間插入有篩選基因，第一組和第二組重組酶識別序列之間還插入有熒光蛋白序列，得到2個同源敲除載體，2個同源敲除載體之間的區(qū)別僅在于其篩選基因不同；
3)將同源敲除載體線性化，加入β_地中海貧血珠蛋白基因序列特異的鋅脂核酸酶， 共同轉入地中海貧血患者的iPSC，加入篩選因子篩選出致病的β-地中海貧血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到陽性iPSC ；
4)將修復載體、表達第一組重組酶的載體共轉入篩選得到的陽性iPSC中，進行重組修復，篩選出陽性克隆細胞株，該細胞株經擴增、誘導分化即可得到用于治療β_地中海貧血的造血干細胞。優(yōu)選的，篩選出陽性克隆細胞株之后，敲除其中的篩選基因。下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明?？捎糜讦?-地中海貧血治療的細胞的構建
同源敲除載體的構建
(I)以pDREVO為模版，通過PCR方法直接將Loxp2272和Loxp511加至刪除載體單元 Venus-Rox_Puro+-Rox 兩側，并加入 Sfil 形成 SfilA -Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Lo xp511- SfilB 的結構，并連入 p-simple-18T Vector，形成 18T_SfilA -Loxp2272_Venus-R ox-Puro+-Rox-Loxp511- SfilB0PCR 引物，Forward : 5，- GGCCATTACGGCCATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTA T-3’ (SEQ ID NO 1)
RE: 5’ - GGCCGCCCTGGCCATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTATGGCGCGCCTAAC-3’ (SEQ ID NO 2)
①PCR體系
Kod plus PCR (Kod及其反應試劑是東洋坊公司產品)。Kod buffer5 μ I MgCl2 (2mM) 2μ I
dNTP (2mM)5 μ I
For primer2 μ I
Re primer2 μ I
Kod 酶2 μ I
H2O31 μ I
模版I μ I
Total50 μ I
95°C 2min, 94°C 30 sec, 68°C 5min, 30cycle。②尾端加T體系(Premix Extaq及其反應試劑是Takara公司產品)Premix Extaq:
Kod PCR products Total
25 μ 25 μ ] 50 μ ]
95 °C 5min, 72 °C 20min.
③p-simple_18T連接體系(p-simple_18T及其反應試劑是Takara公司產品)利用PB-SalI-CAG-Bgl II -SfilA- CM- SfilB-Mlul-EcoRl 載體 5’的 Sall-Bgl II, 3’ Mlul-EcoRl，分別將β -globin基因編碼區(qū)起始位點ATG上游的986_bp同源臂，終止位點TAA下游898-bp的同源臂裝入Sall-Bgl II區(qū)域和Mlul-EcoRl，同時在5，引入Nhel和 Asisl，形成 PB-Sall-Nhel-Asisl-5’Arm -Bgl II -SfilA- CM- SfiIB-Mlu 1-3JArm-EcoRl (I)酶切體系(內切酶及其反應試劑是Takara公司產品)
EcoRl/Sall2μ I
Bgl II /Mlul2μ I
H buffer5 μ I
PCR片段/載體20 μ I
H2O21 μ I
37°C,4h0(2)片段連接體系(連接反應試劑是Takara公司產品)
PCR片段4 μ I
載體I μ I
Solutionl5 μ I(3)利用 Sfi 1Α、SfilB 酶位點，將(I)中 Loxp2272-Venus-Rox_Puro+-R ox_Loxp511 克隆至中間載體 PB-Sall-Nhel-Asisl-5’ Arm -Bgl II -SfilA- CM-SfilB-Mlul-3，Arm-EcoRl 載體，形成 PB-Sall-Nhel-Asisl-5，Arm -Bgl II -SfilA- Loxp2 272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511- SfilB-Mlul-3’ Arm-EcoRl。①酶切體系(內切酶及其反應試劑是Takara公司產品)
Sfil5μ I
H buffer5 μ I
片段/載體20μ1
H2O20 μ I
56°C,8h.
②片段連接體系(連接反應試劑是Takara公司產品)
片段4μ1
載體I μ I
P-simple_18T Solution I
加T產物
Total
16°C,2h0
4μ I 10 μ I
16 °C, 2h。
7Solutionl5 u 1
16。。，2h。(4)將(3)最后形成的載體Nhel-EcoRl酶切，連入pl253/Spel_EcoRl,最終形 成 @ -globin 基因編碼區(qū)的刪除載體Asisl_5’Arm-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox_Lox p511 -3 ’ Arm-PGK-dTK ;利用該刪除載體Puro+兩側的Rox序列和BAD-Dre工程菌，將Puro+ 換成Neo+，形成2個刪除載體。最終
1號Asisl_986bp_ 5，Arm - SfilA-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511-SfilB -3，Arm-PGK-dTK (圖 1);
2號Asisl_986bp-5，Arm - SfilA -Loxp2272-Venus-Rox-Neo+-Rox-Loxp511-SfiIB -3’ Arm-PGK-dTK (圖 2);
①酶切體系(內切酶及其反應試劑是Takara公司產品) Nhel/Spel2u 1
EcoRl2 u 1
H buffer5 u 1
片段/載體20iU
H2021 ill
37°C,4h.
②片段連接體系(連接反應試劑是Takara公司產品)
片段4iU
載體1 U 1
Solutionl5 u 1
16。。，2h。③BAD-Dre轉化體系
先將含有BAD-Dre工程菌制備成感受態(tài)細胞，之后將pl253-Asisl_5’ Arm-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511 -3，Arm-PGK-dTK 載體轉入該工程菌，32°C加入 100 u g/ ml阿拉伯糖誘導Dre的表達2小時，之后收菌并以冰水反復洗滌，以制備成電轉感受態(tài)，將 Rox-Neo-Rox片斷電轉感受態(tài),37°C在A+、K+抗性圖板即可。修復載體的構建
(5)利用(1)18T -Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511 中 Venus 讀碼 框兩側的Pacl-Rsr II ,將正確的P -globin的基因(含intron)以及P -globin cDNA 插入 Pacl-Rsr II 區(qū)域，同時替換掉 Venus 基因，形成 18T- Loxp2272_hBB cDNA (gene) -Rox-Puro+-Rox_Loxp511。之后利用該載體Puro+兩側的Rox序列和BAD-Dre工程 菌，將Puro+換成Zeocin+和Hygro+,最終形成0 -globin正確基因的4個修復載體
1號18T- SfilA -Loxp2272-hBB cDNA-Rox-Zeocin+-Rox-Loxp511-SfiIB (圖 3)；
2號18T- SfilA -Loxp2272-hBB cDNA-Rox-Hygro+-Rox-Loxp511-SfiIB (圖 4);
3號18T_ SfilA _Loxp2272_hBB gene (intron)-Rox- Zeocin+-Rox-Loxp511-SfilB (圖 5)。4 號18T_ SfilA -Loxp2272_hBB gene (intron) -Rox-Hygro+-Rox-Loxp511-SfiIB (圖 6)。
PCR 引物:
hbbF3: 5’ - CGCCGGACCGCCACCATGGTGCATCTGACTCCTG-3’(SEQ ID NO :3) hbbR3: 5’-ACGTTAATTAACTTAGTGATACTTGTGGGCCAG-3’ (SEQ ID NO :4)
①PCR體系
Premix Extaq25 μ I
For primer2 μ I
Re primer2 μ I
模版I μ I
H2020 μ I
Total50 μ I
95°C 5min, 94°C 40 sec, 55°C 40 sec, 72°C I. 5min, 30cycle.
②酶切體系(內切酶及其反應試劑是NEB公司產品)
Pacl2 μ I
Rsr II2 μ I
I buffer5 μ I
片段/載體20μ1
Η2021 μ I
37°C,6h.
③連接體系同上。 ④BAD-Dre轉化體系，同上。(6)將修復載體I號、2號、3號、4號用Sfil連入PB-CAG-SfilA-CM-SfilB中，利用該載體上的CAGG promoter,檢測4個修復載體的β -globin表達狀況。將以上幾個載體順轉HEK293細胞，24小時后收集細胞蛋白進行β-globin蛋白的 western Blot分析,結果表明其可以表達出蛋白。(7)將(4)中形成I號和2號突變基因刪除載體用Asisl線性化，同時加入表達β-globin序列特異的鋅脂核酸酶，共同電轉β-地中海貧血患者的iPSC，之后在 Puromycin, Neomycin和gancyclovir培養(yǎng)基中進行正向和負向的篩選。①系線性化體系(內切酶及其反應試劑是NEB公司產品)
Asisl4 μ I
4 buffer5 μ I
載體20 μ I
H2O21 μ I
37°C,6h.
②電轉及篩選體系
線性化打靶DNA量30 μ g，鋅指核酸酶表達載體30 μ g0電轉儀型號Bio-Rad Gene Pulser(Cat. No. 165-2105);電穿孔條件電壓 240 v，電容 500 μ F，通電時間 8-9. 5ms。 克隆篩選條件300 μ g/ml G418、I μ g/ml puromycin 和 2 μ M GanC 篩選 8 天
(8)將(7)篩選出的iPSC克隆進行PCR及測序的鑒定，尋找兩個同源染色體突變的 β-globin都被刪除的克隆株，在此基礎上將兩個不同抗性的修復載體同時電轉入陽性iPSC克隆株，同時轉入表達Cre的重組質粒PB-CAG-Cre進行Loxp2272和Loxp511的識別和置換修復。Zeocin+和Hygro+抗性篩選,Puromycin+和Neomycin+的負篩選,選擇陽性克隆細胞株。電轉及篩選體系線性化打靶DNA量30 μ g，Cre表達質粒30 μ g。電轉儀型號 Bio-Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105);電穿孔條件電壓 240 v，電容 500 μ F，通電時間 8-9. 5msο 克隆篩選條件2 μ g/ml Zeocin+、2 μ g/ml Hygro+ 篩選。(9)利用PCR及測序，鑒定所篩到的克隆是否為正確修復后的iPS克隆，并將修復正確的iPS誘導分化至造血干細胞。經實驗驗證，分化所得血細胞的功能獲得糾正。
權利要求
1.一種用于基因治療的細胞的構建方法，包括如下步驟1)將載體中引入重組酶識別序列，在識別序列間插入正常基因序列，得到修復載體；2)將正?；蛐蛄信c線性化酶切位點引入載體中，得到同源敲除載體；3)將敲除載體線性化，加入同源正?；蛐蛄刑禺愋缘匿\指核酸酶，共轉染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突變基因，篩選出至少一條同源突變基因被敲除的陽性iPSC細胞;4)將修復載體、表達重組酶的載體共轉入篩選得到的iPSC細胞，基于重組酶識別序列和重組酶，進行基因的置換修復，得到可用于基因治療的陽性iPSC細胞。
2.根據權利要求I所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于修復載體中還連接有篩選基因。
3.根據權利要求I所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于同源敲除載的正?；蛐蛄泻途€性化酶切位點之間插入有重組酶識別序列，重組酶識別序列之間連接有篩選基因。
4.根據權利要求2或3所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于篩選基因為抗生素抗性基因。
5.根據權利要求2或3所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于篩選基因兩側設有重組酶識別序列。
6.根據權利要求2或4所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于修復載體由兩種不同的修復載體組成，兩種修復載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。
7.根據權利要求3或4所述的一種用于基因治療的細胞的構建方法，其特征在于敲除載體由兩種不同的敲除載體組成，兩種敲除載體的區(qū)別在于其篩選基因不同。
8.采用上述任意一項權利要求所述方法構建得到的細胞。
9.一種可用于地中海貧血治療的細胞的構建方法，包括如下步驟1)將第一組重組酶識別序列插入到載體中，在兩個識別序列之間插入正常β-地中海貧血珠蛋白基因，在識別序列和正常地中海貧血珠蛋白基因之間插入第二組重組酶識別序列，第二組重組酶序列中插入有抗性篩選基因，該得到修復載體對，修復載體之間的區(qū)別僅在于其抗性篩選基因不同；2)將線性化酶、β-地中海貧血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到載體中，在5’臂和 3’臂之間插入第一組重組酶識別序列，第一組重組酶識別序列之間插入有第二組重組酶識別序列，第二組重組酶識別序列之間插入有篩選基因，第一組和第二組重組酶識別序列之間還插入有熒光蛋白序列，得到2個同源敲除載體，2個同源敲除載體之間的區(qū)別僅在于其篩選基因不同；3)將同源敲除載體線性化，加入β_地中海貧血珠蛋白基因序列特異的鋅脂核酸酶， 共同轉入地中海貧血患者的iPSC，加入篩選因子篩選出致病的β-地中海貧血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到陽性iPSC ；4)將修復載體、表達第一組重組酶的載體共轉入篩選得到的陽性iPSC中，進行重組修復，篩選出陽性克隆細胞株，該細胞株經擴增、誘導分化即可得到用于治療β_地中海貧血的造血干細胞。
10.根據權利要求9所述的一種可用于β-地中海貧血治療的細胞的構建方法，其特征在于篩選出陽性克隆細胞株之后，敲除其中的篩選基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于基因治療的細胞的構建方法，通過構建帶有正常基因的修復載體、同源敲除載體，使用敲除載體敲除患者iPSC的致病基因，之后使用修復載體對iPSC進行重組修復，得到用于基因治療的iPSC細胞。該方法可以快速，大量的修復細胞中的多類型和多個基因突變。
文檔編號A61K48/00GK102586324SQ20121001393
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權日2012年1月17日
發(fā)明者吳東海 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院