專利名稱：肺癌標(biāo)志物sbp-1及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和腫瘤藥物領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種肺癌標(biāo)志物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標(biāo)志物用于肺癌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
研究報(bào)道，肺癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是全球發(fā)病率和死亡率增加最快的腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有120萬(wàn)患者被診斷為肺癌，110萬(wàn)人死于肺癌。肺癌依據(jù)其組織病理學(xué)可分為兩大類:小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌又包含鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等。
迄今為止，全球的肺癌篩查方案尚不成熟。因此，早期篩查和診斷已經(jīng)成為肺癌防治急需解決的重大科學(xué)問(wèn)題。腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和合理應(yīng)用是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的前提。然而，目前對(duì)有關(guān)肺癌的發(fā)病機(jī)制和特性的認(rèn)識(shí)仍然不足，因此，研究者認(rèn)為，直接從蛋白質(zhì)整體水平入手研究肺癌的發(fā)病機(jī)制將有可能尋找出更合適的用于肺癌診斷的分子標(biāo)志物，這將為肺癌的診斷預(yù)防和治療提供關(guān)鍵依據(jù)。
現(xiàn)有的研究中表明，硒是一種具有抗癌效應(yīng)的元素，它以無(wú)機(jī)亞硒酸鹽或有機(jī)硒酸鹽的形式存在于植物和其他有機(jī)食物中。人類硒基蛋白質(zhì)組包含35種含硒蛋白質(zhì)，它們具有廣泛的生理功能。其中，(selenium binding protein, SBP-1)是一種細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，由Medina等于1990年首次從老鼠的肝臟分離純化出來(lái)，該SBP-1為硒元素在體內(nèi)的蛋白結(jié)合物，位于染色體lq21-22，分子量為56KD。因人類SBP與老鼠SP56基因?yàn)橥滴?，所以又稱為hSP56。目前已證實(shí)SBP-1在正常肝臟、肺、腎臟、結(jié)腸、前列腺、以及胰腺組織中高表達(dá)，在胸腺、睪丸、外周血細(xì)胞和腦組織中幾乎檢測(cè)不到。
迄今，尚未見(jiàn)有關(guān)有效地早期篩查和診斷肺癌的可供臨床應(yīng)用的檢測(cè)試劑，尤其是以SBP-1作為標(biāo)志物用于肺癌的檢測(cè)試劑及方法，這將為深入地研究和大規(guī)模驗(yàn)證SBP-1與肺癌的相關(guān)性，對(duì)癌癥進(jìn)行診斷以及為個(gè)體患者提供輔助治療方案具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供SBP-1的新用途。本發(fā)明提供了 SBP-1作為肺癌標(biāo)志物的用途，以及以SBP-1為靶標(biāo)篩選抑制肺癌細(xì)胞侵襲的藥物的應(yīng)用，為肺癌的診斷和治療提供參考依據(jù)。
本發(fā)明提供了 SBP-1作為肺癌標(biāo)志物的用途，主要針對(duì)小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌；尤其是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種肺癌診斷試劑盒，該試劑盒含有SBP-1。較好的，該試劑盒，主要針對(duì)小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的檢測(cè)；尤其是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等的檢測(cè)。
通常，試劑盒中含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，操作手冊(cè)，稀釋液或者緩沖液坐寸ο
本發(fā)明中，檢測(cè)時(shí)，通常采用相關(guān)抗體等檢測(cè)樣本中SBP-1含量。
本發(fā)明中，通過(guò)SBP-1抗體來(lái)檢測(cè)SBP-1的存在。
本發(fā)明采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)肺癌細(xì)胞系/組織和正常對(duì)照細(xì)胞/組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，質(zhì)譜鑒定其中部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。SBP-1蛋白為其中一個(gè)差異點(diǎn)，即其在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高表達(dá)，且可明顯區(qū)分。
采用Real-time PCR (以下簡(jiǎn)稱RT-PCR)和免疫組化的技術(shù)，分別檢測(cè)肺癌患者及其配對(duì)的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SBP-1在肺癌組織中表達(dá)明顯高于其配對(duì)的正常組織。該發(fā)現(xiàn)與比較蛋白質(zhì)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明SBP-1能夠作為一種肺癌的診斷標(biāo)志物。
具體檢測(cè)時(shí)，可以先取待測(cè)樣本，然后分析比較待測(cè)樣本與正常對(duì)照中SBP-1的表達(dá)量。
為此，本發(fā)明提供了一種采用上述肺癌診斷試劑盒用于檢測(cè)肺癌的方法，試劑盒中含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，稀釋液或者緩沖液以及容器或液態(tài)芯片和標(biāo)簽等，其特征在于，該方法包括以下步驟:
(I)制備含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，稀釋液或者緩沖液以及容器或液態(tài)芯片和標(biāo)簽的肺癌診斷試劑盒，所述的容器或液態(tài)芯片中分別設(shè)有:
a、SBP-1蛋白的特異性抗體；
b、PBS緩沖液ρΗ7.2-7.4，或0.0lmol檸檬酸鈉緩沖液ρΗ6.0，或3% Η202溶液，或辣根酶檢測(cè)試劑；
(2)制備重組蛋白，擴(kuò)增 SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞；
(3)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
(4)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)；
(5)純化的SBP-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，注射于動(dòng)物體內(nèi)以誘導(dǎo)多克隆抗體制備的產(chǎn)生，同時(shí)特異性結(jié)合SBP-1蛋白的抗體，也可以是用于檢測(cè)比較的抗體；
(6)免疫組化:脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過(guò)一系列不同級(jí)別的乙醇浸泡至水化；
(7)抗原修復(fù):將切片置于IOmM pH6.0檸檬酸緩沖液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ；
(8)微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中15min，然后用流動(dòng)的水沖洗5min ；
(9)將切片放置于3% H202室溫孵育15min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；
(10)切片置于1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min ；
(11)然后通過(guò)免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB ( 二氨基聯(lián)苯胺)底物染色；
(12)切片用蘇木精復(fù)染，然后通過(guò)一系列不同級(jí)別的乙醇浸泡至二甲苯，處理完的切片，鏡檢，實(shí)驗(yàn)中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對(duì)照，以SBP-1過(guò)表達(dá)的標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，最后完成檢測(cè)。
本發(fā)明中，重組蛋白制備SBP-1的編碼序列通過(guò)RT-PCR獲得，引物分別是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3 和 S100A2-R:5’ -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3’，模板用的是肺癌組織cDNA。獲得的DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/XohI雙酶切后插入經(jīng)BamHI/Xohl雙酶切的pGEX_4T_l中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-SBP-1。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)的SBP-1重組蛋白經(jīng)過(guò)純化，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。
本發(fā)明中，多克隆抗體制備用生理鹽水稀釋SBP-1重組蛋白，然后與弗氏不完全佐劑進(jìn)行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (獲得0.5-lml免疫前血清)，并進(jìn)行ELISA和Western Blotting檢測(cè)。如果檢測(cè)為陰性或抗體效價(jià)較低，則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150mg抗體，最后進(jìn)行ELISA和WB等質(zhì)量檢測(cè)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用雙側(cè)t檢驗(yàn)來(lái)比較差異。P < 0.01認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)采用SPSS V13.0軟件或者具備類似統(tǒng)計(jì)功能的軟件分析。實(shí)際檢測(cè)時(shí)待測(cè)樣本比正常對(duì)照中SBP-1的表達(dá)量高為陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果顯示=SBP-1蛋白為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)其中一個(gè)差異點(diǎn)，其在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高表達(dá)，且可明顯區(qū)分，表明SBP-1與肺癌腫瘤細(xì)胞有關(guān)。
從另一個(gè)角度說(shuō)明，本發(fā)明的SBP-1可以作為篩選抑制肺癌細(xì)胞的藥物的藥靶。
本發(fā)明采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)肺癌細(xì)胞系/組織和正常對(duì)照細(xì)胞/組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，質(zhì)譜鑒定其中部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。SBP-1蛋白為其中一個(gè)差異點(diǎn)，即其在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高表達(dá)，且可明顯區(qū)分。由此，提供了本發(fā)明的肺癌標(biāo)志物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標(biāo)志物用于肺癌的檢測(cè)試劑及方法，將為深入地研究和大規(guī)模驗(yàn)證SBP-1與肺癌的相關(guān)性，對(duì)癌癥進(jìn)行診斷以及為個(gè)體患者提供輔助治療方案具有重要意義。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)肺癌細(xì)胞系/組織和正常對(duì)照細(xì)胞/組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，質(zhì)譜鑒定其中部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；SBP-1蛋白為其中一個(gè)差異點(diǎn)，即其在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高表達(dá)，且可明顯區(qū)分。采用Real-timePCR(以下簡(jiǎn)稱RT-PCR)和免疫組化的技術(shù)，分別檢測(cè)了肺癌患者及其配對(duì)的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SBP-1在肺癌組織中表達(dá)明顯高于其配對(duì)的正常組織。
本發(fā)明中，通過(guò)SBP-1抗體來(lái)檢測(cè)SBP-1的存在。
基于此，提供一種肺癌診斷試劑盒，該試劑盒中含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，操作手冊(cè)，稀釋液或者緩沖液等。該試劑盒主要針對(duì)小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的檢測(cè)；尤其是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等的檢測(cè)。
所涉及的SBP-1蛋白質(zhì)的兩種亞型(酸性型457和天然型460)，相對(duì)分子質(zhì)量均為56KD，在人肺癌中近似等電點(diǎn)為6.3 6.6 ;另外，只存在于正常的肺臟組織中的SBP-1的相對(duì)分子質(zhì)量相同的其他兩種亞型中，帶有更多的酸性基團(tuán)，甚至有兩個(gè)或三個(gè)磷?；?。
采用上述肺癌診斷試劑盒檢測(cè)肺癌細(xì)胞:
I,通過(guò)重組DNA技術(shù),表達(dá)或生產(chǎn)重組SBP-1蛋白，包括步驟:
(I)擴(kuò)增SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞；
(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
所述的純化的SBP-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可注射于動(dòng)物體內(nèi)以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，同時(shí)特異性結(jié)合SBP-1蛋白的抗體，也可以是商業(yè)化的抗體；
所涉及的免疫組化包括步驟:(I)脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過(guò)一系列不同級(jí)別的乙醇浸泡至水化。(2)抗原修復(fù):將切片置于IOmMpH6.0朽1檬酸緩沖液(pH6.0)中，微波爐加熱15min。(3)微波處理后的切片仍置于朽1檬酸緩沖液中15min，然后用流動(dòng)的水沖洗5min。(4)將切片放置于3% H2O2室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。(5)切片置于1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min。(6)然后通過(guò)免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB (二氨基聯(lián)苯胺)底物染色。(7)切片用蘇木精復(fù)染，然后通過(guò)一系列不同級(jí)別的乙醇浸泡至二甲苯；處理完的切片，鏡檢；實(shí)驗(yàn)中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對(duì)照，以SBP-1過(guò)表達(dá)的標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。
2，制備重組蛋白
通過(guò)RT-PCR獲得SBP-1的編碼序列，引物分別為:S100A2-F:5，-GGATCCGAACTTCTGCACAAGG-3，和 S100A2-R:5，-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，以肺癌組織cDNA為模板；獲得的DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/Xohl雙酶切后插入經(jīng)BamHI/XohI雙酶切的pGEX-4T-l中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-SBP-l ;轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)的SBP-1重 組蛋白經(jīng)過(guò)純化，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。
所述的多克隆抗體的制備免疫用生理鹽水稀釋SBP-1重組蛋白，然后與弗氏不完全佐劑進(jìn)行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (獲得0.5-lml免疫前血清)，并進(jìn)行ELISA和Western Blotting檢測(cè)。如果檢測(cè)為陰性或抗體效價(jià)較低，則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150mg抗體，最后進(jìn)行ELISA和WB等質(zhì)量檢測(cè)。
所述的免疫組化收集肺癌患者及其配對(duì)的正常組織切片各20例，通過(guò)下述步驟:
(I)脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過(guò)一系列不同級(jí)別的乙醇浸泡至水化；(2)抗原修復(fù):將切片置于IOmM pH6.0檸檬酸緩沖液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ;(3)微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中15min，然后用流動(dòng)的水沖洗5min ； (4)將切片放置于3% H2O2室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；(5)切片置于1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min ； (6)然后通過(guò)免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB(二氨基聯(lián)苯胺)底物染色；(7)切片用蘇木精復(fù)染，然后通過(guò)不同級(jí)別的乙醇浸泡至二甲苯；處理切片，鏡檢。
實(shí)驗(yàn)中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對(duì)照，以SBP-1過(guò)表達(dá)的標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照；結(jié)果顯示，肺癌患者中16例均有不同程度高表達(dá)，而正常組織中未見(jiàn)高表達(dá)，結(jié)果表明，SBP-1高表達(dá)與肺癌有緊密的相關(guān)性，可供臨床對(duì)癌癥進(jìn)行診斷及為個(gè)體患者提供更好的輔助治療的有效方法。
權(quán)利要求
1.SBP-1蛋白在制備腫瘤標(biāo)志物中的用途，其中，所述的腫瘤為肺癌。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肺癌是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。
3.一種肺癌診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒中含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，操作手冊(cè)，稀釋液或者緩沖液以及容器或液態(tài)芯片和標(biāo)簽。
4.一種采用權(quán)利要求3的肺癌診斷試劑盒檢測(cè)肺癌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)制備含有標(biāo)準(zhǔn)劑量的SBP-1蛋白對(duì)照品，稀釋液或者緩沖液以及容器或液態(tài)芯片和標(biāo)簽的肺癌診斷試劑盒，所述的容器或液態(tài)芯片中分別設(shè)有: a、SBP-1蛋白的特異性抗體； b、PBS緩沖液pH7.2-7.4，或0.0lmol檸檬酸鈉緩沖液pH6.0，或3% H202溶液，或辣根酶檢測(cè)試劑； (2)制備重組蛋白，擴(kuò)增SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞； (3)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞； (4)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)； (5)純化的SBP-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆抗體； (6)免疫組化:脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；通過(guò)不同的乙醇浸泡至水化；(7)抗原修復(fù):將切片置于IOmMpH6.0檸檬酸緩沖液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ； (8)微波處理后的切片置于檸檬酸緩沖液中15min，用流動(dòng)水沖洗5min； (9)將切片放置于3%H202室溫孵育15min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性； (10)切片置于1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min； (11)免疫組化辣根酶系統(tǒng)DAB底物染色； (12)切片用蘇木精復(fù)染，不同級(jí)別的乙醇浸泡至二甲苯，處理切片，鏡檢，以水或緩沖液做陰性對(duì)照，以SBP-1過(guò)表達(dá)標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，完成檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求4方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，通過(guò)RT-PCR獲得重組蛋白SBP-1的編碼序列，引物分別是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3’和 S100A2-R:5’ -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3’， 模板為肺癌組織cDNA。
6.SBP-1在制備抑制肺癌細(xì)胞侵襲的藥物的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肺癌細(xì)胞是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和腫瘤藥物領(lǐng)域。涉及一種肺癌標(biāo)志物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標(biāo)志物用于肺癌的檢測(cè)方法。本發(fā)明采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)肺癌細(xì)胞系/組織和正常對(duì)照細(xì)胞/組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，質(zhì)譜鑒定其中部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。SBP-1蛋白為其中一個(gè)差異點(diǎn)，其在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高表達(dá)，且可明顯區(qū)分，本發(fā)明采用RT-PCR和免疫組化的技術(shù)，分別檢測(cè)肺癌患者及其配對(duì)的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)水平，結(jié)果顯示SBP-1在肺癌組織中表達(dá)明顯高于其配對(duì)的正常組織，表明SBP-1能作為肺癌的診斷標(biāo)志物。進(jìn)一步本發(fā)明提供一種肺癌診斷試劑盒及用于肺癌的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103217534SQ20121001982
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者宋言崢, 張舒林, 孫戰(zhàn)強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心