專利名稱：來源于抗CypA駱駝科動(dòng)物的重鏈VHH抗體基因、編碼多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域,尤其是抗親環(huán)素A(cyclophilin A, CypA)抗原的羊駝重鏈VHH抗體的基因和多肽，以及所述基因和多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)全球發(fā)病率I 我國(guó)RA患者已逾500萬人。RA患者致殘率高，發(fā)病的最初2年內(nèi)，約有75%的患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)損害，80%的患者20年后關(guān)節(jié)變形殘疾，部分病情進(jìn)展迅速，甚至導(dǎo)致死亡。因此，RA的治療一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，RA治療藥物不斷發(fā)展，尤其是一系列新的生物制劑的應(yīng)用顯著改善了 RA患者的滑膜炎癥，減緩了關(guān)節(jié)損傷。然而，目前針對(duì)RA的治療藥物主要以炎性細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞為靶點(diǎn)，均不能終止RA的軟骨和骨侵襲，因此，發(fā)現(xiàn)新的治療RA的靶點(diǎn)仍是RA治療的發(fā)展趨勢(shì)。親環(huán)素A(CypA)，一種廣泛存在的細(xì)胞內(nèi)蛋白，具有肽脯胺酰順反異構(gòu)酶活性。研究報(bào)道在炎癥刺激下，CypA能夠分泌至細(xì)胞外，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。RA病人的血清和滑液中存在高水平的CypA，并且其濃度與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在RA關(guān)節(jié)滑膜層內(nèi)，CypA主要由巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，誘導(dǎo)TNF-a、IL-8、MCP-1和IL-I β等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)CypA通過核轉(zhuǎn)錄因子NFk B刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)ΜΜΡ-9，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的降解。以上研究表明CypA作為ー種炎癥調(diào)節(jié)分子與RA的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。目前，以CypA為治療靶點(diǎn)的抗體類藥物仍未見報(bào)道。重鏈抗體是在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)的ー類天然缺失輕鏈的免疫球蛋白，克隆重鏈抗體的可變區(qū)得到的抗體被稱為VHH抗體。研究發(fā)現(xiàn)，VHH抗體具有易表達(dá)、可溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。它的最大特點(diǎn)是能夠識(shí)別獨(dú)特構(gòu)象的抗原表位，與傳統(tǒng)抗體相比，它的CDR3區(qū)較長(zhǎng)，能形成豐富的抗原結(jié)合構(gòu)象，適合從中篩選酶的抑制劑、受體的激動(dòng)劑或拈抗劑。MarcLauwereys等得到的VHH抗體片段能夠抑制碳酸酐酶和淀粉酶的活性。VHH抗體還可作為報(bào)告分子用于臨床上的組化篩選；還能夠作為生物傳感器的捕獲試劑抗體與毒素、酶等連接構(gòu)成的免疫融合物，組織穿透力強(qiáng)、清除快，是理想的藥物載體；VHH抗體還可作為細(xì)胞內(nèi)抗體。已有研究表明VHH抗體作為ー種小型化的基因工程抗體在基礎(chǔ)研究及藥物開發(fā)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體庫(kù)技木，該技術(shù)通過構(gòu)建抗體文庫(kù)，然后將抗體基因表達(dá)于噬菌體表面，用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩，能夠獲得任何ー種高度特異性的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的在于提供來源于抗CypA駱駝科動(dòng)物的重鏈VHH抗體基因及其 編碼的多肽，其重組后可表達(dá)出能夠與CypA特異性結(jié)合的抗體活性片段。
本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于所述抗體基因或多肽在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎性疾病方面藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗CypA重鏈VHH抗體的基因。本發(fā)明所述的抗CypA重鏈VHH抗體的基因是從CypA免疫羊駝所收集的外周血淋巴細(xì)胞所構(gòu)建的抗體庫(kù)中用我們?cè)吮磉_(dá)的CypA抗原篩選獲得。獲得I株陽性克隆，命名為Escherichia colipCANTAB5E-Al-HB2151(保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)保藏號(hào)CCTCC NO M 2011482，保藏日期2011年12月26日)，其誘導(dǎo)表達(dá)的抗體活性片段命名為Al。經(jīng)過序列測(cè)定和在NCBI中BLAST分析后，確認(rèn)所述的來源于抗CypA駱駝科動(dòng)物的重鏈VHH抗體基因，具有序列表〈400>1的基因序列，其編碼的多肽具有序列表〈400>2的氨基酸序列。上述基因重組后能夠表達(dá)出與CypA特異性結(jié)合的抗體活性片段。所述駱駝科動(dòng)物選自羊駝。本發(fā)明所克隆的重鏈VHH抗體基因應(yīng)用因特網(wǎng)上的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI對(duì)所得 序列進(jìn)行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所獲得基因確實(shí)來自駱駝胚系基因，和現(xiàn)有報(bào)道的各類抗體基因序列均不完全一致。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及所述抗體基因及其編碼多肽在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次采用羊駝作為免疫動(dòng)物，運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，從免疫羊駝外周血收集淋巴細(xì)胞，構(gòu)建了庫(kù)容量為4. 7xl07的抗CypA重鏈VHH抗體文庫(kù)。采用CypA蛋白進(jìn)行篩選，成功獲得了 I株能與表達(dá)的CypA抗原特異結(jié)合的抗CypA的重鏈VHH抗體，該抗體能夠抑制CypA所誘導(dǎo)的單核細(xì)胞THP-I的趨化及明膠酶的分泌，可以采用基因工程方法，構(gòu)建ニ聚體及多聚體，用于診斷或治療炎癥方面藥物的研究。本發(fā)明為進(jìn)ー步開展用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的相關(guān)藥物研究奠定了基礎(chǔ)，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體藥物的研究開辟了新的途徑。


圖I是羊駝免疫血清抗體滴度檢測(cè)結(jié)果。圖2 是 Western-blot 檢測(cè)1·蛋白 marker ；2.原核表達(dá) CypA 蛋白 SDS-PAGE ；3.抗體Al為ー抗，HPR標(biāo)記的抗E-tag抗體為ニ抗的western-blot檢測(cè)結(jié)果。圖3是CypA重鏈VHH抗體Al對(duì)THP-1細(xì)胞趨化的影響(Indicates P < O. 05)。圖4是CypA重鏈VHH抗體Al對(duì)THP-I細(xì)胞明膠酶分泌的影響。圖a明膠酶譜結(jié)果；圖b和c分別為MMP-9和MMP-2的密度掃描統(tǒng)計(jì)結(jié)果(Indicates P < O. 05)。
具體實(shí)施例方式(一)抗CypA重鏈VHH抗體Al的篩選I、羊駝的免疫CypA免疫兩只羊馬它，免疫方案如下免疫羊馬它抗原用量0. 5mg,0. 5mg, I. Omg,I. Omg, 2. 0mg,4. Omg, 4. Omg0免疫間隔時(shí)間2周。方法第一次免疫為抗原加弗式完全佐劑研磨混勻，皮下多點(diǎn)注射。后續(xù)免疫,抗原加弗式不完全佐劑,皮下多點(diǎn)注射,0. 5ml/點(diǎn)，4點(diǎn)/次。每次免疫前取少量血，用ELISA方法檢測(cè)羊駝血中抗CypA抗體的滴度，如圖I所示,經(jīng)過7次免疫后，其中I只羊駝血中抗體滴度達(dá)到I : 186，000。2、抗親環(huán)素A免疫噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建收集免疫羊騎外周血，分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA, Clontech公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用特異性引物，采用巢氏PCR方法擴(kuò)增重鏈可變區(qū)片段，反應(yīng)條件如表I、表2所示。構(gòu)建庫(kù)容量為4. 7X107的抗CypA免疫噬菌體抗體庫(kù)，酶切鑒定重組率為92%。第一輪PCR 引物5，primer 5，-GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3 ’5’ -GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG -3’3’ primer :5’ -CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’5’ -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’第二輪PCR引物5，primer5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG-3’5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGG-3， 5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGG-3’5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG-3’5，-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’3， primer5’ -GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG-3’5’ -GGACTAGTGCGGCCGCTATGAGGAGACGGTGACCTG-3’表I第一輪PCR反應(yīng)條件
94 °C3 min
94 °C3 Osec I
56°C3Osec35 個(gè)循環(huán)
72 V5 Osec
72 V10 min表2第二輪PCR反應(yīng)條件
94 °C3 min
94 °C3 Osec し
權(quán)利要求
1.ー種來源于抗CypA駱騎科動(dòng)物的重鏈VHH抗體基因，其特征在于具有序列表〈400〉I的基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述重鏈VHH抗體基因，其特征在于所述駱駝科動(dòng)物選自羊駝。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因編碼的多肽，其具有序列表〈400>2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1，2所述的基因作為制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性疾病藥物的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的多肽作為制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性疾病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于抗CypA駱駝科動(dòng)物的重鏈VHH抗體基因、編碼多肽，以及所述基因和多肽在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性疾病藥物中的應(yīng)用。所述的VHH抗體基因具有序列表1的基因序列，其編碼的多肽具有序列表2的氨基酸序列。本發(fā)明用羊駝作為免疫動(dòng)物，運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，成功獲得1株能與表達(dá)的CypA抗原特異結(jié)合的抗CypA的重鏈VHH抗體，該抗體能夠抑制CypA所誘導(dǎo)的單核細(xì)胞THP-1的趨化及明膠酶的分泌，可以采用基因工程方法，構(gòu)建二聚體及多聚體，用于診斷或治療炎癥方面藥物中的研究。本發(fā)明為進(jìn)一步開展用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的相關(guān)藥物研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102660551SQ20121002875
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者朱平, 李郁, 楊向民, 汪莉, 賈俊峰, 陳志南, 馬小魁 申請(qǐng)人:陳志南