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一種整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑及其制備方法

文檔序號:911005閱讀:307來源:國知局
專利名稱:一種整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑及其制備方法
技術領域
本發(fā)明屬醫(yī)生技術領域,涉及整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,具體涉及一種整合素介導的具有靶向抗腫瘤的吉西他濱白蛋白納米粒及其制備方法與應用。
背景技術
研究顯示,胰腺癌惡性程度高,發(fā)病率與死亡率接近,隨著人們生活水平的提高,發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)報道,2002年全球胰腺癌新增病例數(shù)為23.23萬,死亡病例達
22.70萬,在西方國家居腫瘤死因的第8位,病死率極高;2002年至2006年,上海全市共新診斷胰腺癌8190例,總發(fā)病率為12.17/10萬,標化發(fā)病率為6.22/10萬;胰腺癌占上海市男性發(fā)病的第8位,女性的第7位,男女發(fā)病比為1.18: I ;1973年至2006年,上海市區(qū)男性和女性的標化發(fā)病率分別上升62.20%和75.54%。吉西他濱為胰腺癌的一線化療用藥,自1996年上市以來,已取得了一定療效。但臨床實踐顯示,由于吉西他濱分子量小,親水性強,代謝快,血漿半衰期僅有17min左右,難以達到有效的血藥濃度;單藥吉西他濱的獲益率只有23.8%,中位生存期僅5.65個月,SP便聯(lián)合用藥,臨床反應率均不高。臨床實踐中,為克服上述缺點,往往會增加給藥劑量,而同時相應的全身毒副作用也會增加,患者耐受性降低。如何進一步提高化療的療效是目前胰腺癌治療面臨的一大難題。有研究通過改變藥物的劑型,如阿霉素白蛋白納米粒、紫杉醇白蛋白納米粒、吉西他濱白蛋白納米粒,通過納米粒的增強的滲透和滯留效應(EnhancedPermeability and Retention Effect, EPR效應)來提高腫瘤組織中藥物的濃度,實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向,從而提高藥物的治療效果。但,仍存在新的問題,即藥物濃度在癌組織與正常胰腺組織中相差不大,這就可能導致藥物在殺傷腫瘤細胞的同時,也會損傷正常的胰腺組織。因此,需要增 加納米粒的導向性,進一步提高藥物在腫瘤中的濃度。據(jù)研究顯示,目前導向性主要是通過抗體介導、受體介導、磁性以及pH敏感性等獲得,其中抗體介導主要通過抗原-抗體作用,容易引起人體免疫反應,而磁性和PH敏感性臨床應用技術尚不成熟,在受體介導的導向中,半乳糖、轉鐵蛋白、葉酸等研究顯示,前兩種在胰腺癌細胞中表達不高,無特異性,無法作為導向性載體。葉酸是葉酸受體的天然配體,葉酸受體在惡性腫瘤細胞中的表達明顯高于正常細胞,以葉酸作為載體,導向性較高,但在攜帶藥物進入腫瘤細胞的同時,能增加腫瘤細胞對葉酸的攝取,反而為腫瘤細胞提供了營養(yǎng),促進了腫瘤細胞的新陳代謝。所以,尋找更佳的導向載體已經成為提高胰腺癌介入化療效果的關鍵。整合素受體介導的細胞與細胞、細胞與基質間的粘附是腫瘤侵襲和轉移的基礎,ανβ3是整合素受體家族中重要的一員,其在腫瘤新生血管內皮細胞及多種腫瘤細胞表面有高表達,而在成熟血管和正常組織中表達很少。研究表明,含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽片段是整合素ανβ3受體的主要識別位點,人工合成的外源性RGD肽可通過ανβ3受體與腫瘤特異性結合,同時還可以與體內含RGD序列的蛋白競爭ανβ3受體,抑制腫瘤的侵襲和轉移。因此,本發(fā)明選擇RGD肽作為胰腺癌導向治療的載體,制備能提高藥物的靶向性的整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術的缺陷,提供一種能提高藥物靶向性的整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,尤其是一種整合素介導的具有靶向抗腫瘤的吉西他濱白蛋白納米粒制劑。本發(fā)明的另一目的是提供所述的整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑的制備方法。本發(fā)明的整合素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,為包載吉西他濱的白蛋白納米粒靶向給藥系統(tǒng),其特征在于,由吉西他濱原料藥、牛血清白蛋白BSA和RGD多肽以及注射用水、脫水劑、交聯(lián)劑和氫氧化鈉制成;其中,所述白蛋白其水溶液的濃度為2.5-3.0%(g/ml),RGD多肽濃度為5mg/ml,白蛋白納米粒的濃度為15mg/ml ;脫水劑與白蛋白水溶液的體積比為2: 1-3: I ;交聯(lián)劑與白蛋白的氨基摩爾比為50-100%,R⑶多肽與白蛋白納米粒體積比為10: I ;吉西他濱原料藥與白蛋白的質量比10-25%。本發(fā)明的一個實施例中,脫水劑優(yōu)選無水乙醇。本發(fā)明的一個實施例中,交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛本發(fā)明的整合素受體靶向型載藥白蛋白納 米粒制劑中,在RGD多肽的引導下可以靶向作用于高表達整合素α νβ 3受體的胰腺癌細胞和組織。本發(fā)明采用改良的去溶劑交聯(lián)法制備得到牛血清白蛋白納米粒混懸液,再采用MBS法將RGD多肽與白蛋白納米粒進行偶聯(lián),然后采用吸附載藥法對RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒進行載藥,制備得到分散性良好的納米粒,粒徑分布范圍94-166nm,平均粒徑為130nm,Zeta 電位-30.77mV,包封率為 92.16%,載藥量為 12.8%, 30min 突釋率為 53.25±2.23%,體外8小時累積釋放率達到90%。本發(fā)明的整合素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑的制備方法,其特征在于,其包括步驟:(I)制備白蛋白納米粒:配制3.0% BSA溶液,IM NaOH調節(jié)pH至8.5,攪拌下滴加無水乙醇,至藍色膠狀液形成,繼續(xù)攪拌,加入交聯(lián)劑戊二醛(白蛋白氨基摩爾比為100% ),繼續(xù)勻速攪拌,低溫(400C )旋轉蒸發(fā)除去乙醇,Slum濾膜,剩余膠狀液12000rpm離心,除去上清,沉淀部分加蒸餾水復溶,得白蛋白納米?;鞈乙?;(2)制備RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒:取少量RGD多肽置滅菌離心管中,雙蒸水試溶多肽,將溶解后的多肽吸回原管中,混勻,取雙蒸水繼續(xù)溶解多肽,混勻,使充分溶解,得濃度為10mg/ml多肽,將MBS用DMF溶為10mg/ml,按MBS:白蛋白納米粒=I: 10的比例,向白蛋白納米粒溶液中加入MBS,攪拌混勻,室溫活化30分鐘后,再按白蛋白納米粒:多肽=I: 10的比例,加入溶解的多肽,混勻,室溫反應,PBS透析,PH7.2,4°C過夜,得RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒的混懸液;分別取多肽,加蒸餾水稀釋為5mg/ml,以及RGD偶聯(lián)白蛋白納米?;鞈乙?;每支試管分別加入磷酸鹽EDTA溶液,設對照管,對照管加磷酸鹽EDTA溶液;再向每支試管中加入Ellman’ s試劑,混勻,反應,測在412nm處的吸光值,計算待測肽自由巰基的濃度,計算偶聯(lián)率;
(3)制備RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒:采用吸附載藥法對RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒進行載藥,按10 %載藥量計算投料,稱取適量吉西他濱,以純水配制成濃度為10mg/mL,加IM NaOH調節(jié)pH至8.5,加入適量純水后,用吉西他濱溶液將沉淀的RGD偶聯(lián)白蛋白納米?;鞈遥瑪嚢柽_吸附平衡,然后12000rpm離心制得載藥納米粒,用與原白蛋白溶液同體積的純水將載藥納米?;鞈液罄鋬龈稍?;檢測粒徑、Zeta電位、包封率以及載藥量。本發(fā)明中,所述的RGD多肽由5個氨基酸首尾成環(huán)形成,其序列為-Arg1-Gly2-Asp3-D-Tyr4-Lys5-,同時RGD環(huán)肽上再連接一個半胱氨酸,與BSA的巰基連接。本發(fā)明中,RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒偶聯(lián)率為32%。本發(fā)明中,所述RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒粒徑分布范圍94-166nm,平均粒徑為130nm, Zeta電位-30.77mV,包封率為92.16%,載藥量為12.8%, 30min突釋率為53.25 ±2.23%,體外8小時累積釋放率達到90%。本發(fā)明中,載藥白蛋白·納米粒制劑RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米?;鞈乙撼尸F(xiàn)為乳白色膠狀溶液。本發(fā)明制得的載藥白蛋白納米粒制劑能用于治療胰腺癌。由于RGD多肽能夠提高藥物載體的主動靶向性,本發(fā)明制得的靶向納米粒能顯著提高藥物在靶部位的聚集,從而提高胰腺癌治療的效果,經試驗證實,本發(fā)明通過偶聯(lián)RGD多肽制得的具有靶向作用整合素的載藥納米粒,具有較好的緩釋性和腫瘤靶向性,能提高化療藥物的治療效果,并減輕化療藥物的毒副作用,提高患者對治療的耐受性。為了便于理解,以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的一種整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑及其制備方法進行詳細地描述。需要特別指出的是,具體實例和附圖僅是為了說明,顯然本領域的普通技術人員可以根據(jù)本文說明,在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變,這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內。


圖1為RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒對不同胰腺癌細胞株的增殖抑制作用。圖2為RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒在裸鼠種植瘤模型中的組織藥物濃度分布。
具體實施例方式實施例1制備RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒配制3.0% BSA溶液10ml,IM NaOH調節(jié)pH至8.5。高速攪拌下以lml/min的速度滴加無水乙醇40ml,至藍色膠狀液形成,繼續(xù)攪拌60min。恒速攪拌下加入交聯(lián)劑戍二醒(白蛋白氨基摩爾比為100% ),繼續(xù)勻速攪拌16-20h。低溫(40°C )旋轉蒸發(fā)除去乙醇,Slum濾膜,剩余膠狀液12000rpm離心10分鐘。除去上清液,沉淀部分加蒸餾水復溶,得到白蛋白納米?;鞈乙?。取5mgRGD多肽,從中取出少量置于已滅菌的1.5ml離心管中,用100 μ I雙蒸水試溶多肽,將溶解后的多肽吸回裝有5mgRGD多肽的管中,混勻。取400 μ I雙蒸水繼續(xù)溶解多肽,在漩渦混合器上混勻,使其充分溶解,得多肽濃度為10mg/ml ;將MBS用DMF溶為10mg/ml,按MBS:白蛋白納米粒=I: IO的比例,向白蛋白納米粒溶液中加入MBS,攪拌混勻,室溫活化30分鐘后,再按白蛋白納米粒:多肽=I: 10的比例,加入溶解好的多肽,混勻,室溫反應3小時.用PBS透析,PH7.2,4°C過夜,得到RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒的混懸液;采用吸附載藥法對RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒進行載藥,按10%載藥量計算投料,稱取適量吉西他濱,以純水配制成濃度為10mg/mL,加IM NaOH調節(jié)pH至8.5,加入適量純水后,用吉西他濱溶液將沉淀的RGD偶聯(lián)白蛋白納米?;鞈?,攪拌12h達到吸附平衡,然后12000rpm離心制得載藥納米粒,用與原白蛋白溶液同體積的純水將載藥納米?;鞈液罄鋬龈稍铮粰z測粒徑、Zeta電位、包封率以及載藥量。所述R⑶偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒粒徑分布范圍94-166nm,平均粒徑為130nm,Zeta 電位-30.77mV,包封率為 92.16%,載藥量為 12.8%, 30min 突釋率為 53.25±2.23%,體外8小時累積釋放率達到90%。實施例2RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒對表達不同整合素α νβ 3水平的胰腺癌細胞株的抑制實驗分別取處于對數(shù)生長期的PANC-1、BxPC-3、SW1990、CFPAC-1細胞株,表面整合素α νβ 3受體陽性表達率分別為13.58%,86.94%,71.50%U2.51%。將貼壁培養(yǎng)、對數(shù)生長期的胰腺癌細胞株用0.05%胰蛋白酶消化下來,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液,每組以每孔5 X IO3個細胞分別接種96孔培養(yǎng)板孔內,每孔體積200 μ I。將培養(yǎng)板移至CO2培養(yǎng)箱中,在37°C、5% CO2及大于95%濕度條件下培養(yǎng)24h后,細胞貼壁,細胞近乎融合,吸棄培養(yǎng)液,用含0.2%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液靜止24h后分別加藥,用藥濃度(按所含GEM計)為0.01、0.1、1、10、1001^/1111,給藥后繼續(xù)培養(yǎng)2411、4811、72h,每孔加入2mg/ml的MTT溶液50 μ 1,繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去上清液,每孔加入二甲基亞楓(DMSO) 150 μ 1,輕輕震蕩,IOmin后在490nm波長處用酶標儀測定吸光度值(OD值)。細胞抑制率(IR)=(對照組OD值-給藥組OD值/對照組OD值)X 100 %。結果顯示RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒對高表達α νβ 3的BxPC-3細胞株有明顯抑制作用,表明RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒通過整合素介導作用下具有靶向抗腫瘤的作用。

實施例3RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒在裸鼠種植瘤模型中的組織藥物濃度分布選取荷瘤裸鼠15只,隨機分為3組:GEM原藥組、BSANP-GEM組、RGD-BSANP-GEM組,采用尾靜脈注射,給藥量以GEM計,為GEM 90mg/kg。給藥后30min,處死裸鼠,分別取腫瘤組織、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、心臟、肌肉組織0.5cm*0.5cm,各兩塊。組織勻漿后,采用HPLC法對組織中吉西他濱的濃度進行檢測。色譜條件::色譜柱:Phenomenex C18 (250mmX4.6mm,4 μ m);柱溫:4511C ;流動相:乙腈-0.1 %三氟乙酸溶液(3: 97, v/v);流速:1.0mL/min ;紫外檢測波長:268nm ;進樣量:100 μ L。藥物濃度分布表明,RGD-BSANP-GEM組在腫瘤組織中的濃度最高,達到155.734 μ g/g,且與原藥組相比,差別具有顯著性差異(P < 0.05)。BSANP-GEM組在腫瘤組織和胰腺組織中有較高的濃度,但與原藥組相比,差別沒有顯著統(tǒng)計學差異(P > 0.05)。結果表明RGD多肽可以增加藥物在腫瘤組織中的分布,提高對腫瘤的靶向性。
權利要求
1.一種整合素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,其特征在于,由吉西他濱原料藥、牛血清白蛋白BSA和RGD多肽以及注射用水、脫水劑、交聯(lián)劑和氫氧化鈉制成為包載吉西他濱的白蛋白納米粒靶向給藥系統(tǒng);其中,所述白蛋白其水溶液的濃度為2.5-3.0% (g/ml),R⑶多肽濃度為5mg/ml,白蛋白納米粒的濃度為15mg/ml ;脫水劑與白蛋白水溶液的體積比為2: 1-3:1 ;交聯(lián)劑與白蛋白的氨基摩爾比為50-100%,R⑶多肽與白蛋白納米粒體積比為10: I ;吉西他濱原料藥與白蛋白的質量比10-25%。
2.按權利要求1所述的整合素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,其特征在于,所述的脫水劑為無水乙醇。
3.按權利要求1所述的整合素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑,其特征在于,所述的交聯(lián)劑為戊二醛。
4.一種制備權利要求1-3任一項整合 素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑的制備方法,其特征在于,其包括步驟: (1)制備白蛋白納米粒: 配制3.0% BSA溶液,IM NaOH調節(jié)pH至8.5,攪拌下滴加無水乙醇,至藍色膠狀液形成,繼續(xù)攪拌,加入交聯(lián)劑戊二醛,繼續(xù)勻速攪拌,40°C低溫旋轉蒸發(fā)除去乙醇,過I μ m濾膜,剩余膠狀液12000rpm離心,除去上清,沉淀部分加蒸懼水復溶,得白蛋白納米粒混懸液; (2)制備RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒: 取RGD多肽置滅菌離心管中,雙蒸水試溶多肽,將溶解后的多肽吸回原管中,混勻,取雙蒸水繼續(xù)溶解多肽,混勻,使充分溶解,得濃度為10mg/ml多肽,將MBS用DMF溶為IOmg/ml,按MBS:白蛋白納米粒=I: 10的比例,向白蛋白納米粒溶液中加入MBS,攪拌混勻,室溫活化30分鐘后,再按白蛋白納米粒:多肽=I: 10的比例,加入溶解的多肽,混勻,室溫反應,PBS透析,PH7.2,4°C過夜,得RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒的混懸液;分別取多肽,加蒸餾水稀釋為5mg/ml,以及RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒混懸液;每支試管分別加入磷酸鹽EDTA溶液,設對照管,對照管加磷酸鹽EDTA溶液;再向每支試管中加入Ellman ‘s試劑,混勻,反應,測在412nm處的吸光值,計算待測肽自由巰基的濃度,計算偶聯(lián)率; (3)制備RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒: 采用吸附載藥法對RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒進行載藥,按10%載藥量計算投料,稱取吉西他濱,以純水配制成濃度為10mg/mL,加IM NaOH調節(jié)pH至8.5,加入純水后,用吉西他濱溶液將沉淀的RGD偶聯(lián)白蛋白納米?;鞈遥瑪嚢柽_吸附平衡,然后12000rpm離心制得載藥納米粒,用與原白蛋白溶液同體積的純水將載藥納米?;鞈液罄鋬龈稍?。
5.按權利要求4的方法,其特征在于,所述的RGD多肽由5個氨基酸首尾成環(huán)形成,其序列為-Arg1-Gly2-Asp3-D-Tyr4-Lys5-,同時RGD環(huán)肽上再連接一個半胱氨酸,與BSA的巰基連接。
6.按權利要求4的方法,其特征在于,所述的RGD偶聯(lián)白蛋白納米粒偶聯(lián)率為32%。
7.按權利要求4的方法,其特征在于,所述的RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米粒粒徑分布范圍94-166nm,平均粒徑為130nm,Zeta電位-30.77mV,包封率為92.16%,載藥量為12.8%,30min突釋率為53.25±2.23%,體外8小時累積釋放率為90%。
8.按權利要求4的方法,其特征在于,所述的RGD偶聯(lián)吉西他濱白蛋白納米?;鞈乙簽槿榘咨z狀溶液。
9.權利要求1的整合 素受體靶向型載藥白蛋白納米粒制劑在制備治療胰腺癌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)生技術領域,涉及一種整合素靶向型載藥白蛋白納米粒制劑及其制備方法。本發(fā)明由吉西他濱原料藥、牛血清白蛋白BSA和RGD多肽以及注射用水、脫水劑、交聯(lián)劑和氫氧化鈉制成包載吉西他濱的白蛋白納米粒靶向給藥系統(tǒng);所述載藥白蛋白納米粒分散性良好,粒徑分布范圍94-166nm,平均粒徑為130nm,Zeta電位-30.77mV,包封率為92.16%,載藥量為12.8%,30min突釋率為53.25±2.23%,體外8小時累積釋放率達到90%。經試驗證實,本發(fā)明的靶向納米粒能顯著提高藥物在靶部位的聚集,具有較好的緩釋性和腫瘤靶向性,能提高化療藥物的治療效果,并減輕化療藥物的毒副作用,提高患者對治療的耐受性。
文檔編號A61K47/42GK103239733SQ20121002928
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權日2012年2月9日
發(fā)明者虞先濬, 徐近, 吉順榮, 王浩, 龍江, 劉辰, 張波, 徐永鋒, 姚宛彤, 許文彥 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院
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