專利名稱：人ctla-4抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子免疫學(xué)和人類疾病的治療。本發(fā)明尤其涉及新型抗人CTLA-4的人序列抗體以及應(yīng)用這些抗體治療人類疾病、感染的方法。發(fā)明背景 脊椎動物免疫系統(tǒng)需要多種信號才能獲得最佳的免疫活化，參見，例如Janeway，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54 :1-14(1989) ；Paul William E 主編，RavenPress, N. Y. , Fundamental Immunology, 4th edition (1998),特別是第 12 和 13 章,411-478頁。T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)和抗原呈遞細(xì)胞(APC)間的相互作用對免疫應(yīng)答是必需的。許多在T細(xì)胞和APC上發(fā)現(xiàn)的內(nèi)聚分子的水平在免疫應(yīng)答過程中增加(Springer等，A. Rev.Immunol. 5 :223-252 (1987) ；Shaw 和 Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Kindt和 Long 主編，1 :92-97(1988)) ；Hemler, Immunology Today 9 :109-113(1988))。這些分子水平的增加可幫助解釋為什么活化的APC比休眠的APC在刺激抗原特異的T細(xì)胞增殖更有效(Kaiuchi 等，J. Tmmuno 1. 131 :109-114(1983) ； Kreiger 等，J. Tmmuno 1. 135 2937-2945(1985) ；McKenzie, J. Immunol. 141 :2907-2911(1988)；和 Hawrylowicz 和Unanue,J. Tmmuno1. 141 :4083-4088(1988))。T細(xì)胞免疫應(yīng)答是一個復(fù)雜過程，它包含細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用(Springer等，A. Rev. Immunol. 5 :223-252 (1987))，尤其是T細(xì)胞和佐細(xì)胞如APC間的相互作用，以及可溶性免疫介質(zhì)(細(xì)胞因子或淋巴因子)的產(chǎn)生(Dinarello (1987) ,New Engl. Jour. Med 317 940-945 ；Sallusto (1997), J. Exp. Med. 179 :1109-1118)。這種應(yīng)答受到幾種 T 細(xì)胞表面受體的調(diào)節(jié)，包括T-細(xì)胞受體復(fù)合體(Weiss (1986)，Ann. Rev. Immunol. 4 :593-619)和其他“附屬”表面分子(Allison (1994), Curr. Opin. Tmmuno1. 6 :414-419 ;Springer (1987),同上)。許多附屬分子是自然產(chǎn)生的細(xì)胞表面分化(CD)抗原，這些CD抗原由細(xì)胞表面的單克隆抗體的反應(yīng)性所定義(McMichael 主編，Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press,Oxford, N. Y. (1987))。早期研究暗示B淋巴細(xì)胞活化需要兩種信號(Bretscher (1970), Science 169 1042-1049)，現(xiàn)在認(rèn)為所有淋巴細(xì)胞的最佳活化都需要兩種信號，一種是抗原特異或克隆信號以及第二種抗原非特異信號(Janeway,同上)。Freeman (Freeman (1989),J. Immunol. 143 :2714-2722)分離出了編碼B細(xì)胞活化抗原的cDNA克隆并進(jìn)行了測序，該活化抗原被 MAb B7 識別(Freeman(1987), J. Immunol. 138 :3260) 用這種 cDNA 轉(zhuǎn)染的COS 細(xì)胞已顯不被兩種標(biāo)記的 MAbB7 和 MAb BB-I 染色(Clark(1986), Human Immunol. 16 100-113 ;Yokochi(1981), J. Immunol. 128:823 ；Freeman 等(1989)，同上；Freeman 等(1987),同上)。此外,這種抗原的表達(dá)已在其他譜系的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn),如單核細(xì)胞(Freeman等，同上)。T輔助細(xì)胞(Th)抗原應(yīng)答需要由APC提供的信號。第一個信號由T細(xì)胞受體復(fù)合體(Weiss, J. Clin. Invest. 86 :1015(1990))與抗原的相互作用啟動，該抗原在APC上II型主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的情況下呈現(xiàn)(Allen, Immunol. Today 8 :270(1987))。這種抗原特異的信號不夠產(chǎn)生完全反應(yīng)，并且在缺少第二種信號時實際可導(dǎo)致克隆失活或無細(xì)胞免疫反應(yīng)性(Schwartz，Science 248:1349(1990))。在許多實驗系統(tǒng)中都已經(jīng)要求 MHC 提供第二種共刺激信號(Schwartz,同上；Weaver 和 Unanue, TmmunoI. Today 11 49(1990)) o盡管在有些情況下清楚可溶性分子如白介素(IL)-I (Weaver和Unanue,同上)和參與細(xì)胞間粘連的膜受體(Springer，Nature 346 :425(1990))都能提供共刺激信號，但這個第二種信號的分子本性并未完全了解。⑶28抗原為一種免疫球蛋白超家族中同型二聚體糖蛋白(Aruffo和Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :8573-8577 (1987))，是一種在大多數(shù)成熟人T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的附屬分子(Damle等,J. Immunol. 131 :2296-2300(1983)) 現(xiàn)時證據(jù)暗示這種分子在可選擇的T細(xì)胞活化途徑中的功能與由T細(xì)胞受體復(fù)合體啟動的分子功能有明顯區(qū)別(June等，Mol.Cell. Biol. 7 :4472-4481 (1987))。與CD28抗原相反應(yīng)的單克隆抗體(MAb)能增加由各種多克隆刺激物啟動的T細(xì)胞應(yīng)答(由June等，同上綜述)。MAb誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子(Thompson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 86 :1333-1337 (1989);和 Lindsten 等，Science 244 339-343(1989))可造成這些刺激作用，原因是增加了 mRNA的穩(wěn)定性(Lindsten等(1989)，同上)。抗⑶28 MAb也能具有抑制作用，即它們能阻斷自身的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Damle等，Proc. Natl. Acad. Sci. 78 :5096-6001(1981))和抗原特異 T 細(xì)胞克隆的活化(Lesslauer等，Eur. J. Immunol. 16 :1289-1296 (1986))?！┭芯勘砻鳍?8是B細(xì)胞活化抗原B7/BB-1的反受體(Linsley等,Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87 =5031-5035 (1990)) B7/BB-1 抗原下簡稱 “B7 抗原”。B7 配體也是免疫球蛋白的超家族的成員，但與CD28對照，B7配體在細(xì)胞外區(qū)域有兩個Ig結(jié)構(gòu)域，N端可變區(qū)(V)-樣結(jié)構(gòu)域后跟著恒定區(qū)(C)-樣結(jié)構(gòu)域。將非特異共刺激信號傳遞給T細(xì)胞至少需要兩個在APC上發(fā)現(xiàn)的同源性B7家族成員，即B7-1 (又稱B7，B7. I或CD80)和B7-2 (又稱B7. 2或⑶86)，這兩種B7都能通過CD28將共刺激信傳遞給T細(xì)胞。通過CD28共刺激促進(jìn)了 T細(xì)胞活化。通過遺傳融合B7抗原和⑶28受體的胞外部分，以及免疫球蛋白(Ig)C. I(重鏈恒定區(qū))，已表征了 CD28和B7抗原間相互作用的特征(Linsley等，J. Exp. Med. 173 721-730 (1991))。固定化的B7Ig融合蛋白以及B7陽性CHO細(xì)胞都已顯示共刺激T細(xì)胞增殖。以B7陽性CHO細(xì)胞刺激T細(xì)胞也特異性地刺激了 IL_2轉(zhuǎn)錄物水平的增加。另外的研究已表明抗CD28MAb在某些T細(xì)胞白血病細(xì)胞系中能抑制通過與B細(xì)胞白血病系間的細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-2 (Kohno 等，Cell. Immunol. 131 :1-10(1990))。0)28具有單一胞外可變區(qū)(V)-樣結(jié)構(gòu)域(Aruffo和Seed,同上)。同源分子CTLA-4已由鼠細(xì)胞溶解T細(xì)胞cDNA庫示差篩選進(jìn)行了鑒定(Brunet (1987)，Nature 328 267-270)。CTLA-4為一種T細(xì)胞表面分子，原先已由鼠細(xì)胞溶解T細(xì)胞cDNA庫示差篩選進(jìn)行了鑒定(Brunet (1987), Nature 328:267-270)。CTLA-4 也是免疫球蛋白(Ig)超家族的一員，含有單一胞外Ig結(jié)構(gòu)域。CTLA-4轉(zhuǎn)錄物已在帶有細(xì)胞毒活性的T細(xì)胞種群中發(fā)現(xiàn)，這暗示CTLA-4在細(xì)胞溶解反應(yīng)中可能發(fā)揮作用(Brunet等，同上；Brunet等，Immunol. Rev. 103 :21-36 (1988))。研究者已經(jīng)報道了人類CTLA-4對應(yīng)物的基因作圖和克隆(Dariavach 等，Eur. J. Immunol. 18 :1901-1905 (1988)),如同 CD28 定位在相同的染色體區(qū)域(2q33_34) (Lafage-Pochitaloff 等，Immunogenetics 31:198-201(1990))。人CTLA-4DNA和編碼⑶28蛋白基因間的序列對比揭示了序列極其明顯的同源性，并在近膜和胞質(zhì)區(qū)域有最大程度的同源性(Brunet等，1988,同上；Dariavach等，1988,同上)。一些研究暗示CTLA-4具有二級共刺激物類似的功能(Linsley等，J. Exp.Med. 176 :1595-1604(1992) ;Wu 等，J. Exp. Med. 185:1327-1335(1997) ；Lindsley, P.等，美國專利號 5，977，318 ; 5，968，510 ; 5，885，796 ;和 5，885，579)。但是其他研究報道了 CTLA-4是 T 細(xì)胞活化的衰減因子，具有反作用(Krummel (1995), J. Exp. Med. 182 :459-465 ；KrummeI 等，Int' I Immunol. 8 :519-523 (1996) ;Chambers 等，Immunity. 7 :885-895 (1997))。有報 道CTLA-4缺失的小鼠遭受大量的淋巴增殖(Chambers等，同上)。有報道封閉CTLA-4能增強體外和體內(nèi)的 T 細(xì)胞應(yīng)答(Walunas 等，Immunity. I :405-413 (1994) ；Kearney (1995),J. Immunol. 155 :1032-1036)，惡化抗腫瘤免疫(Leach (1996)，Science. 271 :1734-1736)以及提高誘導(dǎo)的自身免疫疾病(Luhder (1998)，J. Exp. Med. 187 =427-432)。還有報道CTLA-4對T細(xì)胞免疫應(yīng)答的初始特性有選擇性的或額外的影響(Chambers (1997)，Curr. Opin.Immunol. 9 :396-404 ;BIuestone(1997), J.Immunol. 158 :1989-1993 ;Thompson(1997),Immunity 7:445-450)。這與觀察到的現(xiàn)象一致，即一些自身免疫病人含有針對CTLA-4的自身抗體。這可能CTLA-4封閉抗體在這些病人中有致病作用(Matsui (1999)，J. Tmmun01. 162 :4328-4335)。非人類CTLA-4抗體已經(jīng)應(yīng)用在上述討論的各種研究中。然而開發(fā)抗體在人體內(nèi)治療和診斷應(yīng)用所面臨的主要障礙之一是非人類免疫球蛋白內(nèi)在的免疫原性。例如，當(dāng)具有免疫能力的病人施用嚙齒類動物單克隆抗體的治療劑量時，病人則產(chǎn)生抗嚙齒類動物免疫球蛋白序列的抗體，這些人類抗小鼠抗體(HAMA)中和了治療抗體并能引發(fā)急性毒性。以前抗體的這些和其他缺陷由本發(fā)明提供的針對CTLA-4的人抗體所克服。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種人序列抗體，其能特異性地結(jié)合到人CTLA-4上，以及提供了一種能特異性地結(jié)合到CTLA-4上的人序列抗體，該抗體基本沒有非免疫球蛋白相關(guān)人類蛋白。在相關(guān)方面，本發(fā)明也提供了一種有療效的人類序列抗體，其特異性地結(jié)合到人CTLA-4上。在一些實施方案中，治療有效的人類序列抗體結(jié)合到位于正常人T細(xì)胞細(xì)胞表面的CTLA-4上。在其他實施方案中，由⑶抗原⑶4、⑶8、⑶25和⑶69標(biāo)記的T細(xì)胞亞種群在施用有療效的人類序列抗體過程中和施用后都保持穩(wěn)定。在其他實施方案中，有療效的人類序列抗體在正常人T細(xì)胞的細(xì)胞表面上結(jié)合CTLA-4。在其他實施方案中，人序列抗體在病人中耐受性良好。在相關(guān)實施方案中。
還提供了多克隆抗體的組合物，其包含多個能特異性地結(jié)合到人CTLA-4的人類序列抗體。多克隆抗體組合物至少包括約2、5、10、50、100、500或1000個能特異性地結(jié)合到人CTLA-4的不同人類序列抗體。本發(fā)明還提供了能特異性地結(jié)合到人CTLA-4上的人類序列抗體，這些抗體阻斷人CTLA-4與人B7的結(jié)合或不阻斷人CTLA-4與人B7的結(jié)合。本發(fā)明還提供了結(jié)合到人CTLA-4上的人類序列抗體，其平衡締合常數(shù)(Ka)至少為IO8M'還提供了結(jié)合到人CTLA-4上的人類序列抗體，其平衡締合常數(shù)(Ka)至少為IO9M'本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合到人CTLA-4上的人類序列抗體，該抗體阻斷了人CTLA-4 與人 B7 的結(jié)合，至少阻斷約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或 100%。

本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合到人CTLA-4上的人類序列抗體，該抗體含有IgG或IgM的抗體重鏈。IgG抗體重鏈能是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中抗體輕鏈?zhǔn)荎輕鏈。人類序列抗體能由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸含有如在SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :23中分別闡述的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸含有如在SEQ ID N0:16和SEQ ID NO :6中分別闡述的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸含有如在SEQ ID N0:18和SEQ ID NO :8中分別闡述的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸含有如在SEQ ID N0:22和SEQ ID NO :12中分別闡述的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列編碼，這些氨基酸序列分別在SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 7中闡述。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列編碼，這些氨基酸序列分別在SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 9中闡述。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列編碼，這些氨基酸序列分別在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 13中闡述。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸分別含有來自V基因區(qū)段VH 3-30. 3和VK A-27可變的重鏈和輕鏈序列。本發(fā)明還提供了人類序列抗體，其中人類序列抗體由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，這些核酸分別含有來自V基因區(qū)段VH 3-33和VK L-15可變的重鏈和輕鏈序列。本發(fā)明的一些人類序列抗體包含重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列，分別是SYTMH (SEQID NO 27), FISYDGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO 32)和 TGWLGPFDY(SEQ ID NO :37)，以及輕鏈CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 RASQSVGSSYLA (SEQ ID NO 24)，GAFSRAT (SEQ ID NO 29)和 QQYGSSPWT(SEQ ID NO 35)。
本發(fā)明的一些人類序列抗體包含重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列，分別是SYTMH (SEQID NO 27), FISYDGSNKHYADSVKG(SEQ ID NO 33)和 TGWLGPFDY(SEQ ID NO :37)，以及輕鏈CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 RASQSVSSSFLA (SEQ ID NO 25)，GASSRAT (SEQ ID NO 30)和 QQYGSSPWT(SEQ ID NO 35)。本發(fā)明的一些人類序列抗體包含重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列，分別是SYGMH (SEQID NO 28), VIffYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO 34)和 APNYIGAFDV(SEQ ID NO 38)，以及輕鏈CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 RASQGISSWLA (SEQ ID NO :26)，AASSLQS (SEQ ID NO 31)和QQYNSYPPT(SEQ ID NO 36)。本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合到人CTLA-4的人類序列抗體，其中所述人類序列抗體由轉(zhuǎn)基因的非人類動物生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因非人類動物能是小鼠。本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合到人CTLA-4的人類序列抗體，該抗體是Fab片段。
本發(fā)明還提供了多價復(fù)合物,其至少含有兩種人類序列抗體,每一種抗體特異性地結(jié)合到人CTLA-4。兩種不同抗體能相互共價連接或非共價連接。本發(fā)明提供了核酸，其編碼人類序列抗體重鏈。該核酸能包含如SEQ ID N0:1中所闡述的核苷酸序列。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人類動物，其具有的基因組包含人類序列重鏈轉(zhuǎn)基因和人類序列輕鏈轉(zhuǎn)基因，該動物已用人CTLA-4或其片段或類似物免疫，由此該動物表達(dá)針對人CTLA-4的人類序列抗體。轉(zhuǎn)基因非人類動物能是轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠能包含HCo7或HCol2。本發(fā)明提供了一個雜交瘤細(xì)胞系，其包括從具有基因組的轉(zhuǎn)基因非人類動物獲得的B細(xì)胞，該基因組含有人類序列重鏈轉(zhuǎn)基因和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因，其中該雜交瘤生產(chǎn)特異性結(jié)合到人CTLA-4的人類序列抗體。在一個相關(guān)的實施方案中，雜交瘤分泌人類序列抗體，該抗體特異性結(jié)合人CTLA-4或結(jié)合其片段，其中抗體選自人類序列抗體，其包含重鏈 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 SYTMH(SEQ ID NO 27)，F(xiàn)ISYDGNNKYYADSVKG (SEQID NO 32)和 TGffLGPFDY(SEQ ID NO :37)，和輕鏈 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是RASQSVGSSYLA(SEQ ID NO :24)，GAFSRAT(SEQ ID NO :29)和 QQYGSSPWT(SEQ ID NO:35)，以及重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，如分別在SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :7中闡述；人類序列抗體，其包含重鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列，分別是SYTMH (SEQ ID NO27)，F(xiàn)ISYDGSNKHYADSVKG (SEQ ID NO :33)和 TGffLGPFDY (SEQ ID NO :37)，和輕鏈 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 RASQSVSSSFLA (SEQ ID NO :25)，GASSRAT (SEQ ID NO :30)和QQYGSSPffT (SEQ ID NO :35)，以及重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，如分別在SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 9中闡述；或權(quán)利要求I的人類序列抗體，其包含重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列，分別是 SYGMH (SEQ ID NO 28), VIffYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 34)和 APNYIGAFDV (SEQID NO :38)，和輕鏈 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列，分別是 RASQGISSffLA(SEQ ID NO 26)，AASSLQS (SEQ ID NO 31)和QQYNSYPPT (SEQ ID NO :36)，以及重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，如分別在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 13中闡述。本發(fā)明提供含有人類序列抗體和可藥用載體的藥物組合物，該抗體特異性地結(jié)合到人CTLA-4。該藥物組合物能進(jìn)一步包含一種作用物，其能有效誘導(dǎo)抗目的抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了化療劑。此外還提供了針對免疫抑制分子的抗體。
本發(fā)明提供了一種方法用于對病人抗原的誘導(dǎo)、增強或延長免疫應(yīng)答，包括給病人施用有效量的特異性結(jié)合到人CTLA-4的人類序列抗體，其中抗體阻斷人CTLA-4結(jié)合到人B7上?？乖苁悄[瘤抗原，或來自病原體。腫瘤抗原也能是端粒酶。病原體能是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲。病原體還能是愛滋病病毒。該方法進(jìn)一步包括給病人施用抗原或其片段或類似物，由此抗原與人類序列抗體組合誘導(dǎo)、增強或延長免疫應(yīng)答。該抗原能是病人腫瘤抗原或淀粉狀蛋白群系的一個組份，如病人患老年性癡呆以及其抗原為AB肽。該方法能進(jìn)一步包括給病人施用細(xì)胞因子。本發(fā)明提供了在病人體內(nèi)抑制免疫應(yīng)答的方法，包括給病人施用有效量的多價制齊U，該制劑至少含有兩種相互連接針對人CTLA-4的人類序列抗體。本發(fā)明還提供了在病人體內(nèi)抑制免疫應(yīng)答的方法，包括給病人施用有效量的多克隆制劑，該制劑至少含有兩種針對人CTLA-4的人類序列抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的或重組的人類序列抗體和人單克隆抗體，這些抗體特異性結(jié)合到人CTLA-4，以及提供了含有一種或一組這種抗體的組合物。本發(fā)明的一些人 類序列抗體具有下列一些特征高親和性地結(jié)合到人CTLA-4上，和/或阻斷人CTLA-4與其配體、人B7-1和B7-2分子的相互作用。相應(yīng)地，本發(fā)明的人類序列抗體和人單克隆抗體能用作體內(nèi)和體外的診斷和治療劑。本發(fā)明的人類序列抗體能包括多種抗體同型或其混合物，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE。通常它們包括 IgGl (如 IgGlk)和 IgM 同型。人類序列抗體能是全長(如IgGl或IgG4抗體)或僅包括抗原結(jié)合部分(如Fab、F(ab) ' 2、Fv或單一鏈Fv片段)。這些人類序列抗體是重組人類序列抗體。一些人類序列抗體由雜交瘤生產(chǎn)，該雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中所獲得的B細(xì)胞，其攜帶一個包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。該雜交瘤的制備是將B細(xì)胞融合到一個無限增殖化細(xì)胞中。一些本發(fā)明的人類序列抗體由雜交瘤生產(chǎn)，這些雜交瘤指4C8、4E10、4E10.5、5A8、5C4、5C4. I.3、5D7、5D7.1、5E10、5E10. 12、5G1、5G1. 4、6A10、6C9、6C9. 6、6D9、6D9. 7、6G4、7E4、7E4. 4、7E6、7H8、8E8、8E8. 4、8F8、8F8. 19、8H1、9810、9A10. 1、9B9、9C1、9G5、105BU0B5. 8、10B9、10B9. 2、10D1、10D1. 3、10E11、10E4、10E4. 5、11B4、11D10、11E4、11E4. I、11E8、11F10、11F11、11F9、11G1、11G1. 5、1C7、1H8. 8、2A7、2A7. 6、2E2、2E2. 7、2E7、2E7. 2、2GU2G1. 2、3C12、3E10、3E10. 5、3E6、3E6. 0、3F10、4A1、4B6 和 4B6. 12。小數(shù)點后的尾標(biāo)表示同種雜交瘤細(xì)胞系的不同克隆分離群。本發(fā)明的一些人類序列抗人CTLA-4抗體能夠具有下列一個或多個特性a)對人CTLA-4的特異性(特異性地結(jié)合到人CTLA-4上)；b)對人CTLA-4結(jié)合親和性，平衡締合常數(shù)(Ka)至少為約IO7M'或約IO9M'或約IO10M-1到IO11M-1或更高；c)動力學(xué)締合常數(shù)(ka)至少為約103，約IO4或約10VV1 ;和/或，d)動力學(xué)解離常數(shù)(kd)至少為約103，約IO4,或約 IO5HT1 s'在另一方面，本發(fā)明提供了核酸分子，其編碼本發(fā)明的人類序列抗體或抗原結(jié)合部分。相應(yīng)地，如通過培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞制備本發(fā)明抗體的方法包括在本發(fā)明中一樣，重組表達(dá)載體和用這些載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞也包括在本發(fā)明中，重組表達(dá)載體包括本發(fā)明編碼抗體的核酸。 仍然在另一方面，本發(fā)明從轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中提供了分離的B細(xì)胞，這些B細(xì)胞能表達(dá)特異性地結(jié)合到人CTLA-4上單克隆抗體的多種同型Ig (如IgG、IgA和/或IgM)。分離的B細(xì)胞能從轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得，該小鼠已用純化的或富集的人CTLA-4抗原(或其抗原片段)制劑和/或表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞免疫。轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶一基因組，該基因組含有人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。分離的B細(xì)胞能無限化增殖從而提供針對人CTLA-4的人類單克隆抗體源(如雜交瘤)。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了雜交瘤，該雜交瘤能生產(chǎn)特異性結(jié)合到人CTLA-4上的人單克隆抗體。該雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中所獲得的B細(xì)胞，其攜帶一個包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，該基因組融合到一個無限增殖化的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因非人類動物能用純化的或富集的人CTLA-4抗原制劑和/或表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞免疫從而生成產(chǎn)抗體的雜交瘤。仍在另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達(dá)特異性地結(jié)合到人CTLA-4上的人單克隆抗體(本發(fā)明又稱為“HuMAb-小鼠 ”)。轉(zhuǎn)基因非人類動物能是轉(zhuǎn)基因小鼠，其攜帶一個包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。轉(zhuǎn)基因非人類動物能用純化的或富集的人CTLA-4抗原(或其抗原片段)制劑和/或表達(dá)人CTLA-4的細(xì) 胞免疫。轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)V-D-J重組和同型轉(zhuǎn)換能生產(chǎn)多種抗人CTLA-4人單克隆抗體的同型Ig(如IgG、IgA和/或IgM)。同型轉(zhuǎn)換可如通過經(jīng)典或非經(jīng)典同型轉(zhuǎn)換發(fā)生。在另一方面，本發(fā)明提供了用于人類序列抗體和人序列單克隆抗體的方法，這些抗體特異性地與人CTLA-4反應(yīng)。本發(fā)明的一些方法包括用純化的或富集的人CTLA-4抗原制劑和/或表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞免疫轉(zhuǎn)基因非人類動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠，該動物攜帶一個包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。然后能獲得該動物的B細(xì)胞(如脾B細(xì)胞)并與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而形成無限增殖化的雜交瘤細(xì)胞，該細(xì)胞分泌抗人CTLA-4的人單克隆抗體。本發(fā)明的抗人CTLA-4單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(如Fab)能夠衍生出或連接到另一個功能分子上，如另一個肽或蛋白(如Fab'片段)。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分功能性地連接到一個或多個其他分子實體上(如通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價締合或其他連接方法)。例如，人序列抗CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分能夠結(jié)合到治療組成成分上，如細(xì)胞毒性藥物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌藥。本發(fā)明的抗體能結(jié)合到細(xì)胞毒性的藥物上，如用細(xì)胞毒性劑進(jìn)行了放射性標(biāo)記，如mI (如，Shen (1997)等，Cancer 80(12Suppl) :2553-2557)，Cu_67 (如，Deshpande (1988)等，J. Nucl. Med. 29 :217-225)或如結(jié)合到核糖體失活蛋白 gelonin 上(如，Boyle (1996) J. ofImmunol. 18 :221-230 等)。在另一方面，本發(fā)明提供了組合物如藥物和診斷組合物，包括可藥用載體和本發(fā)明至少一個人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，這種抗體或抗原結(jié)合部分能特異性地結(jié)合到人CTLA-4上。一些組合物含有一組人類序列抗體或其抗原結(jié)合部分，每一種該抗體或抗原結(jié)合部分優(yōu)選地結(jié)合到截然不同的表位上。組合物如藥物組合物含有本發(fā)明一組至少一種人類序列抗體，或至少一種人單克隆抗體，或它們的抗原結(jié)合部分，以及本發(fā)明至少一個雙特異性或多特異性分子也都包含在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。對體內(nèi)方法，抗體或其抗原結(jié)合部分(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子)能夠給被試病人施用，該病人患有T細(xì)胞相關(guān)疾病或患有通過增強或抑制或延長免疫應(yīng)答可改善或預(yù)防的疾病。本發(fā)明的人序列單克隆抗體和人類序列抗體組合物能與其他已知的治療組合施用，如抗癌治療。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于治療被試病人癌癥的方法，包括給被試者一起施用治療有效量的人類序列抗體的藥物組合物和藥用載體。這樣一些方法包括疫苗。這樣一些方法包括腫瘤細(xì)胞疫苗，GM-CSF修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，或裝載抗原的樹突細(xì)胞疫苗。在這樣一些方法中，癌癥是前列腺癌、黑素瘤或上皮癌。針對人CTLA-4的人類序列抗體能用在需要刺激免疫應(yīng)答或抑制的治療方法中。前者適應(yīng)癥使用阻斷人CTLA-4結(jié)合到人B7上的抗體進(jìn)行治療。采用刺激、增強或延長免疫應(yīng)答可適合治療的疾病包括癌癥如前列腺癌、腎癌和結(jié)腸癌，致病感染；與自身抗原相關(guān)的疾病如產(chǎn)生淀粉狀蛋白的疾病包括老年性癡呆病以及帶有炎癥和過敏成分的疾病。使用多價制劑獲得免疫抑制，該制劑至少含有兩個相互連接的針對人CTLA-4的不同抗體。適合治療的疾病包括移植物對宿主排斥反應(yīng)疾病、宿主對移植物排斥反應(yīng)疾病、自身免疫病和炎癥。 仍在另一方面，本發(fā)明提供了體外或體內(nèi)檢測樣品中是否存在人CTLA-4抗原的方法，如診斷人CTLA-4相關(guān)疾病。在一些方法中，與對照樣品一起，將待測樣品和本發(fā)明的人序列抗體或人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分(或者雙特異性或多特異性分子)相接觸，在允許抗體和人CTLA-4間形成復(fù)合體的條件下，可獲得診斷結(jié)果。隨后在兩樣品中檢測復(fù)合物的形成(如使用ELISA方法)，在復(fù)合物形成方面樣品間統(tǒng)計學(xué)上的明顯差別是測試樣品中是否存在人CTLA-4抗原的指征。參照說明書剩余部分、附圖和權(quán)利要求可進(jìn)一步理解本發(fā)明特點和優(yōu)勢。所有在此引用的出版物、附圖、GenBank登記參考(序列)、ATCC保藏、專利和專利申請為全部目的據(jù)此特別引作參考，如同每一個是單個弓I用，程度相同。附圖簡述圖I不意描述了一個neo彈夾革巴向插入到U I外顯子的Sma I位點。

圖1A)為ii基因座基因組結(jié)構(gòu)的示意圖。填充框代表U外顯子；圖1B)為CmD靶向載體的示意圖。點線表不包含在構(gòu)建體中的基因組y序列。質(zhì)粒序列未顯不；圖1C)為祀u基因座的不意圖，其中neo彈夾已插入到Ul中。右下方框表示了靶向構(gòu)建體和U基因座間同源性重組的RFLP診斷。RFLP使用探針A由Southern印跡雜交檢測，915bp的Sac I片段在圖IC中表不。圖2顯示了實驗結(jié)果，說明可溶性抗人CTLA-4人類序列抗體抑制了重組可溶性人CTLA-4結(jié)合到表達(dá)小鼠B7. I的細(xì)胞上，如下詳述。圖3顯示了競爭性結(jié)合分析結(jié)果，這些分析用來鑒定本發(fā)明的人類序列抗體，這些抗體識別在人CTLA-4上的非重疊表位，如下詳述。圖4顯示了抗CTLA-4抗體10D1. 3的重鏈和輕鏈片段的一級核苷酸序列數(shù)據(jù)。圖5顯示了抗人CTLA-4抗體的輕鏈可變區(qū)(Vk)的核苷酸序列。衍生自VKA_27種系序歹Ij (SEQ ID NO 4)的抗 CTLA-4 抗體 IODl (SEQ ID NO 6)和 4B6 (SEQ ID NO 8)描述在圖上方。衍生自VKL-15種系序列(SEQ ID NO 10)的抗CTLA-4抗體1E2 (SEQ ID NO:12)顯示在圖下方。三個抗CTLA-4抗體的Vk序列與它們的種系所編碼的Vk基因序列對bto互補決定殘基(OTR)標(biāo)記出來。破折號表不序列同一丨I"生。圖6顯示了抗人CTLA-4抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)的核苷酸序列。衍生自Vh 3-30. 3種系序歹 Ij (SEQ ID NO: 14)的抗 CTLA-4 抗體 IODl (SEQ ID NO 16)和 4B6 (SEQ ID NO: 18)描述在圖上方。衍生自Vh 3-33種系序列(SEQ ID NO 20)的抗CTLA-4抗體1E2 (SEQ IDNO 22)顯示在圖下方。三個抗CTLA-4抗體的Vh序列與它們的種系所編碼的序列并列。互補決定殘基(CTR)標(biāo)記出來。破折號表不序列同一丨I"生。圖7顯示所預(yù)測的抗人CTLA-4抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，并且顯示了預(yù)測的圖5描述的抗人CTLA-4抗體的氨基酸Vk序列。衍生自VKA-27種系序列(SEQ ID NO 5)的抗 CTLA-4 抗體 IODl (SEQ ID NO 7)和 4B6 (SEQ ID NO 9)描述在圖上方。衍生自 VKL_15種系序列(SEQ ID NO 11)的抗CTLA-4抗體1E2 (SEQ ID NO 13)顯示在圖下方。圖8顯示所預(yù)測的抗人CTLA-4抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列，并且顯示了預(yù)測的圖6描述的抗CTLA-4抗體的氨基酸Vh序列。衍生自Vh 3-30. 3種系序列(SEQ ID NO 15)的 抗 CTLA-4 抗體 IODl (SEQ IDNO 17)和 4B6 (SEQ ID NO 19)描述在圖上方。衍生自 Vh 3-33種系序列(SEQ ID NO 21)的抗CTLA-4抗體1E2 (SEQ ID NO 23)顯示在圖下方。圖9顯示了采用ELISA分析MAb IODl結(jié)合到重組人CTLA-4上的實驗結(jié)果。MAbIOD I以劑量依賴和飽和動力學(xué)方式結(jié)合到純化的重組CTLA-4上。圖10顯示了將IODl結(jié)合到CTLA-4表達(dá)性T細(xì)胞系上。這些數(shù)據(jù)顯示MAb IODl以劑量依賴和飽和動力學(xué)方式結(jié)合到表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞上。圖11顯示了抑制人B7. 2Ig結(jié)合到CTLA-4表達(dá)性T細(xì)胞上。這些數(shù)據(jù)顯示與對照人MAb相比，MAb IODl能有效阻斷B7. 2結(jié)合到CTLA-4上。圖12顯示了阻斷CTLA4-FITC結(jié)合到鼠B7. I表達(dá)性細(xì)胞上的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)顯示與對照人MAb相比，MAb IODl能有效阻斷CTLA-4結(jié)合到B7. I上。圖13顯示抗CTLA-4人MAb的競爭性ELISA，表明了表位組分類。圖14顯示了在PHA刺激的T細(xì)胞上的CTLA-4表達(dá)。在細(xì)胞表面活化的而不是休眠的T細(xì)胞表達(dá)CTLA-4水平低但可檢測到。圖15顯示了 MAb IODl在活化T細(xì)胞的補體依賴裂解中的結(jié)果。未觀察到PHA活化的T細(xì)胞的裂解。圖16顯示了 MAb IODl在活化T細(xì)胞的抗體依賴裂解中的結(jié)果。用IODl和單核細(xì)胞未觀察到PHA活化的T細(xì)胞的裂解。圖17顯示了抗IODl IgM和IgG在獼猴中的反應(yīng)，該猴用IODl抗體注射過。未觀察到明顯的針對IODl的抗體反應(yīng)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新型以抗體為基礎(chǔ)的療法用于治療和診斷疾病，這些疾病的特征在于表達(dá)尤其過表達(dá)，或活化尤其過活化人CTLA-4和/或相關(guān)分子。本發(fā)明療法采用人類序列抗體、人序列單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，這些抗體或抗原結(jié)合部分結(jié)合到表位上，該表位存在于人CTLA-4。這些人序列抗CTLA-4抗體能夠充當(dāng)功能性的拮抗物(如抑制CTLA-4結(jié)合配體的能力或抑制活化細(xì)胞的能力，如通過抑制其傳遞信號到細(xì)胞上的能力)或興奮劑(如刺激配體效應(yīng))。本發(fā)明的人類序列抗體能由非人類轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)，該動物經(jīng)過V-D-J重組和同型轉(zhuǎn)換能夠生產(chǎn)多種針對人CTLA-4的同型Ig (如IgG、IgA和/或IgE)人抗體(如單克隆或多克隆)。相應(yīng)地，本發(fā)明的各個方面包括抗體和抗體片段及其藥物組合物，以及非人類轉(zhuǎn)基因動物，B細(xì)胞和雜交瘤，用于制備這些單克隆抗體。使用本發(fā)明抗體檢測表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞或檢測相關(guān)交叉反應(yīng)的生長因子受體，或者使用抗體體外或體內(nèi)抑制表達(dá)人CTLA-4細(xì)胞的生長、分化和/或運動，上述這些方法都包含在本發(fā)明中。除非提示，術(shù)語“病人”或“被試者”交換使用，并指哺乳動物如人類病人和非人類靈長類動物以及實驗動物如兔子、大鼠和小鼠以及其他動物。術(shù)語“治療”包括施用本發(fā)明的化合物或作用物從而預(yù)防或拖延疾病癥狀、并發(fā)癥或生化指征的初起，緩解癥狀，或停滯或抑制疾病、狀況或失調(diào)(如自身免疫病)的進(jìn)一步發(fā)展。治療可以是預(yù)防的(以防止或拖延疾病的發(fā)作，或預(yù)防臨床現(xiàn)象或其亞臨床癥狀的出現(xiàn))或在表現(xiàn)疾病后治療性抑制或緩解癥狀。一般而言，短語“良好耐受”指的是在健康狀態(tài)下沒有不利變化，這些變化作為治療結(jié)果發(fā)生并影響治療決定。 術(shù)語“淋巴細(xì)胞”如本文所用，在本領(lǐng)域中有正常意思，指單核、非吞噬細(xì)胞白細(xì)胞的任一個，這些細(xì)胞在血液、淋巴和淋巴組織即B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。短語“T淋巴細(xì)胞亞群”或“T細(xì)胞亞組”指T淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞，這些細(xì)胞具有表達(dá)特定細(xì)胞表面標(biāo)記的特性(參見Barclay, A. N.等主編，1997, The Leukocyte AntigenFacts Book, 2nd edition, Academic Press, London, United Kingdom)。術(shù)語關(guān)于 T 細(xì)胞“穩(wěn)定”指的是這樣一種事實即T細(xì)胞亞組的出現(xiàn)頻率或百分比不隨施用作用物過程或延續(xù)時間而改變。術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 ”、“ CTLA-4 ”、“ CTLA4 ”、“ CTLA-4抗原”、“CD152” (參見如 Murata(1999)Am. J. Pathol. 155 :453-460)交換使用，并包括人 CTLA-4的變體、同種型(isoform)和種同源物，以及至少含有一個CTLA-4表位的類似物(參見如Balzano (1992)Int. J. Cancer SuppI. 7 :28-32)。人CTLA-4完整cDNA序列Genbank登記號L15006。氨基酸1-37區(qū)域為前導(dǎo)肽；38-161為胞外V-樣結(jié)構(gòu)域；162-187為跨膜結(jié)構(gòu)域；和188-223為胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。核苷酸的變體已有報道，包括在49位從G到A的轉(zhuǎn)換，在272位從C到T的轉(zhuǎn)換，在439位從A到G的轉(zhuǎn)換。小鼠CTLA-4的完整DNA序列EMBL登記號為X05719 (Brunet等(1987)，Nature328 =267-270)。氨基酸1-35區(qū)域為前導(dǎo)肽。人B7-1 (CD80)的完整DNA序列Genbank登記號為X60958 ;對小鼠序列登記號為X60958 ;對大鼠序列登記號為U05593。人B7_2 (CD86)的完整cDNA序列Genbank登記號為L25259 ;對小鼠序列登記號為L25606。編碼⑶28的基因已被廣泛表征。雞mRNA序列Genbank登記號為X67915。大鼠mRNA序列Genbank登記號為X55288。人mRNA序列Genbank登記號為J02988。小鼠mRNA序列Genbank登記號為M34536。術(shù)語“表位”意思是能特異性結(jié)合到抗體上的蛋白決定基。表位通常由化學(xué)活性表面定群分子組成，如氨基酸或糖側(cè)鏈，并通常含有特殊的三維結(jié)構(gòu)特征和特殊的電荷特征。構(gòu)象與非構(gòu)象表位區(qū)別在于當(dāng)存在變性溶劑時與前者而非后者的結(jié)合發(fā)生丟失。完整“抗體”至少包括由二硫鍵相內(nèi)聯(lián)的兩個重鏈(H)兩個輕鏈(L)。每個重鏈包括一個重鏈可變區(qū)(本發(fā)明縮寫為HCVR或VH)和一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括CH1、CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域。每個輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本發(fā)明縮寫為LCVR或VL)和一個輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括CL 一個結(jié)構(gòu)域。VH和VL區(qū)能進(jìn)一步細(xì)分成高變異度區(qū)，術(shù)語稱為互補決定區(qū)(CDR)，并用更保守區(qū)域點綴，術(shù)語稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，并按下列順序從氨基端到羧基端排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括各種免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)中的第一組份(Clq)。術(shù)語“抗體”包括完整抗體的抗原結(jié)合部分，這些部分保留有結(jié)合CTLA-4的能力。結(jié)合實例包括(i)Fab片段，為單價片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成；
(ii)F(ab’)2片段，為二價片段，由兩個在鉸鏈區(qū)通過二硫橋相連的Fab片段組成；(iii)Fd片段，由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；(iv) Fv片段，由單一抗體臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；(v) dAb片段(Ward等(1989)，Nature 341 :544-546)，由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(⑶R)。進(jìn)一步，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨基因編碼，這兩個結(jié)構(gòu)域能通過一合成接頭使用重組方法連接，該接頭能使它們制成單一蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)域配對 形成單價分子(已知為單鏈Fv (scFv);參見如Bird等(1988), Science 242 :423-426 ;和Huston 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。參考術(shù)語“抗體”包括這種單個鏈抗體。片段制備采用重組技術(shù)或完整抗體的酶法或化學(xué)法裂解。雙特異性抗體有兩個不同的結(jié)合專一性，參見如美國專利5，922，845和5,837,243 ；ZeiIder (1999)J. Immunol. 163 1246-1252 ；Somasundaram(1999)Hum.Antibodies 9 :47-54 ；Keler(1997)Cancer Res. 57 :4008_4014。例如，本發(fā)明提供了雙特異性抗體，該抗體具有細(xì)胞表面抗原如人CTLA-4的一個結(jié)合位點，以及第二個結(jié)合位點即效應(yīng)細(xì)胞表面上Fe受體的結(jié)合位點。本發(fā)明還提供了至少含有三個結(jié)合位點的多特異性抗體。術(shù)語“雙特異性抗體”進(jìn)一步包括diabodies。diabodies是二價雙特異性抗體,其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單個多肽鏈上表達(dá)，但使用接頭，接頭太短不允許相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對，由此逼迫結(jié)構(gòu)域與另一個鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見如 Holliger, P.等(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ;Poljak, R. J.等(1994), Structure 2:1121-1123)。術(shù)語“人類序列抗體”包括含有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)的抗體。本發(fā)明的人類序列抗體可包括不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如通過體外隨機誘變或位點特異性誘變誘導(dǎo)或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變誘導(dǎo)的突變)。然而，本發(fā)明所用的術(shù)語“人類序列抗體”意在不欲包括這樣的抗體，其中衍生自另一個哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人類構(gòu)架序列上(S卩，人源化抗體)。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一分子組合物的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物展示了對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。相應(yīng)地，術(shù)語“人單克隆抗體”是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，這些抗體含有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)。在一實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤生產(chǎn)，該雜交瘤包括了從轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細(xì)胞，該動物攜帶一個基因組，其包括了人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因，融合到無限增殖化細(xì)胞中。
術(shù)語“雙克隆抗體”是指至少兩種針對人CTLA-4抗體的制劑。典型地，指不同抗體結(jié)合不同表位。術(shù)語“寡克隆(oligoclonal)抗體”是指針對人CTLA-43-100種不同抗體的制劑。典型地，指在這種制劑中的抗體結(jié)合到一系列不同的表位上。術(shù)語“多克隆抗體”是指一種以上(兩種或更多種)針對人CTLA-4的不同抗體。這種制劑包括結(jié)合到一系列不同表位上的制劑。本發(fā)明提供了針對人CTLA-4的人類序列抗體，這些抗體阻斷或?qū)褂扇薈TLA-4受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號。為了抑制CTLA-4與人B7反受體的相互作用，這一些抗體能結(jié)合到人CTLA-4上的表位。因為人CTLA-4與人B7的相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)了一種信號，該信號引導(dǎo)了攜帶人CTLA-4受體的T細(xì)胞的失活，所以拮抗相互作用有效誘導(dǎo)、增強或延長了攜有人CTLA-4受體T細(xì)胞的活化，并由此延長或增強了免疫應(yīng)答。“封閉抗體”指一種能降低可溶性人CTLA-4與細(xì)胞所表達(dá)的人B7配體結(jié)合的抗體，在一些條件下降低至少10%、20%、30%、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、99 %或99. 9 %，這些條件是抗體結(jié)合位點與人CTLA-4 配體結(jié)合位點的比率大于I : 1，并且抗體濃度大于10_8M。其他抗體制劑有時亦稱為多價制劑，以在相同細(xì)胞上交聯(lián)多種人CTLA-4受體的方式結(jié)合到人CTLA-4上。受體的交聯(lián)對人CTLA-4結(jié)合到人B7上具有相同或相近作用。因此，受體的交聯(lián)有效地對抗人CTLA-4反應(yīng)，導(dǎo)致免疫抑制。交聯(lián)通過組合可溶性二價抗體也能實現(xiàn),該二價抗體具有不同表位的專一丨丨生。這些多克隆抗體制劑至少包括兩對重鏈和輕鏈，其與人CTLA-4上的不同表位相結(jié)合，因此免疫抑制信號能作為人CTLA-4交聯(lián)的結(jié)果轉(zhuǎn)導(dǎo)。術(shù)語“重組人抗體”包括本發(fā)明所有人序列抗體，這些抗體的制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離采用重組方法，如抗體分離自動物(如小鼠)，其對人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的(下列節(jié)I進(jìn)一步描述)；下列抗體抗體表達(dá)使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞，抗體分離自重組的組合人抗體文庫，或抗體制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離采用任何其他方法，其包含人免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列的剪接。這些重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)。然而這些抗體能置于體外誘變(或當(dāng)使用對人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動物時，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列當(dāng)衍生自或涉及人種系VH和VL序列時，不可在人抗體種系所有組成成分內(nèi)體內(nèi)自然存在?！爱愒纯贵w”定義涉及產(chǎn)該種抗體的轉(zhuǎn)基因非人類生物。該術(shù)語指一種抗體，具有氨基酸序列或編碼的核酸序列，此序列對應(yīng)于在生物中發(fā)現(xiàn)的序列，該生物不是轉(zhuǎn)基因非人類動物組成，并且一般不來自轉(zhuǎn)基因非人類的動物種。“異雜交抗體”是指含有不同生物起源的重鏈和輕鏈的抗體。例如，含有人重鏈與鼠輕鏈相連的抗體即是一個異雜交抗體。異雜交抗體的例子還包括如上討論的嵌合和人源化抗體。術(shù)語“基本純”或“分離的”意指一個目的物種(如本發(fā)明的抗體)已從其自然環(huán)境的組份中鑒定、分離和/或回收以至于該目的物種是存在的超優(yōu)勢種(即在組合物中以摩爾為基礎(chǔ)該種比其他任何個體種更豐富)；“基本純”或“分離的”組合物還意味著在所存在的所有大分子物種中目的物種包含了至少約50% (以摩爾為基礎(chǔ))。基本純或分離的組合物在所有存在于組合物中的大分子物種中也能含有超過約80-90 (wt.) %。分離的目的物種(如本發(fā)明的抗體)還能純化到具有本質(zhì)均一性(污染物種采用常規(guī)檢測方法在組合物中不能檢測到)，其中，組合物基本由單一大分子物種的衍生物組成。分離的針對人CTLA-4抗體能夠基本無其他抗體，這些其他抗體缺乏與人CTLA-4結(jié)合的能力，并且能夠結(jié)合到不同的抗原上。然而能特異性與人CTLA-4結(jié)合的表位、同種型或變體相結(jié)合的分離的抗體具有和其他相關(guān)抗原的交叉反應(yīng)性，如相關(guān)抗原來自其他物種(如CTLA-4物種同系物)。此夕卜，本發(fā)明的分離抗體基本上無其他細(xì)胞物質(zhì)(如非免疫球蛋白相關(guān)蛋白)和/或化學(xué)制劑?！疤禺愋越Y(jié)合”指抗體結(jié)合到一個預(yù)定抗原上。短語“特異性地(或選擇性地)結(jié)合”到抗體上指結(jié)合反應(yīng)，通過其確定在蛋白和其他生物制品的異源種群中是否存在該種蛋白。通?？贵w結(jié)合的締合常數(shù)(Ka)至少約IXlO6Ir1或IO7M'或約IO8IT1到IO9M'或約IOwM4到IO11M-1或更高，并且抗體結(jié)合到預(yù)定抗原的親和力比結(jié)合到非特異性抗原(如BSA，酪蛋白)的親和力至少高2倍，所述非特異性抗原不是預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本發(fā)明中與術(shù)語“特異性與抗原結(jié)合的抗體”交換使用。
當(dāng)指稱肽時，短語“特異性地結(jié)合”或“結(jié)合特異性地”意指一個肽分子，其含有中等或高度的與靶分子的結(jié)合親和力，這種結(jié)合是唯一或絕對占優(yōu)的。短語“特異性地結(jié)合至IJ”指結(jié)合反應(yīng)，通過其確定在蛋白和其他生物制品的異源種群中是否存在靶蛋白。因此，在指定分析條件下，指定的結(jié)合組成成分優(yōu)先地結(jié)合到一個特定靶蛋白上，并不以顯著量結(jié)合到存在于測試樣品中的其他組份上。在這種條件下與靶蛋白的特異性結(jié)合可能需要結(jié)合組成成分，該成分是根據(jù)對特定靶抗原的特異性來選擇的。各種分析形式可用于選擇配體，這些配體特異性地與特定蛋白反應(yīng)。例如，固相ELISA免疫分析、免疫沉淀、Biacore和Western印跡用于鑒定與CTLA-4特異性反應(yīng)的肽。通常特異性或選擇性的反應(yīng)將是背景信號或噪音的至少2倍，更通常地是背景的10倍以上。術(shù)語IgG抗體的“高親和性”指平衡締合常數(shù)(Ka)至少約IO7M'至少IO8M'至少約IO9M'至少約IOkT1,至少約IO11M-1或至少IO12M-1或更高，如最高達(dá)IO13M-1或IO14M^1或更高。然而“高親和性”結(jié)合能依據(jù)其他抗體同型Ig而發(fā)生變化。術(shù)語“Ka”，如本發(fā)明所使用，意欲指特定抗體抗原相互作用的平衡締合常數(shù)。此常數(shù)單位為1/M。術(shù)語“Kd”，如本發(fā)明所使用，意欲指特定抗體抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。此常數(shù)單位為M。術(shù)語“ka”，如本發(fā)明所使用，意欲指特定抗體抗原相互作用的動力學(xué)締合常數(shù)。此常數(shù)單位為1/Ms。術(shù)語“kd”，如本發(fā)明所使用，意欲指特定抗體抗原相互作用的動力學(xué)解離常數(shù)。此常數(shù)單位為1/s?！疤囟贵w抗原相互作用”是指實驗條件，在該條件下測定平衡常數(shù)和動力學(xué)常數(shù)?！巴虸g”指抗體類型(如IgM或IgGl)，其由重鏈恒定區(qū)基因編碼?！巴虸g轉(zhuǎn)換”指一種現(xiàn)象，即抗體類型或同型Ig從一種Ig類型轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N其他Ig類型。
“非轉(zhuǎn)換同型Ig”指同型Ig類型重鏈，當(dāng)同型Ig轉(zhuǎn)化不發(fā)生時則產(chǎn)生這種重鏈；編碼非轉(zhuǎn)化同型Ig的CH基因通常是位于功能性重排的VDJ基因的緊下游的第一個CH基因。同型Ig轉(zhuǎn)換已分類成經(jīng)典或非經(jīng)典同型Ig轉(zhuǎn)換。通過重組事件發(fā)生經(jīng)典同型Ig轉(zhuǎn)換，該事件在轉(zhuǎn)基因中至少涉及一種轉(zhuǎn)換序列區(qū)域。通過如人。u和人E u(8相關(guān)缺失)間同源重組可發(fā)生非經(jīng)典同型Ig轉(zhuǎn)換。在機理中，可選擇的非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機理如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組，可發(fā)生并實現(xiàn)同型轉(zhuǎn)換?！稗D(zhuǎn)換序列”指那些負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換重組的DNA序列?！稗D(zhuǎn)換供體”序列，通常是一個U轉(zhuǎn)換區(qū)，為在轉(zhuǎn)換重組過程中待缺失的構(gòu)建區(qū)域的5’端(即上游)?！稗D(zhuǎn)換受體”區(qū)介于待缺失構(gòu)建區(qū)和替代恒定區(qū)(如Y，￡等)之間。因為沒有總發(fā)生重組的特異性位點，最終基因序列通常不可從構(gòu)建體預(yù)測?！疤腔Ｊ健倍x為碳水化合物單元模式，這些模式單元共價連接到蛋白上，更具體地，連接到免疫球蛋白上。異源抗體的糖基化模式與自然發(fā)生在抗體上的糖基化模式比較具有基本相似特征，此抗體由非人類轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生，一個本領(lǐng)域的普通專業(yè)技術(shù)人 員將認(rèn)識到與衍生出轉(zhuǎn)基因的CH基因的物種中的糖基化模式比較，異源抗體的糖基化模式更相似于非人類轉(zhuǎn)基因動物物種中所述糖基化模式。術(shù)語“自然發(fā)生”如使用到物體上，指這樣一種事實即自然界中能發(fā)現(xiàn)的物體。例如生物(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列，其能從自然界源中分離出來，且未經(jīng)實驗室人為修飾，其即為自然發(fā)生的。術(shù)語“重排”指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)象，其中V區(qū)段在構(gòu)象中緊臨D-J或J區(qū)段，實際分別編碼完整VH或VL結(jié)構(gòu)域。重排的免疫球蛋白基因座能通過與種系DNA比較進(jìn)行鑒定，重排基因座至少具有一個重組的七聚體/九聚體同源元件。術(shù)語“未重排”或“種系構(gòu)象”關(guān)于V區(qū)段是指構(gòu)象，其中V區(qū)段未發(fā)生重組以使得緊臨D或J區(qū)段。術(shù)語“核酸”意包括DNA分子和RNA分子。核酸能是單鏈或雙鏈。術(shù)語“分離的核酸”，關(guān)于編碼與CTLA-4結(jié)合的抗體或抗體部分(如VH、VL和CDR3)的核酸，意指一種核酸，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼如下抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該抗體或抗體部分與除CTLA-4以外的抗原結(jié)合，而其他序列可自然分布在人基因組DNA核苷酸的側(cè)翼。SEQ ID Nos :4_23包括核苷酸序列和氨基酸序列，該序列含有本發(fā)明10D1、4B6和1E2人抗CTLA-4單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)。術(shù)語“基本相同”，在兩個核酸或多肽的情況下，當(dāng)進(jìn)行最大相符性序列對比排列時，指兩個或更多序列或亞序列，其至少具有約80%、約90%、約95%或更高核苷酸或氨基酸殘基同一性，如使用下列序列比較方法和/或通過肉眼檢查所測定。例如，本發(fā)明提供了含如下序列的核酸，所述序列與SEQ ID N0U SEQ ID NO :2基本相同。這種“基本相同”序列通常認(rèn)為是同源性的?！盎就恍浴贝嬖谟谥辽偌s50個殘基的序列區(qū)域上，也存在于至少約100個殘基的區(qū)域上，或存在于至少約150個殘基的區(qū)域上，或存在于待比較的兩個序列的全部長度上。如下所描述，任何兩個抗體序列通過使用在Kabat中的編號制只能以一種方式排列。因此，對抗體而言，百分同一性具有唯一且定義明確的含義。來自免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸分別指定為Hx和Lx，X為一個數(shù)，其根據(jù)Kabat編碼制標(biāo)明氨基酸位置，Kabat編碼制為免疫目的蛋白序列(NIH，Bethesda, MD，1987和1991)。Kabat列舉了每個亞組抗體的許多氨基酸序列，以及列舉了對那種亞組中每個殘基位置最經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸以便生成共有序列。Kabat使用了一種方法用于給所列舉序列中的每個氨基酸分派殘基號碼，這種給殘基分派號碼的方法已經(jīng)成為本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)。Kabat編碼制可適用其他抗體，但這些抗體不包括在他的綱要中，參照保守氨基酸將該抗體與Kabat的一種共有序列一起排列對比。使用Kabat編碼系統(tǒng)很容易鑒定不同抗體相等位置上的氨基酸。例如，人抗體L50位置上的氨基酸占住小鼠抗體氨基酸位置L50的對等位置上。同樣地，當(dāng)依據(jù)Kabat編號慣例排列由各自氨基酸編碼的氨基酸序列時，排列編碼抗體鏈的核酸。短語“選擇性地(或特異性地)雜交到”指當(dāng)序列存在于復(fù)合體混合物中(如，總細(xì)胞或文庫DNA或RNA)時，一個分子在嚴(yán)格雜交條件下與特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈體(duplex)或雜交，其中特定核苷酸序列至少在約10倍背景時檢測到。在一個實施方案中，通過其在嚴(yán)格條件下與已確定在本發(fā)明的范圍內(nèi)的核酸(如本發(fā)明所描述的作例證的序列)雜交的能力，能決定核酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)(如與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2基 本相同)。短語“嚴(yán)格雜交條件”指在本條件下探針將與其靶序列雜交，靶序列通常在核酸復(fù)合體的混合物中，但探針不與其他具有顯著量的序列雜交(正信號(如本發(fā)明核酸的鑒定)為約10倍背景雜交)。嚴(yán)格條件是序列依賴的，并在不同環(huán)境中各不相同。較長序列特定地在更高溫度下雜交。應(yīng)用廣泛的核酸雜交指南有如Sambrook主編，MOLE⑶LARCLONING A LABORATORY MANUAL(2nd ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory,(1989) !CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel 主編，John Wiley & Sons,Inc. , New York(1997) ；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULARBIOLOGY HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic AcidPreparation, Tijssen 主編,Elsevier, N. Y. (1993)。嚴(yán)格條件一般選為在限定的離子強度和pH下，比特異性序列的熱熔點(Tm)低約5-10°C。Tm是平衡時與靶基因互補的探針有50%雜交到靶序列上的溫度(在限定離子強度、PH和核酸濃度)(當(dāng)靶序列過量時，在Tm，平衡點有50%的探針)。嚴(yán)格條件通過將是鹽濃度小于約I. OM鈉離子，通常為約0. 01到I. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，pH7. 0-8. 3和溫度對短探針(如10-50核苷酸)至少約30°C以及對長探針至少約60°C (如大于50個核苷酸)。嚴(yán)格條件加入去穩(wěn)定劑如在Sambrook(下文引用)中所描述的甲酰胺也可獲得。對高度嚴(yán)格性雜交，陽性信號至少是2倍的背景，優(yōu)選為10倍背景雜交。作例證的高度嚴(yán)格性或嚴(yán)格雜交條件包括50%甲酰胺，5\330和1% SDS溫育在42°C或5XSSC和1% SDS溫育在65°C，并在0. 2X SSC和0. 1% SDS溫育在65°C下洗滌。對選擇性或特異性雜交，陽性信號(如本發(fā)明核酸鑒定)為約10倍的背景雜交。嚴(yán)格雜交條件用于在本發(fā)明范圍內(nèi)鑒定核酸，包括如在含有50%甲酰胺，5 X SSC和1% SDS的緩沖液中42°C雜交，或在含有50%甲酰胺，5 X SSC和1% SDS的緩沖液中65°C雜交，兩者皆用0. 2 X SSC和0. I % SDS在65°C下洗滌。在本發(fā)明中，含有本發(fā)明核酸的基因組DNA或cDNA在嚴(yán)格條件下使用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡和本文公開的核酸序列進(jìn)行鑒定。其他用于這種雜交(用來在本發(fā)明內(nèi)鑒定核酸)的嚴(yán)格條件包括那些在40%甲酰胺，IM NaCl和1% SDS的緩沖液在42°C雜交。
然而，雜交形式的選擇不是關(guān)鍵性的，是洗滌條件的嚴(yán)格性規(guī)定了決定一個核酸是否在本發(fā)明范圍內(nèi)的條件。用于在本發(fā)明范圍內(nèi)鑒定核酸的洗滌條件包括如鹽濃度約0. 02M、pH為7和溫度至少約50°C或約55°C到約60°C ;或鹽濃度約0. 15M NaCl 72°C約15分鐘；或鹽濃度約0. 2XSSC、溫度至少約50°C或約55°C到約60°C約15到約20分鐘；或雜交復(fù)合體用溶液洗2次，溶液是鹽濃度約2 X SSC，含有0. I % SDS，室溫15分鐘，然后用含有0. 1% SDS的0. IXSSC 680C 15分鐘洗滌兩次；或同等條件。參見Sambrook, Tijssen和Ausubel描述SSC緩沖液和同等條件。本發(fā)明核酸存在于整個細(xì)胞和細(xì)胞裂解液中，或以部分純化或基本純化形式。當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠、電泳和其他本領(lǐng)域已知的方法，與其他細(xì)胞組份或其他污染物如其他細(xì)胞核酸或蛋白分離純化出來時，核酸是“分離的”或“基本純的”。參見Sambrook、Tijssen和Ausubel。實施本發(fā)明所用的本發(fā)明核酸序列和其他核酸，不管是RNA、cDNA、基因組DNA或其雜化物可從多種來源分離出來，如用遺傳學(xué)方法改造的、基因擴(kuò)增的和/或重組表達(dá)的。能夠使用任何重組表達(dá)系統(tǒng)，除細(xì)菌以夕卜，還包括如酵母、昆蟲或哺乳動物系統(tǒng)?？蛇x擇地，這些核酸能在體外化學(xué)合成。核酸操作技術(shù)如亞克隆到表達(dá)載體，標(biāo)記探針，測序和雜交都在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中很好描述，參見 如Sambrook、Tijssen和Ausubel。核酸分析和定量可采用任一種本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知的一般辦法。這些辦法包括生化分析方法如NMR、分光光度法、放射顯影法、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜法(HPLC)，薄層層析法(TLC)和超擴(kuò)散層析法，各種免疫方法如流體或凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單或雙向)、免疫電泳、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、免疫突光分析、Southern分析、Northern分析、斑點印跡分析、凝膠電泳(如SDS-PAGE)、RT-PCT、定量PCR、其他核酸或靶或信號擴(kuò)增法、放射標(biāo)記、閃爍計數(shù)和親和層析。本發(fā)明的核酸組合物，經(jīng)常在天然序列(除了修飾的限制性位點等)中，來自cDNA、基因組或混合物，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變產(chǎn)生基因序列。對編碼序列而言，這些突變可影響所需的氨基酸序列。尤其是可期望制備DNA序列，其與天然V、D、J、恒定區(qū)、轉(zhuǎn)換序列和其他這種在此描述的序列基本同源或衍生自上述這些序列(這里“衍生的”表示一個序列與另一個序列相同或從另一個序列修飾而來)。當(dāng)使一個核酸與另一個核酸序列存在功能性關(guān)系時，則該核酸就是“可操作連接”。例如，如果一個啟動子或增強子影響了一個編碼序列轉(zhuǎn)錄，它就可操作連接到該序列中。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，可操作連接表示連接的DNA序列是相鄰的，在有必要連接蛋白編碼區(qū)域時是相鄰的且位于閱讀框架中。對轉(zhuǎn)換序列而言，可操作連接表示序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。術(shù)語“載體”意指核酸分子，其能轉(zhuǎn)移它已連接的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！?，其指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其他DNA區(qū)段可連接進(jìn)去。另一類載體是病毒載體，其中其他DNA區(qū)段可連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能在引入了這些載體的宿主細(xì)胞中自我復(fù)制(如具有細(xì)菌的復(fù)制起始點的細(xì)菌載體以及游離型哺乳動物載體)。其他載體(如非游離型哺乳動物載體)在引入到宿主細(xì)胞中后能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此隨宿主基因組復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)表達(dá)它們操作地連接的基因。一些載體本發(fā)明稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“表達(dá)載體”)?？偟膩碚f，重組DNA技術(shù)所使用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。本說明書的“質(zhì)?！焙汀拜d體”交換使用，因為質(zhì)粒是載體最普遍使用的形式。但是，本發(fā)明意包括這種表達(dá)載體的其他形式，如病毒載體(如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其充當(dāng)同等作用。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱“宿主細(xì)胞”)是指重組表達(dá)載體已轉(zhuǎn)入的細(xì)胞。應(yīng)理解為這種術(shù)語不僅意指特定的被試細(xì)胞也意指這種細(xì)胞的子代。由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可出現(xiàn)在以后代中，這種子代實際上與親本細(xì)胞可不同，但仍包括在本發(fā)明所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。術(shù)語“小基因座轉(zhuǎn)基因”指一種轉(zhuǎn)基因，與自然出現(xiàn)的種系Ig基因座比較，其含有部分基因組免疫球蛋白基因座，該基因座至少攜帶非必需DNA部分的一種內(nèi)(即不是在該部分的端點)缺失(如干擾序列；內(nèi)含子或其部分)?！皹?biāo)記”是一種組合物，可由光譜學(xué)、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)或化學(xué)方法檢測。例如，有用的標(biāo)記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(如通常在ELISA中使用)、生物素、地 高辛配基，或半抗原和蛋白，針對其的抗血清或單克隆抗體是可得的(如本發(fā)明多肽能制成可檢測的，如將放射標(biāo)記摻入肽中，然后用作檢測特異性與肽反應(yīng)的抗體)。術(shù)語“分選”，就本發(fā)明所用細(xì)胞而言，既指細(xì)胞物理分選，使用如熒光活化細(xì)胞分選儀能實現(xiàn)，又指基于細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)分析細(xì)胞，如在沒有分選時FACS分析。短語“免疫細(xì)胞應(yīng)答”指免疫系統(tǒng)細(xì)胞對外來刺激物或內(nèi)在刺激物(如抗原、細(xì)胞因子、趨化因子和其他細(xì)胞)的反應(yīng)，在免疫細(xì)胞中發(fā)生生化變化，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞遷移、靶細(xì)胞殺傷、吞噬作用、產(chǎn)生抗體、其他免疫應(yīng)答可溶性效應(yīng)物等等。術(shù)語“T淋巴細(xì)胞應(yīng)答”和“T淋巴細(xì)胞活性”在此交換使用，指依賴于T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的組份(即T淋巴細(xì)胞增殖和/或分化成輔助細(xì)胞、細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞、或抑制T淋巴細(xì)胞，由輔助T淋巴細(xì)胞將信號提供給B淋巴細(xì)胞導(dǎo)致或預(yù)防抗體生產(chǎn)，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷特殊靶細(xì)胞，和可溶性因子的釋放如調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞功能的細(xì)胞因子)。術(shù)語“免疫應(yīng)答”指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和可溶性大分子的協(xié)同作用，這些可溶性大分子由上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生(包括抗體、細(xì)胞因子和補體)，并導(dǎo)致選擇性的對人體的傷害、破壞或消除侵入了該人體的病原體、已感染了病原體的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或在自身免疫或病理炎癥的情況下，對正常人細(xì)胞或組織的傷害、破壞，或消除。免疫應(yīng)答組份可在體外用各種方法檢測出來，這些方法對本領(lǐng)域的普通專業(yè)技術(shù)人員已熟知。如，(I)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能用放射活性標(biāo)記的靶細(xì)胞溫育，然后這些靶細(xì)胞的溶解由放射活性的釋放檢測，(2)輔助T淋巴細(xì)胞能與抗原和抗原呈遞細(xì)胞溫育，細(xì)胞因子的合成和分泌由標(biāo)準(zhǔn)方法測定(ffindhagen A等，1995, Immunity 2(4) :373-80), (3)抗原呈遞細(xì)胞能與整個蛋白抗原溫育，該抗原在MHC上的展示由T淋巴細(xì)胞活化分析或生物物理方法測定(Harding 等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. ,86 =4230-4234)，(4)肥大細(xì)胞能與交聯(lián)它們的Fe- e受體的試劑溫育,組胺的釋放由酶免疫分析測定(Siraganian等，1983，TIPS 4 :432-437)。相似地，在模型生物(如小鼠)或病人中的免疫應(yīng)答產(chǎn)物能采用多種方法檢測，這些方法都為本領(lǐng)域普通專業(yè)技術(shù)人員所熟知。例如，(I)對種痘應(yīng)答產(chǎn)生的抗體采用當(dāng)前在臨床實驗室中的標(biāo)準(zhǔn)方法很容易進(jìn)行檢測，如ELISA ； (2)免疫細(xì)胞遷移到炎癥位點的檢測方法包括皮膚表面劃痕，并將無菌容器放置到劃痕位點上捕獲遷移細(xì)胞(Peters等，1988，Blood 72 =1310-5) ；(3)在促細(xì)胞分裂劑或混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的應(yīng)答中，外周血單核細(xì)胞的增殖能用3H-胸腺嘧啶核苷測定；(4) PBMC中的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞的吞噬能力能夠通過將PMBC與標(biāo)記顆粒一起放到孔中進(jìn)行測定(Peters等，1988) ； (5)免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化的檢測是用CD分子如CD4和CD8的抗體將PBMC標(biāo)記，并測定能表達(dá)這些標(biāo)記的PBMC組份。如本發(fā)明所用，短語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”或“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件”指至少一個生化反應(yīng)，但更普遍是一系列生化反應(yīng)，這些反應(yīng)產(chǎn)生于細(xì)胞與刺激化合物或作用物的相互作用。因此，刺激化合物與細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生“信號”，其通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答，例如，如上所述的免疫應(yīng)答。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是指各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子間的生化關(guān)系，這些分子在信號從細(xì)胞的一部分傳遞到細(xì)胞的另一部分中發(fā)揮作用。本發(fā)明的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包括例如，本發(fā)明的MAb 147. I。如本發(fā)明所用，短語“細(xì)胞表面受體”包括分子和分子的復(fù)合物，能夠接受信號并傳遞此種信號跨越細(xì)胞質(zhì)膜。本發(fā)明“細(xì)胞表面受體”的一個實例是T細(xì)胞受體(TCR)或CTLA-4B7 配體。細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能由細(xì)胞和刺激物的相互作用啟動，刺激物在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞外。如果外在(即在細(xì)胞外)刺激物(如抗原呈遞細(xì)胞上的MHC-抗原復(fù)合體)與細(xì)胞表面受體(如T細(xì)胞受體)相互作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠傳遞信號跨越該細(xì)胞的細(xì)胞膜，通過細(xì)胞的胞質(zhì)，并在一些情況下到達(dá)細(xì)胞核。如果內(nèi)在(即在細(xì)胞內(nèi))刺激物與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠?qū)е聜鬟f信號通過細(xì)胞的胞質(zhì)，并在一些情況下到達(dá)細(xì)胞核。通過下列途徑能夠產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如分子的磷酸化；非共價變構(gòu)的相互作用；分子的復(fù)合；分子構(gòu)象的變化；鈣釋放；磷酸肌醇的產(chǎn)生；蛋白水解切割；環(huán)核苷酸的產(chǎn)生以及二酰甘油酯的產(chǎn)生。通常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化作用產(chǎn)生。術(shù)語“非特異性T細(xì)胞活化”指不依賴抗原特異性的對T細(xì)胞的刺激。針對CTLA-4人抗體的生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)和人類序列抗體的生產(chǎn)能使用多種方法，包括常規(guī)單克隆抗體方法學(xué)如標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)，Kohler和Milstein，Nature 256 :495 (1975)。生產(chǎn)單克隆抗體的任何技術(shù)能采用如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。制備雜交瘤的一種動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。小鼠生產(chǎn)雜交瘤是普遍確認(rèn)的方法。用于融合的免疫脾細(xì)胞分離的免疫方案和技術(shù)在本領(lǐng)域中已知。融合參與者(如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合步驟也已知(參見如 Harlow 和 Lane(1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor New York)。抗人CTLA-4的人單克隆抗體和人類序列抗體能使用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)，該小鼠攜帶人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠，本發(fā)明也稱為“HuMAb-小鼠 ”，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其編碼未重排的人重鏈和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列，帶有靶向突變，這些突變使內(nèi)源性的U和Y鏈基因座失活(Lonberg，N.等(1994)，Nature 368(6474) :856-859和美國專利5，770，429)。相應(yīng)地，小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或k的表達(dá)下降，并在對免疫作用的應(yīng)答中，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變從而產(chǎn)生高親和性的人IgGK單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994)，同上；綜述為Lonberg, N. (1994), Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101 ；Lonberg,N.和 Huszar, D. (1995), Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93, Harding, F.和 Lonberg,N. (1995)，Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 :536-546)。制備轉(zhuǎn)基因小鼠方法詳細(xì)描述在下列部分II 和參考文獻(xiàn)中Taylor, L.等(1992)，Nucleic Acids Research 20 :6287-6295 ；Chen,J.等(1993), International Immunology 5 :647-656 ;Tuaillon 等(1993), Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :3720-3724 ；Choi 等(1993)，Nature Genetics 4 :117-123 ；Chen,J.等(1993)，EMBO J. 12 :821-830 ；Tuaillon 等(1994)，J. Immunol. 152 :2912-2920 ；Lonberg等(1994), Nature 368(6474) :856-859 ；Lonberg, N. (1994), Handbook of ExperimentalPharmacology 113 :49-101 ;Taylor, L.等(1994), International Immunology 6:579-591 ；Lonberg, N.和 Huszar,D. (1995), Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93 ；Harding,F.和Lonberg,N. (1995) ,Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 :536-546 ；Fishwild,D.等(1996),NatureBiotechnology 14:845-851。進(jìn)一步參見，Lonberg 和 Kay 和 GenPharm International美國專利號5,625, 126和5, 770, 429 ；Surani等，美國專利號5，545,807 ;國際公開號WO98/24884，
公開日
1998 年 6 月 11 日；W0 94/25585，
公開日
1994 年 11 月 10 日；W0 93/1227，
公開日1993年6月24日；TO 92/22645，
公開日1992年12月23日；TO 92/03918，
公開日1992年3月19日。可選擇地，如下列實施例I和2所描述的，CMD和Hcol2轉(zhuǎn)基因能用于生產(chǎn)人抗CTLA-4抗體。詳細(xì)過程用于充分生產(chǎn)針對CTLA-4的人單克隆抗體描述在下列實施例中。采用各種抗原積累的經(jīng)驗已經(jīng)顯示當(dāng)用完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(nèi)初始免疫，隨后每隔一周用不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多達(dá)總數(shù)6)時，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。然而，除弗氏佐劑外的佐劑也發(fā)現(xiàn)是有效的。此外，在缺乏佐劑的完整細(xì)胞發(fā)現(xiàn)具有高度的免疫原性。免疫應(yīng)答能用后眼眶取血獲得血漿樣品在免疫流程過程中監(jiān)控。血漿能用ELISA篩選(如下描述)，并且有足夠效價的抗CLTA-4人免疫球蛋白的小鼠能用作融合。小鼠在處死和去除脾臟前3天用抗原靜脈加強免疫。可預(yù)期每種免疫需要完成2-3個融合。每個抗原通常免疫6-24只小鼠。經(jīng)常使用Hco7和Hcol2株。此外，Hco7和Hcol2兩個轉(zhuǎn)基因能一起培養(yǎng)到單一小鼠中，該小鼠具有兩個不同人重鏈轉(zhuǎn)基因。為了純化人抗CTLA-4抗體，所選擇的雜交瘤在2L搖瓶生長用于純化單克隆抗體。上清液過濾并濃縮后進(jìn)行蛋白A-瓊脂糖親和層析(Pharmacia, Piscataway, NJ)。洗脫的IgG用凝膠電泳和高效液相層析檢查以確保純度。緩沖溶液換成PBS，在0D280用I. 43消光系數(shù)測定其濃度。單克隆抗體分成等份并儲存于_80°C。為測定所選擇的人抗CTLA-4單克隆抗體是否結(jié)合到唯一表位上，每個抗體使用商品化提供的試劑(Pierce，Rockford，IL)生物素?；?。如上所述采用CTLA-4包被的ELISA板，并采用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素酰化的單克隆抗體進(jìn)行競爭研究。生物素酰化MAB的結(jié)合用鏈霉素-抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針檢測。為測定純化抗體的同型性Ig，進(jìn)行同型ELISA。微量滴定板用I y g/ml抗人IgG包被4°C過夜。1% BSA封閉后，板與Iy g/ml或更少的單克隆抗體或純化的同型性對照反應(yīng)，室溫下反應(yīng)1-2小時。然后板孔與人IgGl或人IgM特異的堿性磷酸酶-結(jié)合的探針反應(yīng)。板如上所述進(jìn)行顯影和分析。
為顯示單克隆抗體與表達(dá)CTLA-4的活細(xì)胞結(jié)合，使用了流式細(xì)胞分析。簡而言之，表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞系(生長在標(biāo)準(zhǔn)生長條件)與PBS中多種濃度的單克隆抗體混合，37°C溫育I小時，PBS含有0. 1% BSA和10%胎牛血清。洗滌后，細(xì)胞在如一級抗體染色的同樣條件下與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體反應(yīng)。樣品分析采用FACScan儀使用光和邊散射(side scatter)性質(zhì)對單一細(xì)胞進(jìn)行門控。除流式細(xì)胞儀分析外，附加或替代性的分析方法可使用熒光顯微術(shù)。細(xì)胞染色正如上所述，并由熒光顯微術(shù)檢查。該方法允許單個細(xì)胞的顯色，但依賴抗原密度的靈敏度已經(jīng)降低?？笴TLA-4人IgG采用Western印跡能進(jìn)一步測試與CTLA-4抗原的反應(yīng)性。簡而言之，來自表達(dá)CTLA-4細(xì)胞的細(xì)胞抽提物得以制備和置于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用10%胎牛血清封閉，用待測的單克隆抗體作探針檢測。人IgG的結(jié)合能使用抗人IgG堿性磷酸酶檢測并用BCIP/NBT底物片劑顯色(Sigma Chem. Co. , St. Louis, MO)。產(chǎn)生人單克隆抗CTLA-4抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動物的生產(chǎn)
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠，其能表達(dá)特異性地結(jié)合到CTLA-4的人單克隆抗體。還提供了高親和性人類序列抗體。一些轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶一個基因組，該基因組含有人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。一些轉(zhuǎn)基因非人類動物用純化的或富集的CTLA-4抗原制劑或表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞免疫。一些轉(zhuǎn)基因非人類動物經(jīng)歷V-D-J重組和同型Ig轉(zhuǎn)換能夠生產(chǎn)針對CTLA-4人單克隆抗體的多種同型Ig (如IgG、IgA和/或IgE)。同型轉(zhuǎn)換可如經(jīng)典或非經(jīng)典同型轉(zhuǎn)換出現(xiàn)。用異源抗體庫設(shè)計應(yīng)答外抗原刺激的轉(zhuǎn)基因非人類動物，這要求含在轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因貫穿B細(xì)胞發(fā)育途徑正確發(fā)揮功用。一些小鼠中異源重鏈轉(zhuǎn)基因的正確功用包括同型轉(zhuǎn)換。相應(yīng)地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因被構(gòu)建使得產(chǎn)生同型轉(zhuǎn)換以及一個或多個下列過程(I)高水平和細(xì)胞型特異性表達(dá)，(2)功能基因重排，(3)等位排斥的活化和反應(yīng)，(4)表達(dá)足夠初級庫，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞超突變，和(7)免疫反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化。非所有上述標(biāo)準(zhǔn)都需要滿足。例如，在轉(zhuǎn)基因動物中，其中這些動物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座功能性地破裂，轉(zhuǎn)基因不需要活化等位排斥。進(jìn)一步在轉(zhuǎn)基因動物中，其中轉(zhuǎn)基因包含功能性地重排重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因，至少對那種已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因，功能性基因重排的第二個標(biāo)準(zhǔn)不是必需的。對于分子免疫學(xué)的背景，參見如FundamentalImmunology,4th edition(1998), Paul, William E. , ed. Lippencott-Raven Press, N. Y.。一些轉(zhuǎn)基因非人類動物用于生成本發(fā)明的人單克隆抗體，含有在轉(zhuǎn)基因動物種系中重排、未重排或重排和未重排異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的組合。每一個重鏈轉(zhuǎn)基因至少包含一個CH基因。此外，重鏈轉(zhuǎn)基因含有功能性的同型Ig轉(zhuǎn)換序列，這些序列在轉(zhuǎn)基因動物中的B細(xì)胞中能支持異源轉(zhuǎn)基因的同型轉(zhuǎn)換，該轉(zhuǎn)基因編碼多種CH基因。這種轉(zhuǎn)換序列能是那些在種系免疫球蛋白基因座中自然出現(xiàn)的，該基因座來自充當(dāng)轉(zhuǎn)基因CH基因源的物種，或這種轉(zhuǎn)換序列能衍生自那些發(fā)生在必定接受轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(轉(zhuǎn)基因動物)中。例如，人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，可產(chǎn)生更高頻率的同型轉(zhuǎn)換事件，如果該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體摻入與那些在小鼠重鏈基因座中自然發(fā)生的序列相似的轉(zhuǎn)換序列，因假設(shè)小鼠轉(zhuǎn)換序列優(yōu)化為用小鼠轉(zhuǎn)換重組酶酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，而人轉(zhuǎn)換序列則不行。轉(zhuǎn)換序列能采用常規(guī)克隆方法分離和克隆，或能從重疊合成寡核苷酸中從頭開始合成，重疊的合成寡核苷酸以公開的有關(guān)免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)域序列的序列信息為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(Mills 等,Nucl. Acids Res. 15 :7305-7316 (1991) ;Sideras 等,Intl. TmmunoI. I 631-642(1989))。對于每一個上述轉(zhuǎn)基因動物，功能性地重排的異源性的重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞的顯著部分(至少10% )。轉(zhuǎn)基因用于生成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，包括含有DNA的重鏈轉(zhuǎn)基因，該DNA編碼至少一個可變的基因區(qū)段，一個多樣性基因區(qū)段，一個連接基因區(qū)段和至少一個恒定區(qū)基因區(qū)段。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因含有DNA，編碼至少一個可變的基因區(qū)段，一個連接基因區(qū)段和至少一個恒定區(qū)基因區(qū)段。編碼輕鏈和重鏈基因區(qū)段的基因區(qū)段，對于轉(zhuǎn)基因非人類動物是異源性的，原因在于這些基因區(qū)段衍生自或?qū)?yīng)于DNA，這種DNA編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因區(qū)段，該區(qū)段來自不是由轉(zhuǎn)基因非人類動物的物種。在本發(fā)明的一個方面，轉(zhuǎn)基因被構(gòu)建使得單個基因區(qū)段是未重排的，即不重排使得編碼功能性的免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這種未重排的轉(zhuǎn)基因支持V、D和J基因區(qū)段的重組(功能性重排)和當(dāng)動物暴露給 CTLA-4抗原時，優(yōu)選地支持將作為結(jié)果而發(fā)生的重排免疫球蛋白重鏈的全部或部分D區(qū)域基因區(qū)段摻入到轉(zhuǎn)基因非人類動物內(nèi)。該種轉(zhuǎn)基因通常含有C、D和J區(qū)段的實質(zhì)部分以及V基因區(qū)段的亞組。在這種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，多種調(diào)節(jié)序列例如啟動子、增強子、類型轉(zhuǎn)換區(qū)域、用于RNA加工的剪接供體和剪接受體序列、重組信號等含有衍生自異源DNA的對應(yīng)序列。這種調(diào)節(jié)序列可摻入到轉(zhuǎn)基因中，該轉(zhuǎn)基因來自本發(fā)明使用的相同物種或相關(guān)物種的非人類動物。例如人免疫球蛋白基因區(qū)段可在轉(zhuǎn)基因中與嚙齒動物免疫球蛋白增強子序列組合用于轉(zhuǎn)基因小鼠?？蛇x擇地，合成的調(diào)節(jié)序列可摻入到轉(zhuǎn)基因中，其中這種合成調(diào)節(jié)序列與功能性DNA序列不同源，該種功能性DNA序列已知在哺乳動物基因組中自然發(fā)生。合成的調(diào)節(jié)序列依據(jù)共有序列規(guī)則設(shè)計，例如那些具體說明了剪接受體位點或啟動子/增強子基元的容許序列的規(guī)貝U。轉(zhuǎn)基因可包含小基因座。一些轉(zhuǎn)基因動物用于生成針對CTLA-4的人抗體，含有至少一個，通常2_10個，和有時25-50個或更多個拷貝的轉(zhuǎn)基因，該基因描述在美國專利5. 770. 429實施例37中，或下列實施例2所描述的轉(zhuǎn)基因(如HCol2)，至少一個拷貝的輕鏈轉(zhuǎn)基因，該基因描述在美國專利5. 770. 429實施例38中，兩個拷貝的Cmu缺失，該缺失描述在下列實施例I中，和兩個拷貝的Jk缺失，該缺失描述在美國專利5，770，429實施例9中。作為結(jié)果而發(fā)生的動物被注射抗原并用于生產(chǎn)抗這些抗原的人單克隆抗體。一些轉(zhuǎn)基因動物顯示以顯著量產(chǎn)生免疫球蛋白，理想地基本與天生小鼠生產(chǎn)的相似。因此例如動物，其中內(nèi)源性Ig基因已經(jīng)失活，總免疫球蛋白水平范圍從約0. I到約10mg/ml 血清。轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)的免疫球蛋白通常識別約一半或更多的高抗原性蛋白，如葡萄球菌蛋白A。通常免疫球蛋白表明了預(yù)選抗原的締合常數(shù)至少約IO7M^lO8MilO9M'IO10M' IO11M-1, IO12M' IO13M'或更多。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠用純化的或富集的人CTLA-4抗原(或其抗原片段)制劑和/或如前所述表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞免疫。小鼠生產(chǎn)B細(xì)胞，該B細(xì)胞通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換，并且表達(dá)與CTLA-4反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白能是人類序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn)基因序列編碼，這些轉(zhuǎn)基因序列可包括源自體細(xì)胞突變和V區(qū)重組源聯(lián)合的序列以及種系編碼的序列；這些人序列免疫球蛋白能視作與多肽序列基本相同，該多肽序列由人VL或VH基因區(qū)段和人JL或JH區(qū)段編碼，即使其他非種系序列作為體細(xì)胞突變和不同V-J和V-D-J重組聯(lián)合的結(jié)果出現(xiàn)。關(guān)于這些人類序列抗體，每個鏈的可變區(qū)通常至少80%是由人種系V、J和(在重鏈情況下)D基因區(qū)段編碼的；常常至少85%的可變區(qū)是由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼；經(jīng)常90%或95%或更多的可變區(qū)序列是由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。但是，非種系序列自從由體細(xì)胞突變和VJ和VDJ聯(lián)合導(dǎo)入后，人類序列抗體常常有一些可變區(qū)序列(和較少有恒定區(qū)序列)，這些序列不是由人V、D或J基因區(qū)段編碼，如在小鼠種系人轉(zhuǎn)基因中發(fā)現(xiàn)的一樣。通常，這些非種系序列(或個別核苷酸位置)簇在CDR內(nèi)或靠近CDR，或在體細(xì)胞突變已知為簇的區(qū)域。人類序列抗體結(jié)合到預(yù)定抗原，能夠從同型Ig轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，以此生產(chǎn)了人抗體，包含人序列Y鏈(如Y I、Y2、y3或y4)和人序列輕鏈(如K或V)。這種同型轉(zhuǎn)換人類序列抗體經(jīng)常含有一個或多個體細(xì)胞突變，通常在可變區(qū)和經(jīng)常在約10個CDR殘基上或 之內(nèi)，原因是親合力成熟和用抗原選擇B細(xì)胞，尤其是之前對二級(或隨后)抗原的攻擊。一些高親和性人類序列抗體平衡締合常數(shù)為至少約I X IO7IT1,或至少約I X IO8IT1,或大于約 I X IO9M' 或 5 X IO9IT1 到 I X IO11ITi 或更多。本發(fā)明的另一個方面有關(guān)來自一種小鼠的B細(xì)胞，該種小鼠能用于生成表達(dá)人單克隆抗體的雜交瘤，該抗體以高親和性結(jié)合到CTLA-4上(如締合常數(shù)大于IO7M4)。這些雜交瘤用于生成組合物，該組合物包含免疫球蛋白，其結(jié)合CTLA-4的締合常數(shù)(Ka)至少為IO7M'該種免疫球蛋白含有人序列輕鏈，由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)組成，輕鏈可變區(qū)的多肽序列與人V K或VX基因區(qū)段及人Jk或區(qū)段編碼的多肽序列基本相同，輕鏈恒定區(qū)的多肽序列與人Ck或CA基因區(qū)段編碼的多肽序列基本相同。它還包含了人序列重鏈，由重鏈可變區(qū)以及重鏈恒定區(qū)組成，重鏈可變區(qū)的多肽序列與人VH基因區(qū)段、任選擇地D區(qū)域和人JH區(qū)段編碼的多肽序列基本一致，重鏈恒定區(qū)的多肽序列與人CH基因區(qū)段編碼的多肽序列基本一致。本發(fā)明還提供了針對人CTLA-4的人單克隆抗體和人類序列抗體，這些抗體衍生或連接到另一個功能性分子如另一個多肽或蛋白(如細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性劑、免疫刺激或抑制劑、Fab’片段等，如上論述)從而產(chǎn)生雙特異性的或多特異性的分子，該分子結(jié)合到多種結(jié)合位點或靶表位上。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分能功能性地連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳學(xué)方法融合、非共價締合或其他)到一個或多個其他結(jié)合分子上，如另一個抗體，抗體片段，肽或結(jié)合模擬物。相應(yīng)地，本發(fā)明包括雙特異性的和多特異性的組合物，含有至少一種人類序列抗體或抗原結(jié)合片段，并帶有針對人CTLA-4的第一結(jié)合特異性和針對第二個靶表位的第二個結(jié)合特異性。第二個靶表位能是Fe受體，如人Fe Y RI或人Fe Y受體。因此，本發(fā)明包括雙特異性和多特異性分子，能既結(jié)合到表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞的Fe Y Rl、Fe Y R或Fe e R(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))，又結(jié)合到表達(dá)人CTLA-4的靶細(xì)胞上。這些多特異性(如雙特異性或多特異性)分子將表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞靶向到效應(yīng)細(xì)胞上，并引發(fā)Fe受體-介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如人CTLA-4表達(dá)細(xì)胞的吞噬作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生超氧負(fù)離子。本發(fā)明雙特異性和多特異性分子包括一個結(jié)合特異性，至少一個抗體，或其抗體片段，包括如Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv或單鏈Fv。抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或二聚體的任何最小片段如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladner等在美國專利號4，946，778中所描述。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包括對Fe Y R或存在于效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fe Y R的結(jié)合特異性，以及對靶細(xì)胞抗原如人CTLA-4的第二個結(jié)合特異性。對Fe受體的結(jié)合特異性由單克隆抗體提供，這種結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)所封閉。如本發(fā)明所用，術(shù)語“IgG受體”針對位于染色體I中的8個Y鏈基因中的任一個。這些基因編碼共12個跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分成3個Fe Y受體類型Fc y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32), FcyRIII (CD 16)。例如，F(xiàn)e 受體能是人高親和性的FcyRI0人Fe Y RI是72kD的分子，對單體IgG表現(xiàn)了高親和性(IO8到IO9W1)。
這些優(yōu)選的單克隆抗體的生產(chǎn)和特征由Fanger等在PCT申請W088/00052和美國專利4，954，617中描述。這些抗體在一位點結(jié)合到Fe yRI、Fe y RII或Fe y RIII的表位上，該位點明顯區(qū)別于受體的Fe y的結(jié)合位點，因此它們的結(jié)合基本不受到IgG生理水平封閉。本發(fā)明中有用的特異性抗？(^1 1抗體為獻(xiàn)匕22、獻(xiàn)匕32、獻(xiàn)匕44、獻(xiàn)匕62和獻(xiàn)13197。生產(chǎn) MAb32 的雜交瘤由 ATCC 提供，ATCC 保藏號 HB9469。MAb22 的抗 Fe Y RI MAb22 和 F(ab’)2片段能從Medarex InC. (Annandale, N. J.)獲得。在其他實施方案中，抗Fe Y受體的抗體為單克隆22的人源化形式(H22)。H22抗體的生產(chǎn)和特征由Graziano在J. Immunol 155 4996-5002(1995)和PCT/US93/10384中描述。H22抗體生產(chǎn)細(xì)胞系保藏在ATCC，保藏日1992年11月4日，指定號HA022CL1，保藏號CRL11177。Fe受體的結(jié)合特異性也能由結(jié)合到人IgA受體的抗體提供，如Fc-a受體(Fe a R(⑶89))。優(yōu)選地,抗體在一位點結(jié)合到人IgA受體上,該位點不受內(nèi)源性IgA的封閉。術(shù)語“ IgA受體”欲包括位于染色體19上一個a基因的基因產(chǎn)物(Fe a RI)。該基因已知編碼幾種55到IlOkD可選擇地剪接的跨膜同種型。Fe a RI (⑶89)組成地表達(dá)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞，而非在非效應(yīng)細(xì)胞種群。Fe a RI對IgAl和IgA2具有中度親和性(^ 5X IO7M-1)，其隨著暴露給細(xì)胞因子如G-CSF或GM-CSF而增加(Morton (1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。四個 Fe a RI 特異性單克隆抗體鑒定為A3、A59、A62和A77,在IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域外結(jié)合Fe a RI，已由如Monteiro (1992)J. Tmmun01. 148 :1764 描述。本發(fā)明的雙特異性的和多特異性的分子能進(jìn)一步包含結(jié)合特異性，該結(jié)合特異性識別如結(jié)合到靶細(xì)胞抗原如人CTLA-4。結(jié)合特異性由本發(fā)明的人類序列抗體或人單克隆抗體提供。如本發(fā)明所用“效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體”指能結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fe受體的抗體或功能性抗體。用于主題發(fā)明中的優(yōu)選抗體在一位點結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fe受體，該位點不結(jié)合內(nèi)源性的免疫球蛋白。如本發(fā)明所用，術(shù)語“效應(yīng)細(xì)胞”指一種免疫細(xì)胞，其參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段，如相對于免疫應(yīng)答的識別和活化階段。作例證的免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴起源的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞和T細(xì)胞包括細(xì)胞溶解性T細(xì)胞(CTL))、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特定Fe受體并執(zhí)行特定的免疫功能。效應(yīng)細(xì)胞能誘導(dǎo)依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，如嗜中性粒細(xì)胞能誘導(dǎo)ADCC。例如，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)Fe a R，參與靶細(xì)胞的特異性殺傷和呈遞抗原到免疫系統(tǒng)的其他組分上，或結(jié)合到呈遞抗原的細(xì)胞上。效應(yīng)細(xì)胞也能吞噬靶抗原、靶細(xì)胞或微生物。效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)受到體液因子如細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。例如，已發(fā)現(xiàn)Fe y RI的表達(dá)受到干擾素Y (IFN- y )的正調(diào)節(jié)。該增強的表達(dá)通過攜帶Fe y RI細(xì)胞增加了抗靶細(xì)胞細(xì)胞毒性活性(包括如吞噬作用)?！鞍屑?xì)胞”意味被試者中任何不需要的細(xì)胞(如人或動物)，能由組合物所靶向(如本發(fā)明的人序列抗體或人單克隆抗體，本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子)。靶細(xì)胞能是個表達(dá)或過表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞。表達(dá)人CTLA-4的細(xì)胞能包括腫瘤細(xì)胞如淋巴瘤。除了本發(fā)明的人類序列抗體和人單克隆抗體以外，其他抗體也能在本發(fā)明的雙特 異性或多特異性分子中使用，包括如鼠、嵌合和人源化的單克隆抗體。嵌合小鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)能由本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fe恒定區(qū)域的基因用限制酶消化以去除編碼鼠Fe的區(qū)域，并且用編碼人Fe恒定區(qū)域的相當(dāng)部分替代。(參見如Robinson等，國際專利公開PCT/US86/02269 ；Akira等，歐洲專利申請184，187 ；Taniguchi, M.，歐洲專利申請 171, 496 ；Morrison 等，歐洲專利申請 173, 494 ；Neuberger 等，國際申請 WO 86/01533 ；Cabilly 等，美國專利 4，816，567 ；Cabilly 等，歐洲專利申請 125，023 ；Better(1988)，Science 240 :1041-1043 ；Liu(1987)，PNAS 84 :3419-3443 ；Liu(1987)，J.Immunol. 139 3521-3526 ；Sun(1987)，PNAS 84 :214-218 ；Nishimura(1987)Cane. Res. 47 :999-1005 ；Wood(1985)，Nature 314 :446-449 ；Shaw(1988)，J.Natl. Cancer Inst. 80 :1553-1559)。嵌合抗體通過替代Fv可變區(qū)序列能進(jìn)一步人源化，這些序列不直接參與抗原與來自人Fv可變區(qū)的相當(dāng)序列結(jié)合。人源化嵌合抗體綜述由Morrison (1985) Science229 :1202-1207和Oi (1986)BioTechniques 4 :214提供。這些方法包括分離、操作和表達(dá)核酸序列，所述核酸序列編碼全部或部分來自至少其中一個重鏈或輕鏈的免疫球蛋白Fv可變區(qū)。該種核酸源為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知和，例如可從7E3中獲得，7E3為抗-GPIIbIIIa抗體生產(chǎn)雜交瘤。編碼嵌合抗體或其片段的該種重組DNA然后能克隆到一個合適的表達(dá)載體中。適宜的人源化抗體選擇性地能由CDR替代生產(chǎn)。參見美國專利5, 225,539 ；Jones(1986), Nature 321 :552-525 ；Verhoeyan 等，1988 Science 239 1534 ；和 Beidler(1988)，J.Immunol. 141 :4053_4060。特定人抗體的所有⑶R可用至少部分非人類⑶R替代或只有一些⑶R可用非人類CDR替代。只需要替換CDR數(shù)目，這對人源化抗體與Fe受體的結(jié)合是需要的。抗體能采用任何方法人源化，該方法用衍生自非人類抗體的CDR能代替人抗體的至少一部分CDR。Winter描述了一種方法，可用于制備本發(fā)明的的人源化抗體，參見英國專利申請GB2188638A，提交日1987年3月16日。人⑶R可用非人類⑶R代替，采用寡核苷酸定點誘變?nèi)缭?，如WO94/10332,題目為 Humanized Antibodies to Fe Receptors for Immunoglobulin G onHuman Mononuclear Phagocytes 所描述。
特定氨基酸已被替代、缺失或添加的嵌合抗體和人源化抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如，人源化抗體在框架區(qū)域中有氨基酸替代，以便于提高與抗原的結(jié)合。在一個含有小鼠CDR的人源化抗體中，位于人框架區(qū)域的氨基酸用位于小鼠抗體中對應(yīng)位置的氨基酸替代。這些替代在一些情況下已知提高人源化抗體與抗原的結(jié)合。氨基酸已被添加、缺失或替代的抗體在本發(fā)明中指修飾的抗體或改變的抗體。除了抗-Fe結(jié)合特異性和抗-人CTLA-4結(jié)合特異性以外，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子能進(jìn)一步包括第三種結(jié)合特異性。第三種結(jié)合特異性部分能是抗-增強因子(EF)部分，如與表面蛋白結(jié)合的分子，該表面蛋白參與細(xì)胞毒性活性，因而增加了抗靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧蹦苁强贵w，功能性抗體片段或與給定分子如抗原或受體結(jié)合的配體，因此導(dǎo)致了結(jié)合決定基對Fe受體或靶細(xì)胞抗原效果的增強?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧蹦軌蚪Y(jié)合Fe受體或靶細(xì)胞抗原?？蛇x擇性地，抗增強因子部分能與一個實體結(jié)合，該實體與第一和第二個結(jié)合特異性部分結(jié)合的實體相區(qū)別。例如，抗增強因子部分能通過如CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-I或其他免疫細(xì)胞分子結(jié)合細(xì)胞毒性T細(xì)胞，這些分子參與增加抗靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子的制備能使用化學(xué)技術(shù)(參見如Kranz (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :5807)，“polydoma” 技術(shù)(參見如美國專利 4，474，893)或重組DNA技術(shù)。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子的制備還能通過連接組分的結(jié)合特異性部分，如抗FcR和抗人CTLA-4結(jié)合特異性部分，使用本領(lǐng)域已知的方法和如本發(fā)明所描述的方法。例如，每一個雙特異性和多特異性分子的結(jié)合特異性能夠單獨產(chǎn)生，然后相互連接。當(dāng)結(jié)合的特異性部分是蛋白或肽時，各種偶聯(lián)或交聯(lián)劑能用于共價連接。交聯(lián)劑的實例包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基環(huán)乙燒-I-羧酸酯(石黃基-SMCC)(如參見 Karpovsky (1984)，]. Exp. Med. 160 1686 ；Liu (1985)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8648)。其他方法包括那些由 Paulus 描述的方法(Behring Ins. Mitt. (1985), No. 78,118-132 ；Brennan (1985), Science 229:81-83;Glennie (1987)，J. Immunol. 139 :2367-2375)。其他偶聯(lián)劑是 SATA 和磺基-SMCC，兩者皆由Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)提供。當(dāng)結(jié)合特異性部分是抗體(如兩個人源化抗體)時，它們通過兩個重鏈的C端鉸合區(qū)域的硫氫鍵連接。該鉸合區(qū)域在連接前修飾成含有奇數(shù)的硫氫殘基，如一個?？蛇x擇地，兩個結(jié)合特異性部分能由同一個載體編碼并在同樣宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。本方法尤其有用，這里雙特異性和多特異性分子是MAbXMAb，MAbXFab,FabXF(ab^ )2或配體XFab融合蛋白。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子如雙特異性分子能是單一鏈分子，如單一鏈雙特異性抗體，單一鏈雙特異性分子含有一個單鏈抗體和結(jié)合決定基，或單一鏈雙特異性分子含有兩個結(jié)合決定基。雙特異性和多特異性分子還能是單鏈分子或可至少包含兩個單鏈分子。雙特異性和多特異性分子的制備方法，例如在美國專利5，260，203 ;美國專利5，455，030 ;美國專利4，881，175 ;美國專利5，132，405 ;美國專利5，091，513 ;美國專利5，476，786 ;美國專利5，013，653 ;美國專利5，258，498 ;和美國專利5，482，858所描述。雙特異性和多特異性分子與它們特異性靶的結(jié)合能由酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或Western印跡分析確認(rèn)。每種分析一般檢測是否存在特定的目的蛋白-抗體的復(fù)合物，采用對目的復(fù)合物特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)。例如，F(xiàn)cR-抗體復(fù)合物的檢測能采用如酶聯(lián)抗體或抗體片段，該抗體識別和特異性結(jié)合到抗體-FcR復(fù)合物上?？蛇x擇性地，復(fù)合物的檢測能使用任意各種其他免疫分析。例如，抗體能放射性地標(biāo)記和使用放射免疫分析(RIA)(參見如Weintraub, B. , Principles ofRadioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Technigues，TheEndocrine S ociety,March, 1986,在此引作參考)。放射性同位素檢測能采用此種方法如Y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或放射自顯影術(shù)。本發(fā)明還包括修飾抗體。術(shù)語“修飾抗體”包括抗體，如單克隆抗體，嵌合抗體和人源化抗體，這些抗體已由如缺失、添加或替代部分抗體而得以修飾。例如，抗體能由缺失恒定區(qū)和用一種意圖增加半衰期如血清半衰期、抗體的穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)替代它的而修飾。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物能用于修飾給定的生物應(yīng)答或創(chuàng)造生物應(yīng)答(如募集效應(yīng)細(xì)胞)。藥物組成成分不能被認(rèn)作限定于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑。例如，藥物組成成分可是個擁 有所需的生物活性的蛋白或多肽。該蛋白可包括例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子或干擾素-a ;或生物應(yīng)答修飾劑如淋巴因子，白介素-I (“IL-1”)、白介素-2 (“IL-2”)、白介素-6 (“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。這種組成成分與抗體的偶聯(lián)技術(shù)是熟知的，參見如Arnon等，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”， 于 MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等主編，243-56 頁(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery，，，于Controlled Drug Delivery (2nd Ed.),Robinson 等(主編)，623-53 頁(Marcel Dekker, Inc. 1987) ;Thorpe,“Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy A Review，，，于 Monoclonal Antibodies ‘84:Biological And Clinical Applications, Pinchera 等(主編)，475-506 頁(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy，，，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy, Baldwin 等(主編)，303-16 頁(Academic Press 1985), and Thorpe 等，“ThePreparatin And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，，，Immunol.Rev. ,62 :119-58(1982)。藥物組合物本發(fā)明提供了藥物組合物，包含一個或一組人單克隆抗體和/或人類序列抗體(完整的或結(jié)合片段)，并按配方與可藥用載體一起制成制劑。一些組合物包括一組本發(fā)明的多種(如兩個或更多個)分離的人抗體和/或人類序列抗體或其抗原結(jié)合部分。在一些組合物中，每一個組合物的抗體或其抗原結(jié)合部分是單克隆抗體或人類序列抗體，該抗體與一個截然不同的預(yù)選的人CTLA-4表位結(jié)合。A有效量調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳所需的應(yīng)答(如治療應(yīng)答)。例如，單一大丸劑可用于給藥，可隨時間分開幾種劑量用于給藥，或如由治療情況危急程度所顯示的，可成比例的降低或增加劑量。特別優(yōu)勢的是按配方制成經(jīng)腸胃外的組合物制劑，為方便給藥和劑量的均一性采用合適的劑量單位形式。本發(fā)明所用劑量單位形式指物理上分離的單位，適用作待治被試者的單位劑量，每個單位含有經(jīng)計算的預(yù)定數(shù)量的活性化合物與要求的藥物載體以便產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的詳情受到下列支配并直接依賴于下列(a)活性化合物的獨特特性和特定的有待獲得的療效，和(b)在這種活性化合物配藥用于處理個體中敏感性的領(lǐng)域中所固有的限制?？伤幱每寡趸瘎┑膶嵗?1)水溶性的抗氧化劑如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、二硫酸鈉、偏二硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑如抗壞血酸基化棕櫚酸酯(ascorbyl palmitate)、丁基化輕基苯甲醚(BHA)、丁基化輕基甲苯(BHT)、卵磷脂、酸丙酯、a-生育酚等；(3)金屬螯合劑如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。不管選擇的給藥途徑，可用在合適的水合物的形式中的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物采用常規(guī)方法制成可藥用的劑量形式，常規(guī)方法為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所知曉。 本發(fā)明藥物組合物中的活性組分的實際劑量水平能發(fā)生變化以致獲得活性組分的量，該量對特定病人、組合物和給藥方式獲得所需的治療應(yīng)答是有效的。該種選擇的劑量水平依賴于多種藥物動力學(xué)因素，包括本發(fā)明所使用的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、使用中的特定化合物的排泄速率、治療時間長短、與使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、治療中的病人的年齡、性別、體重、條件、身體總狀況和以前的藥物史等其他因素。大夫或獸醫(yī)以低于要求獲得所需的治療效果的水平啟動應(yīng)用在藥物組合物中的本發(fā)明的化合物劑量，并逐漸增加劑量直到達(dá)到所需的效果。一般本發(fā)明組合物每日的合適劑量是能產(chǎn)生療效的最低劑量化合物的量。這種有效量一般依賴于如上所述的因素。優(yōu)選的給藥可是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，或在靠近靶位點處給藥。如果需要，治療組合物每日的有效劑量全天以合適間隔，以任選的單位劑量形式，分2次、3次、4次、5次、6次或更多次給藥。當(dāng)本發(fā)明的化合物單獨給藥是可能的時候，優(yōu)選的以藥物制劑(組合物)施用化合物。本發(fā)明組合物的有效量對本發(fā)明描述的免疫相關(guān)病癥和疾病的治療，會依賴許多不同因素而發(fā)生變化，包括給藥方法、靶位點、病人的生理狀態(tài)、患者是人還是動物、其他施用的藥療法和是否治療是預(yù)防或是治療。治療劑量需要確定效價從而保證最安全和最有效。對于用抗體給藥，齊Li量范圍從約0. 0001到100mg/kg,更經(jīng)常0. 01到5mg/kg宿主體重。例如劑量能是lmg/kg體重或10mg/kg體重或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。一個作例證的治療方式需要給藥每兩周一次或每月一次或每3-6月一次。在一些方法中具有不同結(jié)合特異性的兩個或多個單克隆抗體同時給藥，在這種情況下，每個抗體給藥的劑量歸屬在所顯示的范圍內(nèi)。抗體通常以多種方式給藥。單一劑量間時間間隔能是一周、一月或一年。根據(jù)病人對CTLA-4的血液抗體水平的測定所顯示，間隔時間也能是不規(guī)則的。在一些方法中調(diào)整劑量以便血漿抗體濃度達(dá)到I-IOOOii g/ml以及在一些方法中達(dá)到25-300 ii g/ml?？蛇x擇的，抗體能作為持續(xù)的釋放制劑給藥，在這種情況下，需要降低給藥頻率。劑量和頻率依賴于病人中抗體的半衰期而變化。一般人抗體表現(xiàn)最長的半衰期，隨后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥的劑量和頻率依賴于處理是否是預(yù)防還是治療而變化。如預(yù)防應(yīng)用，給藥劑量相對低，給藥間隔時間相對長。一些病人余生繼續(xù)接受治療。如治療應(yīng)用，有時要求給藥劑量相對高，給藥間隔時間相對短，直到病情的發(fā)展降低或終止，以及優(yōu)選的直到病人表現(xiàn)出病癥部分或完全改善。此后病人給藥按照預(yù)防方案進(jìn)行。編碼免疫原的核酸劑量每個病人范圍從約IOng到lg，IOOng到lOOmg，I U g到IOmg,或30-300 u g DNA。感染性病毒載體每個劑量從10個到100個或更多個病毒粒發(fā)生變化。一些本發(fā)明的人類序列抗體和人單克隆抗體能制成制劑以確保體內(nèi)合適分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水性的化合物。為確保本發(fā)明的治療化合物跨過BBB(如果需要)，它們能制成制劑如脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體的方法，參見如美國專利4，522，811 ;5，374，548和5，399，331。脂質(zhì)體可包含一種或多種組成成分，這些成分選擇性地運輸?shù)教囟?xì)胞或器官中，因此增強了靶藥的傳遞(參見如V. V. Ranade (1989) J. Clin.Pharmacol. 29 :685)。作例證的祀向組成成分包括葉酸或生物素(參見如LOW等,美國專利 5, 416, 016);甘露糖苷(Umezawa 等(1988)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038);抗體(P. G. Bloeman 等(1995)，F(xiàn)EBS Lett. 357 140 ；M. Owais 等(1995)，Antimicrob. AgentsChemother. 39 180);表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe 等(1995), Am. J. Physiol. 1233 134)，組成本發(fā)明制劑的不同物質(zhì)以及發(fā)明的分子的成分；pl20 (Schreier等(1994)，J. Boil. Chem. 269 :9090);還參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen(1994), FEBS Lett. 346 123 ；J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994)，Immunomethods 4 :273。在一些方法中，本發(fā)明的治療化合物制成脂質(zhì)體；在一個更優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體包括尋靶組成成分。在一些方法中，脂質(zhì)體中的治療化合物由濃注傳遞到靠近腫瘤或感染的位點。該組合物應(yīng)是流體，其程度應(yīng)便于注射。它在制造和儲存條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，并應(yīng)抵御微生物如細(xì)菌和真菌污染。如應(yīng)用在治療上，藥物組合物給藥于患確定的病的病人，給藥量足夠阻止或抑制進(jìn)一步進(jìn)展，或反轉(zhuǎn)或消除疾病、其癥狀或生化標(biāo)記物。如應(yīng)用在預(yù)防上，藥物組合物給藥于易感染疾病或存在疾病危險的病人，給藥量足夠延遲、抑制或預(yù)防疾病、癥狀和生化標(biāo)記物的發(fā)展。足能達(dá)到上述結(jié)果的量定義為“治療有效量”或“預(yù)防有效量”。劑量依賴于治療中的疾病，被試者的大小，被試者癥狀的嚴(yán)重程度，特定組合物或選擇的給藥途徑。具體而言，在治療腫瘤中，“治療有效量”相對于未處理的被試者能夠抑制腫瘤生長至少約20 %，或至少約40%，或至少約60%，或至少約80%。化合物抑制癌癥的能力能在動物模型系統(tǒng)中評估，該系統(tǒng)能預(yù)測治療人類腫瘤的有效性。可選擇地，組合物的這種特點能由體外常規(guī)分析檢查化合物抑制能力進(jìn)行評估。治療有效量的治療化合物可減小腫瘤尺寸，或改善被試者的癥狀。組合物應(yīng)是無菌的且具有流動性，其程度到組合物能用注射器遞送。除水以外，載體能是等滲的緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，及其合適的混合物。維持合適的流動性，例如通過使用包衣如卵磷脂，在分散情況下通過維持要求的顆粒大小以及通過使用表面活性劑。在許多情況下組合物中優(yōu)選地包括等滲劑如糖，多元醇如甘露醇或山梨醇，以及氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收能由通過組合物中包括延遲吸收的作用物如一硬脂酸鋁或明膠而帶來。
當(dāng)活性化合物被適當(dāng)保護(hù)時，如上所述，化合物可ロ服給藥，如用惰性稀釋劑或可吸收的食用載體。B給藥途徑本發(fā)明的藥物組合物也能以組合療法給藥即與其他作用物組合。例如，在腫瘤治療中，組合療法包括本發(fā)明的組合物和至少ー種抗腫瘤劑或其他常規(guī)療法如輻射處理?？伤幱幂d體包括溶劑、分散媒介、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸附延遲劑等生理上相容的物質(zhì)。載體適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髄或表皮給藥(例如通過注射或輸液)。依賴給藥途徑，活性化合物即抗體，雙特異性和多特異性分子，被包裹在ー個物質(zhì)中以便保護(hù)化合物免遭酸作用以及其他使化合物失活的自然條件?！翱伤幱名}”是指這樣的鹽，其維持親本化合物所需的生物活性，并不傳遞任何不需要的毒理效果(參見如Berge, S. M.等(1977)，J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。這些鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些源自非毒性的無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫 酸、氫溴酸、氫磺酸、亞磷酸等的鹽，以及那些源自非毒性有機酸如脂肪族的單羧酸和ニ羧酸，苯基替代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，芳香族酸，脂肪族和芳香族磺酸等的鹽。堿加成鹽包括那些衍生自堿性土金屬如鈉、鉀、鎂、I丐等的鹽，以及衍生自非毒性有機胺如N，N’ - ニ芐基こニ胺，N-甲基葡糖胺，氯代普魯卡因，膽堿，ニこ醇胺，こニ胺，普魯卡因等的鹽。本發(fā)明的組合物采用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥。給藥途徑和/或方式依賴所需要結(jié)果而變化?；钚曰衔锱c載體一起制備，載體保護(hù)化合物免遭快速釋放，如制成控釋制齊U，包括移植片、透皮小塊膜片和微囊包埋運輸系統(tǒng)?？缮锝到獾?、生物相容的多聚物能被使用，如こ烯こ酸こ烯酯，聚酐，聚甘醇酸(polyglycolic acid),膠原蛋白，聚原酸酯,和聚乳酸。許多用于制備這些制劑的方法由如在Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems, J. R. Robinson 主編，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978 中描述。藥物組合物優(yōu)選在GMP條件下生產(chǎn)。為采用某些給藥途徑施用本發(fā)明的化合物，必須用物質(zhì)包被化合物，或與該物質(zhì)共施用化合物以防止其失活。例如，化合物可以合適的載體如脂質(zhì)體或稀釋劑施用給被試者?？伤幱孟♂寗┌}水和緩沖水溶液。脂質(zhì)體包括水中油中水(water-in-oi 1-in-water) CGF 乳池液以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan 等(1984),J. Neuroimmunol. 7 :27)。可藥用載體包括無菌的水溶液或分散體和無菌粉末，用于臨時準(zhǔn)備無菌可注射的溶液或分散體。使用該種媒介和作用物用于藥物活性物質(zhì)為本領(lǐng)域已知。除非任何常規(guī)媒介或作用物與活性化合物不相容，其在本發(fā)明藥物組合物中的應(yīng)用是可預(yù)期的。補充的活性化合物也能摻入到組合物中。治療組合物通常在生產(chǎn)和儲存條件下必須是無菌、基本等滲和穩(wěn)定的。組合物能制成溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其他適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體能是個溶劑或分散媒介，含有如水、こ醇、多元醇(如甘油、丙ニ醇和液體聚こニ醇等)和其合適的混合物。保持合適的流動性，如通過使用包衣如卵磷脂，通過在分散情況下維持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性剤。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。注射組合物的長期吸收能由通過組合物中包括延長吸收的物質(zhì)如ー硬脂酸鋁或明膠而帶來。
無菌注射溶液的制備方法是在ー種合適溶劑中將ー個或ー組上述所列舉的組分摻入所要求量的活性化合物中，如需要接著進(jìn)行無菌微量過濾。分散體的制備一般是將活性化合物摻入到無菌載體中，該載體含有基本的分散介質(zhì)和所要求的其他成分，這些成分如上面所列挙。在無菌粉末用于制備無菌注射溶液的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥(冷干)，該法從其先前無菌過濾過的溶液中產(chǎn)生活性成分和任何其他所需成分的粉末。治療組合物也能用本領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置給藥。如在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的治療組合物用無針皮下注射裝置給藥，如公開在如美國專利號5，399，163，5，383，851，5，312，335，5，064，413，4，941，880，4，790，824 或 4，596，556 的裝置。本發(fā)明有用的植入物和結(jié)構(gòu)組件實例包括美國專利4，487，603，其公開了可植入的微輸液泵用于以控制速率分派藥物；美國專利號4，486，194，其公開了從皮膚給藥的治療裝置；美國專利4，447，233，其公開了藥物輸液泵用于以精確輸液速率傳遞藥物；美國專利4，447，224，其公開了可植入的輸液裝置用于連續(xù)藥物傳遞；美國專利4，439，196，其公開了滲透藥物傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有多室的間隔間；和美國專利4，475，196，其公開了滲透藥物傳遞系統(tǒng)。許多其他這些植入物、傳遞系統(tǒng)和模塊已經(jīng)知曉。C 制劑 對治療組合物，本發(fā)明的制劑包括那些適合于ロ服、鼻甲、局部(包括口腔和舌下)、直腸的、陰道的和/或腸胃外的給藥。制劑能方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)和可采用制藥領(lǐng)域已知的方法制備?；钚猿煞至恳蕾囍委熤械谋辉囌吆吞囟ńo藥方式而發(fā)生變化，該活性成分能與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單ー劑量形式。能與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單ー劑量形式的活性成分的量一般是能夠產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般地，從100%中，這個量范圍從約0. 01%到約99%的活性成分，從約0. 1%到約70%或從約1%到約30%。適用于陰道給藥的本發(fā)明制劑包括陰道栓劑、棉塞、乳劑、凝膠、漿糊、泡沫或噴霧制劑，含有如本領(lǐng)域所知的合適的載體。用于局部或經(jīng)皮地施用本發(fā)明組合物的劑量形式包括粉末、噴霧、軟膏、漿糊、乳劑、洗液、凝膠、溶液、膏藥和吸入劑?；钚曰衔锱c可藥用載體可在無菌條件下混合，以及與任何防腐劑、緩沖液或可能要求的拋射劑混合。短語“腸胃外給藥”和“腸胃外施用的”意指除腸的和局部給藥以外的給藥方式，經(jīng)常采用注射，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼窩內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊髄內(nèi)、硬腦膜外和胸骨內(nèi)注射和輸液。合適水和非水載體的實施例可在本發(fā)明的藥物組合物中使用，包括水、こ醇、多元醇(如甘油、丙ニ醇和聚こニ醇等)，和其合適的混合物，植物油如橄欖油，以及可注射的有機酯如油酸こ鹽。例如通過使用包衣物質(zhì)，如卵磷脂，在擴(kuò)散情況下通過維持所需的顆粒大小，和通過使用表面活性劑，維持合適的流動性。這些組合物也可含有佐劑如防腐剤、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌程序(同上)和通過內(nèi)含各種抗細(xì)菌和抗真菌介質(zhì)，如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚山梨酸等，可確保預(yù)防微生物存在。也可理想地將等滲劑如糖，氯化鈉等加入到組合物中。此外，可注射藥物形式的延長吸收可由包含延長吸收物質(zhì)產(chǎn)生，如一硬脂酸鋁和明膠。當(dāng)本發(fā)明化合物作為藥物給藥給人和動物吋，它們能単獨給藥，或作為藥物組合物給藥，其中，含有如0. 01到99. 5% (或0. I到90% )的活性成分與可藥用載體。藥物組合物一般制成如無菌和基本等滲的制劑，并完全依從美國食品與藥品管理局(FDA)的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)條例。本發(fā)明的方法和用途A 方法本發(fā)明的組合物(如人類序列抗體和對人CTLA-4的人單克隆抗體和其衍生物/偶聯(lián)物)具有體外和體內(nèi)診斷和治療用途。例如，這些分子能如體外給藥于培養(yǎng)細(xì)胞，或如體內(nèi)給藥于被試者內(nèi)以便治療、預(yù)防或診斷各種失調(diào)。術(shù)語“被試者”包括人和非人類動物。非人類動物包括全部脊椎動物如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行類動物。這些方法特別適合于治療失調(diào)癥的人類患者，通過增強或降低T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能夠治療該失調(diào)。當(dāng)CTLA-4抗體與另ー個作用物一起給藥時，這兩者能按序給藥或同時給藥。這些方法能用作治療任ー種癌包括黑素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌。例如，用抗CTLA-4抗體包被的膠乳微球(為增加抗體的效價)能抑制T細(xì)胞增殖和活化。具有相同的抗體組合位點的作用物當(dāng)作為Fab或可溶性IgG出現(xiàn)的時候，可充當(dāng)CTLA-4拮抗劑，以及當(dāng)高度交聯(lián)時候，充當(dāng)CTLA-4激動劑。因此多價形式的抗CTLA-4抗體是有用的治療劑用作下降調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。除了與膠乳微球或其他不溶性顆粒外，抗體能相互交聯(lián)或以遺傳學(xué)方法改造形成多聚體。交聯(lián)能采用直接化學(xué)連接、或采用間接連接如抗體-生物素-抗生物素蛋白復(fù)合體。交聯(lián)能是共價的，這里使用化學(xué)連接基團(tuán)，或非共價，這里使用蛋白-蛋白或其他蛋白-配體相互作用。用于連接的遺傳工程方法包括如IgM表達(dá)載體或任何蛋白組成成分(如聚賴氨酸等)中的高親和性IgG抗體可變區(qū)的再表達(dá)。將高度親和性IgG抗體轉(zhuǎn)化為IgM抗體能創(chuàng)造出很高親合力的十價復(fù)合物。IgA2表達(dá)載體也可用作生產(chǎn)多價抗體復(fù)合物。IgA2能與J鏈和分泌的組分一起形成聚合體。IgA2可具有添加的優(yōu)勢,其能由IgA受體⑶89附加地交聯(lián)，該受體表達(dá)在嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中。
使用ー些對CTLA-4多克隆抗體的制劑也能產(chǎn)生拮抗作用，制劑含有對CTLA-4上的至少兩個非重疊表位的抗體。這種制劑中的ー個抗體含有兩個結(jié)合位點，能與CTLA-4的兩個分子結(jié)合以形成ー個小簇。第二個抗體擁有不同的結(jié)合位點，然后能連接(聚集)這些小簇以形成大簇，因此形成CTLA-4(在細(xì)胞表面)的復(fù)合物，該復(fù)合物能將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞上以便抑制、降低或阻止攜帯(表達(dá))CTLA-4的T細(xì)胞的活化。因此，多克隆抗體的一些制劑與上述的多價制劑顯示了相似的拮抗作用。因此，抗CTLA-4抗體的多價或多克隆制劑對拮抗CTLA-4受體是有用的，因而抑制由攜帯CTLA-4受體的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。疾病的一些實例能使用這種抗體的多價或多克隆制劑治療，這些疾病誘導(dǎo)自身免疫疾病，移植排斥和炎癥。B 用途I.激活免疫應(yīng)答a.癌癥一些治療方法治療癌癥病人。用抗體封閉CTLA-4能增強病人癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。可選擇地，對CTLA-4的抗體能與免疫原性劑組合，如癌細(xì)胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子)、細(xì)胞和以編碼免疫刺激細(xì)胞因子和細(xì)胞表面抗原如B7 的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(參見如 Hurwitz，A.等(1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95,10067-10071)。在鼠實驗系統(tǒng)中，一些腫瘤的植入接著施用抗CTLA-4抗體，能導(dǎo)致腫瘤排斥。在一些情況下，確定的腫瘤的腫瘤排斥發(fā)生；在其他情況下，腫瘤的生長因使用抗CTLA-4抗體而減慢。CTLA-4封閉一般對免疫原性腫瘤是有效的。操作上地，這限定為那些腫瘤，使用腫瘤本身的種痘能導(dǎo)致對腫瘤攻擊的免疫。在人類中，ー些腫瘤已經(jīng)顯示為免疫原性，如黑素瘤。可以預(yù)見采用由CTLA-4封閉來提高T細(xì)胞活化的閾值，我們可期待在宿主中激活腫瘤應(yīng)答。當(dāng)與種痘草案組合吋，CTLA-4封閉是最有效的。許多抗腫瘤種痘的實驗策略已經(jīng)設(shè)計出來(參見 Rosenberg, S. , 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCOEducational Book Spring :60-62 ；Logothetis, C. ,2000, ASCO Educational BookSpring :300-302 ；Khayat, D.2000，ASCO Educational Book Spring :414-428 ；Foon, K.，2000, ASCO Educational Book Spring :730-738 ;也參見 Restifo, N.和 Sznol, M. , CancerVaccines,第 61 章，3023-3043 頁，在 DeVita, V.等主編，1997, Cancer !Principles andPractice of Oncology, 5th Edition)。這些策略其中ー個中，疫苗制備采用自體的或同 種異體的腫瘤細(xì)胞。當(dāng)腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)GM-CSF時，這些細(xì)胞疫苗已經(jīng)表明是最有效的。GM-CSF已經(jīng)表現(xiàn)為抗原呈遞腫瘤種痘的ー個有力的激活劑(Dranoff等(1993)，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (80 :3539-43)?？笴TLA-4封閉與GMCSF修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗一起使用已經(jīng)表明是有效的，其用在許多實驗?zāi)[瘤模型中如乳腺癌(Hurwitz等(1998),同上)，初級前列腺癌(Hurwitz等(2000), Cancer Research 60(9) :2444-8)和黑素瘤(Van Elsas, A.等(1999), J. Exp.Med. 190 :355-66)。在這些例子中，已使非免疫原性腫瘤如B16黑素瘤易受到免疫系統(tǒng)的破壞。腫瘤細(xì)胞疫苗在其他疫苗中也可修飾表達(dá)其他免疫激活劑，如IL-2和共刺激的分子。多種腫瘤中基因表達(dá)研究和大規(guī)模基因表達(dá)模式已經(jīng)導(dǎo)致定義所謂的腫瘤特異性抗原(Rosenberg, SA (1999), Immunity 10:281-7)。在許多情況下,這些腫瘤特異性抗原是分化抗原，在腫瘤和腫瘤從中發(fā)生的細(xì)胞中表達(dá)，例如黑素細(xì)胞抗原gp 100，MAGE抗原，Trp-2。更重要地，許多這些抗原能顯示為在宿主中發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性T細(xì)胞的靶子。為了產(chǎn)生對這些蛋白的免疫應(yīng)答，CTLA-4封閉可與許多在腫瘤中表達(dá)的重組蛋白和/或肽聯(lián)用。這些蛋白通常被免疫系統(tǒng)判別為自身抗原，并因此對它們有耐受性。腫瘤抗原也可包括蛋白端粒酶，其對染色體的端粒合成是必要的，并在超過85%的人癌癥中表達(dá)和只在限制數(shù)目的體細(xì)胞組織中表達(dá)(Kim, N等(1994)，Science 266，2011-2013)。(這些體細(xì)胞組織可經(jīng)多種方法抵御免疫進(jìn)攻)。腫瘤抗原又可稱“neo抗原”，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，這是由于體細(xì)胞突變改變了蛋白序列或創(chuàng)造了兩個非相關(guān)序列的融合蛋白(即bcrabl，在費城染色體中)，或來自B細(xì)胞腫瘤的獨特型Ig。其他腫瘤疫苗可包括來自病毒的蛋白，這些病毒參與人類癌癥，如人乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西皰疫肉瘤病毒(KHSV)。腫瘤特異性抗原的另ー種形式可與CTLA-4封閉聯(lián)用，是純化的熱休克蛋白(HSP)，分離自腫瘤組織本身。這些熱休克蛋白含有來自腫瘤細(xì)胞蛋白的片段，并且這些HSP在傳遞給抗原呈遞細(xì)胞引發(fā)腫瘤免疫中是高效率的(Suot, R和Srivastava, P (1995), Science269 :1585-188 ；Tamura, Y 等(1997)，Science 278 :117-120)。樹突細(xì)胞(DC)是強有力的抗原呈遞細(xì)胞，能用于啟動抗原特異性應(yīng)答。DC能體外生產(chǎn)并裝載多種蛋白和肽抗原以及腫瘤細(xì)胞提取物(Nestle, F.等(1998), NatureMedicine 4:328-332)。DC也可用遺傳學(xué)方法轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)這些腫瘤抗原。DC為免疫目的還已經(jīng)與腫瘤細(xì)胞直接融合(Kugler, A.等(2000), Nature Medicine 6:332-336)。作為種痘方法，DC免疫可有效與CTLA-4封閉組合以便活化更強有力的抗腫瘤應(yīng)答。CTLA-4封閉也可與標(biāo)準(zhǔn)癌治療組合。CTLA-4封閉可有效地與化療方法組合。在這些例子中，可以降低所施用的化療試劑的劑量(Mokyr, M.等(1998), Cancer Research58 :5301-5304)。將CTLA-4封閉與化療組合使用的背后，其科學(xué)的基本原理是細(xì)胞死亡應(yīng)導(dǎo)致在抗原呈遞途徑中腫瘤抗原水平増加，細(xì)胞死亡是大多數(shù)化療化合物細(xì)胞毒性作用的結(jié)果。其他組合療法經(jīng)細(xì)胞死亡可導(dǎo)致與CTLA-4封閉的協(xié)同作用，這些療法是輻射、手術(shù)和激素剝奪(Kwon, E.等，(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (26) :15074-9) 這些每ー個草案創(chuàng)造出宿主中腫瘤抗原來源。血管發(fā)生抑制劑也可以是與CTLA-4封閉組合。血管發(fā)生抑制作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，可將腫瘤抗原加入到宿主抗原呈遞途徑。
CTLA-4封閉抗體能用在與雙特異性抗體的組合中，雙特異性抗體將Fe a或Fe Y受體表達(dá)性效應(yīng)細(xì)胞靶向到腫瘤細(xì)胞上(參見如美國專利號5，922，845和5，837，243)。雙特異性抗體能用于靶向兩個單獨抗原。例如抗-Fe受體/抗腫瘤抗原(即Her-2/neu)雙特異性抗體已經(jīng)用于將巨噬細(xì)胞靶向到腫瘤位點。這種靶向過程可更有效地激活腫瘤特異性應(yīng)答。這些應(yīng)答中的T細(xì)胞應(yīng)答將由CTLA-4封閉的使用而增強?？蛇x擇性地，采用雙特異性抗體，抗原可直接傳遞到DC，這些雙特異性抗體與腫瘤抗原和樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合。腫瘤逃避宿主免疫監(jiān)瞀有大量的機理。許多這些機理可由蛋白失活而克服，這些蛋白由腫瘤表達(dá)并且是免疫抑制的。其他蛋白包括TgfP (Kehrl, J.等(1986)，J. Exp.Med. 163 :1037-1050)、IL-IO(Howard, M.和 O，Garra, A. (1992)，Immunology Today 13 198-200)，和 Fas 配體(Hahne, M.等(1996)，Science 274:1363-1365)。對每ー個這些實體的抗體可用在與抗CTLA-4抗體的組合中以便抵消免疫抑制劑的效應(yīng)并促進(jìn)由宿主產(chǎn)生的腫瘤免疫應(yīng)答?？捎糜诨罨拗髅庖邞?yīng)答的其他抗體能用在與抗CTLA-4抗體的組合上。這些其他抗體包括樹突細(xì)胞表面上的分子，該分子活化DC功能和抗原呈遞。抗-CD40抗體能夠有效地替代T細(xì)胞輔助活性(Ridge, J.等(1998)，Nature 393 :474-478)，井能用在與CTLA-4 抗體的組合中(Ito，N.等(2000), Immunobiology 201(5)527-40)。對 T 細(xì)胞共刺激分子如 0X-40(Weinberg，A.等(2000)，J. Immunol. 164 :2160-2169)、4_1BB (Melero，I.等(1997),Nature Medicine 3 :682-685(1997))和 ICOS(Hutloff，A.等(1999),Nature 397 262-266)的活化抗體也可提供用于增加T細(xì)胞活化水平。骨髄移植當(dāng)前正用于治療各種造血源腫瘤。當(dāng)這種治療的結(jié)果是移植物對宿主的排斥反應(yīng)疾病吋，治療的好處就可從移植物對腫瘤應(yīng)答中獲得。CTLA-4封閉能用作增加由供體移入的腫瘤特異性T細(xì)胞的有效性(Blazar，B.等(1999)，J. Immunol. 162 6368-6377)。還有幾種實驗的治療方案為了抗腫瘤的抗原特異性T細(xì)胞，包含了抗原特異性T細(xì)胞的體外活化和擴(kuò)增以及將這些細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給接受者(Greenberg，R.和Riddell，S. (1999)，285 :546-51)。這些方法也可用于活化對感染性物質(zhì)如CMV (見下)的T細(xì)胞應(yīng)答?？笴TLA-4抗體存在下體外活化可期待増加過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的頻率和活性。b.傳染性疾病本發(fā)明其他方法用于治療已經(jīng)暴露給特定毒素或病原體的患者。與其應(yīng)用到如上所述的腫瘤相似，抗體介導(dǎo)的CTLA-4封閉能單獨或作為佐劑與疫苗組合用于刺激對病原體、毒素和自身抗原的免疫應(yīng)答。CTLA-4封閉已經(jīng)顯示在感染下列病原體的急性階段是有效的，巴西日本圓線蟲(McCoy, K.等(1997),186(2) =183-187)和杜氏利什曼蟲(Murphy,M.等(1998)，J. Immunol. 161 :4153-4160)。該治療方法特別適用的病原體例子包括目前沒有有效疫苗的病原體，或常規(guī)疫苗不完全有效的病原體。這些病原體包括但不限于HIV、肝炎病毒(A、B和C)、流感病毒、皰疹病毒、賈弟鞭毛蟲、瘧疾、利什曼原蟲屬、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌。CTLA-4封閉對于抗確定的傳染尤其有用，這些傳染由介質(zhì)如HIV引起，并在傳染過程中存在改變的抗原。這些新型表位在施用抗人CTLA-4的時候被識別為外來表位，因此引起了強力T細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答不為經(jīng)CTLA-4的負(fù)信號所阻抑。
致病病毒引起感染，這些感染可由本發(fā)明方法治療。這樣ー些致病病毒的例子包括肝炎病毒(A、B或C)、皰疹病毒(如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疫病毒、風(fēng)疫病毒、細(xì)小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髄灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒。致病細(xì)菌引起感染，這些感染可由本發(fā)明方法治療。這樣ー些致病細(xì)菌的例子包括衣原體、立克次氏體細(xì)菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團(tuán)菌、白喉、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂、破傷風(fēng)、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病、萊姆病菌。致病真菌引起感染，這些感染可由本發(fā)明方法治療。這樣ー些致病真菌的例子包括念珠菌屬(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、平滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、曲霉屬(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉囷目的囷種(毛霉囷屬、舉頭霉屬、根霉囷屬(Rhizophus))、Sporothrix Schenkii、皮炎芽生菌、巴西芽生菌、粗球孢子菌和英膜組織胞漿菌。致病寄生蟲引起感染，這些感染可由本發(fā)明方法治療。這樣ー些致病寄生蟲的例子包括痢疾內(nèi)變形蟲、結(jié)腸小袋蟲、Naegleria fowleri、棘變形蟲種、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、隱刨子蟲種、卡氏肺刨子蟲、瘧原蟲、微小巴貝蟲、布氏錐體蟲、克氏錐體蟲、杜氏利什曼蟲、岡氏弓形蟲、巴西日本圓線蟲。在以上所有方法中，CTLA-4封閉能與免疫療法的其他形式組合，這些形式如細(xì)胞因子治療(如干擾素、GM-CSF, GCSF和IL-2)或雙特異性抗體治療，其提供了增強的腫瘤抗原呈遞作用(參見如 Holliger (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak(1994)，Structure 2 :1121-1123)。c.促進(jìn)有益的“自身免疫”反應(yīng)用于疾病治療和治療干預(yù)抗CTLA-4抗體引發(fā)和擴(kuò)增自身免疫應(yīng)答的能力已被記錄在許多實驗系統(tǒng)中(EAE-實驗自身免疫腦脊髄炎，為ー種鼠模型，針對MS (Perrin，P.等(1996)，J Immunol157(4) :1333-1336);糖尿病(Luhder, F.等(1998)，同上))。事實上，采用腫瘤細(xì)胞和肽疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答掲示出許多抗腫瘤應(yīng)答涉及抗自身反應(yīng)性(在抗CTLA-4+GM-CSF修飾的B16黑素瘤中觀察到除色素(van Elsas等，同上)；在Trp_2預(yù)防接種的小鼠中的除色素(Overwijk,ff.等(1999) ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 :2982-2987);由 TRAMP 腫瘤細(xì)胞疫苗引發(fā)的自身免疫前列腺炎(Hurwitz，A. (2000)，同上))、黑素瘤肽抗原預(yù)防接種以及在人類臨床實驗中所觀察的白癜風(fēng)(Rosenberg, SA和White, DE (1996) ,J ImmunotherEmphasis Tumor Immunol 19 u) :8ト4)。因此與多種自身蛋白協(xié)カ考慮使用抗CTLA-4封閉以設(shè)計種痘方案以便有效地生成用于治療疾病的抗這些自身蛋白的免疫應(yīng)答。例如，老年性癡呆癥涉及腦中在淀粉樣蛋白沉積物中不合適地積累AP肽；抗淀粉樣蛋白的抗體應(yīng)答能清除這些淀粉樣蛋白沉積物(Schenk 等(1999)，Nature 400 :173-177)。其他自身蛋白也可用作靶子如IgE，用于治療過敏和哮喘，和TNF用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。最后，對多種激素的抗體應(yīng)答可采用抗CTLA-4抗體誘導(dǎo)。對再生激素的中和抗體應(yīng)答可用于避孕。對激素和其他可溶性因子的中和抗體應(yīng)答也可當(dāng)作可能的種痘靶子，這些激素和可溶性因子對于特定腫瘤生長是必需的。 如上描述的類似方法采用抗CTLA-4抗體，能用于誘導(dǎo)治療自身免疫應(yīng)答來治療患者，該患者不合適地積累其他自身抗原，如淀粉樣蛋白沉積，包括老年癡呆癥中的AP、細(xì)胞因子如TNFa和IgE02.使免疫應(yīng)答失活由免疫應(yīng)答引起的失調(diào)稱為超敏性疾病。由自我耐受性失靈引起的疾病和隨后抗自我或自體抗原的免疫應(yīng)答稱為自身免疫疾病。超敏性疾病也能由未控制的或過分的抗外源抗原如微生物的應(yīng)答產(chǎn)生。雖然對人CTLA-4的可溶性抗體已經(jīng)表現(xiàn)為促進(jìn)T細(xì)胞的擴(kuò)充和活化(即當(dāng)CTLA-4功能(如與配體結(jié)合)受到抑制；在本情況中抗體是對CTLA-4功能的拮抗物)，但這些相同抗體價的增加產(chǎn)生了相反的效果(然而現(xiàn)在，相反，抗體充當(dāng)CTLA-4的興奮劑以便抑制免疫應(yīng)答)(參見如 Krummel 和 Allison，1996，J. Exp. Med. 183，2533-2540)。為了使抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答失活的目的，如那些是致病性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的靶子的應(yīng)答，對這些T細(xì)胞特異的靶抗原(即抗原和/或MHC/抗原復(fù)合物)必須以抗CTLA-4抗體的多價形式施用。a.發(fā)炎發(fā)炎表示毛細(xì)管擴(kuò)張的結(jié)果，伴有流體積累和吞噬細(xì)胞白細(xì)胞的遷移，如粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。發(fā)炎在防衛(wèi)宿主抗各種傳染中是重要的，但在炎癥的失調(diào)中也能有不合需要的結(jié)果，如過敏性休克、關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)和局部缺血-再灌注。活化的T細(xì)胞在發(fā)炎中有重要的調(diào)節(jié)作用，釋放干擾素Y和集落刺激因子，這些因子又活化吞噬細(xì)胞白細(xì)胞?；罨耐淌杉?xì)胞白細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)許多特異性細(xì)胞表面分子，術(shù)語稱為歸巢受體，適用于將吞噬細(xì)胞連接到靶內(nèi)皮細(xì)胞。炎癥反應(yīng)能用本發(fā)明治療劑治療來降低或消除。例如，抗CTLA-4抗體的多價制劑阻斷了活化的T細(xì)胞的活化，由此阻止這些細(xì)胞釋放活化吞噬細(xì)胞類型所要求的分子。b.自身免疫疾病其中免疫抑制為所需的進(jìn)ー步情形是在治療自身免疫疾病中，如胰島素依賴的糖尿病、多發(fā)性硬化癥、僵人綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無カ和紅斑狼瘡。這些病中身體發(fā)展出抗ー種它自身抗原的細(xì)胞和/或體液的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致該種抗原的破壞和潛在的致殘的和/或致命的結(jié)果?；罨腡細(xì)胞被認(rèn)為在許多自身免疫疾病如糖尿病中發(fā)揮主要作用。自身免疫疾病由施用本發(fā)明的一種治療劑治療，該種治療劑抑制T細(xì)胞活化。自身免疫疾病針對自身抗原或其片段，可選擇地，在施用免疫抑制劑不久前，同時地與免疫抑制劑施用，或施用免疫抑制劑不久后，此自身抗原或其片段能被施用。用這種方式，對自身抗原的耐受性趁著抑制治療能被誘導(dǎo)出，由此消除對連續(xù)免疫抑制的需要。參見如Cobbold等，WO 90/15152(1990)。c.移植物對宿主排斥反應(yīng)疾病本發(fā)明治療劑的相關(guān)應(yīng)用是在于調(diào)節(jié)包含在“移植物對宿主”排斥反應(yīng)疾病(GVHD)中的免疫應(yīng)答。GVHD是潛在致命的疾病，當(dāng)免疫活性細(xì)胞轉(zhuǎn)移給同種異體的接受者時疾病發(fā)生。在這種情形下，供體的免疫活性細(xì)胞可進(jìn)攻接受者的組織。皮膚組織、內(nèi)臟上皮細(xì)胞和肝臟是常見的靶子，并且在GVHD過程中可被破壞。該疾病當(dāng)免疫組織被移植時就出現(xiàn)了ー個特別嚴(yán)重的問題，如在骨髄移植時；但在其他案例中較輕的GVHD也有報道，包括心臟和肝臟移植。本發(fā)明的治療劑用于抑制供體白細(xì)胞活化，由此抑制宿主中溶解靶細(xì)胞的能力。 d.移植排斥近些年來在組織和器官移植手術(shù)技術(shù)的效率方面已有相當(dāng)?shù)母纳?，如移植皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺、胰腺和骨髄。也許主要的突出問題是缺乏滿意的作用物用于誘導(dǎo)接受者對移植的同種異體移植物或器官的免疫耐受性。當(dāng)同種異體的細(xì)胞或器官移植到宿主中時(即供體和受贈者是來自相同種的不同個體)，宿主免疫系統(tǒng)可能增強對移植物中的外源抗原的免疫應(yīng)答(宿主對移植物排斥反應(yīng)疾病)，導(dǎo)致移植的組織受破壞。CD8+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和單核細(xì)胞都參與了移植組織的排斥。本發(fā)明的治療劑在受贈者中用于抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的同種抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，由此防止這類細(xì)胞參加移植組織或器官的破壞。B.檢測/測定樣品中是否存在CTLA-4的方法本發(fā)明進(jìn)ー步提供了檢測樣品中是否存在CTLA-4抗原或測定人CTLA-4抗原的量的方法，包括用人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分接觸樣品和對照樣品，在允許形成抗體或其部分和人CTLA-4間的復(fù)合物的條件下，該抗體與人CTLA-4特異性地結(jié)合。復(fù)合物的形成然后被檢測，其中與對照樣品比較，樣品間復(fù)合物形成差別是樣品中是否存在人CTLA-4抗原的指征。C.試劑盒試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該試劑盒包括本發(fā)明的組合物(如人類序列抗體、人抗體、多特異性和雙特異性分子)和使用說明書。該試劑盒能進(jìn)一歩包含至少ー種另外試劑，或一種或多種本發(fā)明其他人抗體(如人抗體，其具有補充活性，能與CTLA-4抗原中表位結(jié)合，截然區(qū)別于第一個人抗體)。試劑盒通常包括一個標(biāo)簽，簡要地說明了試劑盒內(nèi)容的目的用途。術(shù)語標(biāo)簽包括任何字跡或記載的物品，物品是在試劑盒上或與試劑盒一起提供的，或以別的方式伴隨試劑盒的東西。
實施例實施例I Cmu靶向小鼠的產(chǎn)生CMD靶向載體的構(gòu)建
質(zhì)粒pICEmu含有鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段，該片段跨越mu基因，從Balb/C基因組入噬菌體文庫中獲得(Marcu等，Cell 22:187,1980)。這種基因組片段亞克隆到質(zhì)粒 pICEMI9H 中的 XhoI/EcoRI 位點上(Marsh 等，Gene 32 :481-485,1984)。包括在質(zhì)粒pICEmu中的重鏈序列從剛好位于mu內(nèi)含增強子3’端的EcoRI位點的下游延伸到位于mu基因最后跨膜外顯子下游約Ikb的XhoI位點；但在E. coli傳代過程中許多mu轉(zhuǎn)換重復(fù)區(qū)已經(jīng)缺失。革巴向載體如下構(gòu)建(參見圖I)一個I.3kb的Hindlll/Smal片段從質(zhì)粒pICEmu中切除并亞克隆到 Hindlll/Smal 消化的質(zhì)粒 pBluescript 中(Stratagene, La Jolla,CA)。該質(zhì)粒pICEmu片段從位于Cmul的5’端約Ikb的HindIII位點延伸到位于Cmul內(nèi)的SmaI位點上。所得的質(zhì)粒用Smal/Spel消化,插入來自質(zhì)粒pICEmu約4kb的Smal/Xbal片段，其即從Cmul3’端的SmaI位點延伸到僅僅位于最后ー個Cmu外顯子的下游的XbaI位點。所得質(zhì)粒pTARl在SmaI位點線性化,并且插入ー個neo表達(dá)彈夾。該彈夾由小鼠磷酸甘油酸激酶(Pgk)啟動子(Xbal/TaqI片段；Adra等(1987)，Gene 60 :65-74)控制下的neo基因組成并含有pgk的多腺苷酸化位點(PvuII/Hindlll片段；Boer等(1990),Biochemical Genetics 28:299-308)。該彈夾從質(zhì)粒 pKJl (由 Tybulewicz 等(1991), Cell 65 :1153-1163描述)獲得，neo彈夾從該質(zhì)粒中切割成EcoRI/Hindlll片段，并亞克隆到用EcoRI/Hindlll消化的質(zhì)粒pGEM_7Zf (+)生成質(zhì)粒pGEM_7 (KJl)。neo彈夾從質(zhì)粒pGEM-7 (KJl)中用EcoRI/Sall消化切割，產(chǎn)生平末端，并以基因組Cmu序列的反方向亞克隆到質(zhì)粒pTARl的SmaI位點上。所得的質(zhì)粒用Not I線性化，單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(tk)彈夾插入允許富集攜帶同源性重組子的ES克隆,如Mansour等(1988) Nature 336 348-352所描述的。該彈夾由tk基因的編碼序列組成，該tk基因序列用小鼠pgk啟動子和多腺苷化位點括起來，如Tybulewicz等(1991)Cell 65 :1153-1163描述。所得CMD靶向載體中有共約5. 3kb重鏈基因座的同源物，并設(shè)計成生成突變mu基因，其中在第一個Cmu外顯子的獨特SmaI位點已插入了 neo表達(dá)彈夾。祀向載體用PvuI線性化,其在電穿孔進(jìn)入ES細(xì)胞之前，在質(zhì)粒序列內(nèi)切斷。靶ES細(xì)胞的生成和分析AB-IES 細(xì)胞(McMahon, A. P.和 Bradley, A. (1990)，Cell 62 :1073-1085)生長在有絲分裂失活SNL76/7細(xì)胞飼養(yǎng)層(參考同上)，實質(zhì)上如Robertson (Robertson (1987)，ieratocarcmomas and Embryonic Stem Cells a Practical Approach (E. J. Robertson王編)Oxford :IRL Press, 71-112頁)所描述。線性化的CMD革巴向載體采用Hasty等(Hasty,P. R.等(1991)，Nature 350 =243-246)描述的方法電穿孔到AB-I細(xì)胞中。電穿孔細(xì)胞以1-2X106細(xì)胞/平皿的密度鋪到IOOmm的培養(yǎng)皿上。24小時后，G418 (200 y g/ml活性組分)和FIAU(5X10-7M)加入到培養(yǎng)基中，抗藥物的克隆允許生長發(fā)育8-9天。挑出克隆，胰蛋白酶化，分成二部分并進(jìn)ー步擴(kuò)充。衍生自每個克隆的細(xì)胞一半冷凍，另一半分析用于載體和靶序列間的同源性重組。DNA分析通過Southern印跡雜交進(jìn)行。DNA從克隆中分離如Laird等所描述(Laird, P. W.等(1991)，Nucleic Acids Res. 19 :4293)。分離的基因組 DNA 用 SpeI 消化，并用915bp的SacI片段探針A(圖I)作探針，其與介于mu內(nèi)含增強子和mu轉(zhuǎn)換區(qū)域間的序列雜交。探針A檢測到一個來自野生型基因座的9. 9kb的SpeI片段和一個來自mu基因座的診斷性的7. 6kb的條帶，該基因座已經(jīng)同源性地與CMD靶向載體重組(neo表達(dá)彈夾含ー個SpeI位點)。在由Southern印跡分析所篩選的1132個G418和FIAU抗性克隆中就有3個表現(xiàn)出7. 6kb的SpeI條帶，這是mu基因座中同源性重組的指征。這三個克隆進(jìn)ー步用酶BglI、BstXI和EcoRI消化以便證實載體同源性地整合到mu基因中。當(dāng)與探針A雜交時，野生型DNA的Southern印跡用BglKBstXI或EcoRI消化分別產(chǎn)生15. 7,7. 3和12. 5kb的片段，而靶向的mu等位基因的存在分別由7. 7,6. 6和14. 3kb的片段指出。所有3個陽性克隆由SpeI消化檢測到，顯示了所預(yù)料的BglI、BstXI和EcoRI限制性片段，通過它們可診斷已將neo彈夾插入到Cmul外顯子中。攜帶突變mu基因小鼠的產(chǎn)生三個靶向的ES克隆，指定編號為264、272和408，解凍并注射到C57BL/6J囊胚泡如由Bradley所描述(Bradley,A. (1987),Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells a Practical Approach (E. J. Robertson 主編)Oxford :IRL Press, 113-151 頁)。將注射的囊胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性的子宮中從而產(chǎn)生嵌合小鼠，表現(xiàn)為衍生自輸入ES細(xì)胞和宿主囊胚泡的細(xì)胞混合物。ES細(xì)胞貢獻(xiàn)給嵌合體的含量，在黒色C57BL/6J背景上，能由衍生自 ES細(xì)胞系的野灰色層的顯色量進(jìn)行視覺評估?？寺?72和408只產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即低百分比的野灰色色素形成)，但克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/6J雌性一起繁殖，由此生成野灰色的子代，這是ES細(xì)胞基因組的種系傳輸?shù)闹刚?。篩選祀向mu基因由Southern印跡分析用BglI消化來自尾巴活體解剖的DNA來進(jìn)行(如上所述用于分析ES細(xì)胞DNA)。除野生型條帶15. 7kbタト，有約50%的野灰色子代顯示雜交BglI條帶7. 7kb，這表明靶向mu基因的種系傳輸。轉(zhuǎn)基因小鼠用于mu基因功能性失活的分析為了測定neo彈夾插入到Cmul是否已使Ig重鏈基因失活，克隆264嵌合體與為JHD突變純合的小鼠繁殖，該嵌合體因缺失JH基因區(qū)段結(jié)果使重鏈表達(dá)失活(Chen等(1993)，Immunol. 5 :647-656)。四個野灰色子代產(chǎn)生。血清從年齡ー個月的這些動物中獲得，并由ELISA進(jìn)行分析用于證實是否存在鼠IgM。四個子代中的兩個完全缺乏IgM(表I)。通過Southern印跡分析用BglI消化和用探針A雜交來自尾巴活體解剖的DNA來確定四個動物基因型(圖I)，和通過Southern印跡分析用StuI消化和用475bp的EcoRI/StuI片段雜交來自尾巴活體解剖的DNA來確定四個動物基因型(同上圖I)，表明不能表達(dá)血清IgM的動物是那些動物，其中重鏈基因座的ー個等位基因攜帯JHD突變，另ー個等位基因攜帶Cmul突變。為JHD突變雜合的小鼠展示了血清Ig的野生型水平。這些數(shù)據(jù)表明Cmul突變使mu基因表達(dá)失活。
^FlI 血清 IgM (j^/ml)~IgH 鏈基因型
42<0.002CMD/JHD
43196十/JHD
44<0.002CMD/JHD
45174十/JHD 129XBL6 Fl 153 十/十
JHD[<0.002f JHD/ JHD :
表I.血清IgM的水平，由ELISA檢測，對攜帶CMD和JHD突變(CMD/JHD)的小鼠，對為JHD突變雜合(+/JHD)的小鼠，對野生型(129SvXC57BL/6J)Fl小鼠(+/+)，和對為JHD突變純合(JHD/JHD)的B細(xì)胞缺損的小鼠進(jìn)行檢測。實施例2. HCo12轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因HCo12 轉(zhuǎn)基因由 pHC2 (Taylor 等，1994，Int. Immunol.，6 :579-591)的 80kb 插入物和pVx6的25kb插入物共注射產(chǎn)生。質(zhì)粒pVx6如下所述構(gòu)建。8. 5kb Hindlll/Sall DNA片段，包括與約2. 5kb的5，側(cè)翼基因組序列和5kb的3’側(cè)翼基因組序列一起的種系人VH1-18(DP-14)基因，亞克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pSP72(Promega，Madison, WI)從而生成質(zhì)粒 p343. 7. 16。7kb BamHI/Hindlll DNA 片段，包括與約 5kb 的 5’側(cè)翼基因組序列和Ikb的3’側(cè)翼基因組序列一起的種系人VH5-51(DP-73)基因，克隆進(jìn)基于 PBR322 基質(zhì)?？寺≥d體 pGPlf 中(Taylor 等，1992，Nucleic Acids Res. 20 :6287-6295) 從而生成質(zhì)粒p251f。衍生自pGPlf，pGPlk(Seq. ID#1)的新克隆載體，用EcoRV/BamHI消化并連接到ー個IOkb的EcoRV/BamHI DNA片段，其包括與約4kb的5’側(cè)翼基因組序列和5kb的3，側(cè)翼基因組序列一起的種系人VH3-23(DP-47)基因。所得質(zhì)粒pll2. 2RR. 7用BamHI/Sall消化并與7kb純化的P251fBamHI/SalI插入物相連接。所得質(zhì)粒pVx4用XhoI消化并與8. 5kb的p343. 7. 16XhoI/SalI插入物連接。獲得以如其他兩個V基因相同方向帶有VH1-18基因的克隆。該克隆指定為pVx6，用NotI消化并純化，純化所得的26kb插入物與純化的80kb pHC2的NotI插入物一起以I : I摩爾比率共注射到ー個半天(C57BL/6JXDBA/2J)F2 胚胎的前核中，如由 Hogan 等描述(B. Hogan 等,Manipulating theMouse Embryo,A Laboratory Manual,2n_ edition, 1994,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview NY)。三個獨立的轉(zhuǎn)基因小鼠系含有來自Vx6和HC2的序列，從接受注射的胚胎發(fā)育來的小鼠建立。這些系指定為(HCol2) 14881，(HCol2) 15083和(HCol2) 15087。三個系的每ー個然后與含有CMD突變(實施例I中描述)、JKD突變(Chen等，1993，EMBOJ. 12 :811-820)和(KCo5)9272 轉(zhuǎn)基因(Fishwild 等，1996，Nature Biotechnology 14:845-851)的小鼠繁殖。所得的小鼠在純合的用于內(nèi)源性小鼠重鏈和K輕鏈基因座破裂的背景下表達(dá)人重鏈和K輕鏈轉(zhuǎn)基因。實施例3.人IgG K抗人CTLA-4單克隆抗體的產(chǎn)生基于細(xì)胞的抗原編碼融合蛋白的DNA區(qū)段含有來自人CTLA-4和鼠⑶3 4基因，由PCR擴(kuò)增帶有橋接合成寡核苷酸的cDNA克隆構(gòu)建。編碼的融合蛋白含有下列序列i.編碼氨基酸1-190的人CTLA-4序列(含有信號肽，人CTLA-4的胞外結(jié)構(gòu)域和全部人CTLA-4假定的跨膜序列)和ii鼠⑶3 從氨基酸52到羧基端序列(Weissman等(1988), Science 239 1018-1021)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中，并測定DNA序列。然后克隆插入物亞克隆到載體PBABE (含有基因，其編碼嘌呤霉素抗性(Morganstern，JP和Land，H Nucl. AcidsRes. 18 :3587-96(1990))從而創(chuàng)造 pBABE-huCTLA_4/CD3z。pBABE-huCTLA_4/CD3z 轉(zhuǎn)染到反轉(zhuǎn)錄病毒包裝系，V-2,篩選出一組嘌呤霉素抗性細(xì)胞。這些細(xì)胞與鼠T細(xì)胞雜交瘤BW5147 (ATCC#TIB-47)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)2天后，非粘著性BW5147細(xì)胞被取出并篩選出嘌呤霉素抗性細(xì)胞。嘌呤霉素抗性的細(xì)胞組由限制稀釋亞克隆并由FACS用于人CTLA-4表面表達(dá)測試。高水平表達(dá)細(xì)胞表面上人CTLA-4的克隆被篩選出來?？扇苄钥乖亟MCTLA-4融合蛋白含有人CTLA-4的胞外結(jié)構(gòu)域，購自R&DSystems (Cat. #325-CT_200)。胞外CTLA-4片段的制備采用在位于CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域的C末端后的因子Xa蛋白酶切割位點上蛋白水解切割CTLA-4融合蛋白。融合蛋白用因子Xa以融合蛋白與因子Xa 50 I的比率處理，并將CTLA-4片段通過蛋白G-瓊脂糖傳代和MonoQ HPLC分離。柱層析組分采用SDS-PAGE和與表達(dá)小鼠B7分子的細(xì)胞(LtkmB7. I :用小鼠B7. IcDNA克隆表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的小鼠Ltk (-)細(xì)胞)結(jié)合檢測是否存在人CTLA-4 ニ聚體。收集陽性組分并在PBS緩沖液中透析。轉(zhuǎn)基因小鼠兩個不同品系的小鼠用于生成CTLA-4反應(yīng)性單克隆抗體。品系((CMD) ++ ； (JKD)++ ； (HCo7) 11952+/++ ； (KCo5) 9272+/++),和品系((CMD)++; (JKD)++;(HCol2) 15087+/++;(KCo5) 9272+/++)。這些品系的每ー個對于內(nèi)源性小鼠重鏈和k輕鏈基因座破裂是純合的。兩品系皆包括人K輕鏈轉(zhuǎn)基因(KCo5)，并且個體動物對插入#11952是半合的或純合的。兩品系在所用的人重鏈轉(zhuǎn)基因中有區(qū)別。小鼠對HCo7或HCol2轉(zhuǎn)基因是半合的或純合的。CMD突變描述在上的實施例I中。(HCol2) 15087小鼠的產(chǎn)生在實施例 2 中描述。JKD 突變(Chen 等，1993，EMBO J. 12 :811-820)和(KCo5) 9272 (Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14 :845-851)和(HCo7) 11952 小鼠在美國專利號5, 770, 429 (Lonberg & Kay, 6/23/98)中描述。免疫轉(zhuǎn)基因小鼠用1-3 X IO7個磷酸緩沖液(PBS)中的細(xì)胞或佐劑中(完全弗氏佐劑或Ribi氏佐劑)的10-50ii g可溶性蛋白初始經(jīng)腹膜內(nèi)免疫。免疫小鼠隨后每隔2-4周用1-3X IO7個PBS中的細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)加強免疫。對動物執(zhí)行該方案2-5個月。融合前，動物在第_3天和-2天用大約IO6個細(xì)胞或10-20 ii g可溶性抗原(融合蛋白或融合蛋白和胞外部分)經(jīng)靜脈注射加強免疫。成功的融合導(dǎo)致CTLA-4反應(yīng)性IgGK單克隆抗體，從免疫小鼠采用多種方案獲得，包括只有細(xì)胞、只有可溶性抗原，和細(xì)胞免疫跟著融合前靜脈注射可溶性抗原。融合脾臟細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)步驟融合到小鼠雜交瘤細(xì)胞中(系P3 X63 Ag8. 6. 53，ATCC CRL1580，或 SP2/0-Agl4，ATCC CRL 1581) (Harlow 和 Lane，1988，Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor New York ；Kennett等，1980，Monoclonal Antibodies Hybridomas A New Dimension in BiologicalAnalysis. Plenum, New York ；0i 和 Hertzenberg，1980，Immunoglobulin ProducingHybrid Cell Lines，在 Selected Methods In Cellular Immunology，Mishe丄丄矛ロ Shiigi主編，357-372 頁.Freeman，San Francisco ;Halk，1984，Methods in Enzymology PlantMolecular Biology, Weissbach 和 Weissbach 主編，766-780 頁，Academic Press, Orlando,FL) o 細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM、10%FBS、0PI (Sigma 0-5003)、BME (Gibco 21985-023)、3%起源雜交瘤克隆因子(Igen IG50-0615)，和5%P388dl(ATCC TIB 63)的條件培養(yǎng)基中。HAT或HT補充物在初始生長和選擇過程中加到培養(yǎng)基中。
雜交瘤篩選為鑒定分泌人IgGK抗體的雜交瘤，ELISA板(Nunc MaxiSorp)用IOOii I/孔的PBS 中 I u g/ml 的羊抗人 Fe y 特異性抗體(Jackson Tmmuno Research# 109-006-098)包被4°C過夜。洗滌板并用100 u I/孔含1% BSA的PBS-吐溫封閉。加入50 u I細(xì)胞培養(yǎng)上清液接著溫育1-2小吋。洗滌板然后用IOOiU/孔與堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶(Sigma#A-3813，或#A-7164)偶聯(lián)的羊抗k輕鏈溫育I小時。每步間用PBS-吐溫洗滌板三次。類似的分析用于鑒定分泌與人CTLA-4反應(yīng)的人抗體的雜交瘤。除了 ELISA板用重組CTLA-4融合蛋白而不是羊抗人Fe y抗體包被外，本分析是相同的。單克隆抗體的特性 72個雜交瘤由ELISA顯示為分泌與人CTLA-4結(jié)合的人IgGK，進(jìn)行亞克隆。這些亞克隆中的47個被檢測確定分泌的人抗體是否與CTLA-4表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，和抗體是否抑制可溶性CTLA-4與表達(dá)B7的細(xì)胞結(jié)合。結(jié)合采用流式細(xì)胞儀測定。為測定抑制，每個上清液50 ill用IO5個LtkmB7. I細(xì)胞和25ng重組CTLA-4融合蛋白溫育。平均通道熒光然后用流式細(xì)胞儀測定。圖2顯示了抑制可溶性CTLA-4與表達(dá)B7. I的細(xì)胞結(jié)合。用重組人CTLA-4融合蛋白染色LtkmB7. I細(xì)胞，測定雜交瘤上清液存在下該細(xì)胞的平均通道熒光(MCF)。分泌封閉抗體的雜交瘤導(dǎo)致較低的MCF值。BNI3. I (Cat. #34580D, Pharmingen, San Diego,CA)用作阻斷CTLA-4/B7結(jié)合的陽性對照小鼠單克隆抗體。大約40%的雜交瘤出現(xiàn)強カ地抑制CTLA-4與B7配體的結(jié)合。來自克隆10D1. 3，4B6. 12 和 11E8 的抗體由 BIAcore (Biacore AB, Uppsala,Sweden)分析以測定結(jié)合動力學(xué)。純化的重組CTLA-4胞外片段連結(jié)到CM5傳感器芯片01200RU上。結(jié)合以流速為5 iil/分鐘加入濃度為0. 25，0. 5，1，2. 5和5 ii g/ml抗體進(jìn)行測定。結(jié)合曲線米用 BIAevaluation 軟件(Biacore AB, Uppsala, Sweden)與 Langmuir 結(jié)合
模型擬合?？贵w用蛋白A瓊脂糖層析純化。測定的開和關(guān)速率顯示在表2中
權(quán)利要求
1.分離的人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其與參比抗體競爭與人CTLA-4多肽的結(jié)合，所述參比抗體包括含有具有SEQ ID NO :17所示的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，以及具有SEQ ID NO :7所示的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其中單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分具有IO8M4或更高的結(jié)合親和性。
2.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體能夠以IO9M-1或更高的結(jié)合親和性結(jié)合人CTLA-4。
3.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體與非淋巴組織不發(fā)生交叉反應(yīng)。
4.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體不結(jié)合小鼠CTLA-4。
5.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體能夠結(jié)合獼猴CTLA-4。
6.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求I的抗體的輕鏈可變區(qū)。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸，其中所述核酸包括SEQID NO :6，8或12所示的核苷酸 序列。
8.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求I或2的抗體的重鏈可變區(qū)。
9.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述核酸包括SEQID NO :16，18或22所示的核苷酸序列。
10.載體，其包括權(quán)利要求6-9任一項的核酸。
11.權(quán)利要求10的載體，其中所述載體為質(zhì)?；虿《据d體。
12.分離的重組宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求10或11的載體。
13.用于誘導(dǎo)、增強或延長對抗原的免疫應(yīng)答的藥物組合物，包括 (a)權(quán)利要求I的抗體，其量有效誘導(dǎo)，增強或延長對抗原的免疫應(yīng)答；以及 (b)可藥用載體。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中抗原為 (a)腫瘤抗原，或 (b)病原體抗原。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中抗原來自病原體，所述病原體選自病毒，細(xì)菌，真菌或寄生蟲。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中病原體為HIV。
17.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中抗原為選自前列腺癌腫瘤，黑色素瘤和上皮癌腫瘤的腫瘤抗原。
18.藥物組合物，包括有療效的權(quán)利要求I的抗體，以及可藥用載體，其中抗體包括 (a)具有SEQID NO :17所示的氨基酸序列的重鏈可變氨基酸序列；以及 (b)具有SEQID NO :7所示的氨基酸序列的輕鏈可變氨基酸序列。
19.權(quán)利要求13，14或17任一項的藥物組合物，其進(jìn)一步包括化療劑。
20.權(quán)利要求13或18任一項的藥物組合物，其進(jìn)一步包括抗原。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中抗原來自病原體。
22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述病原體為病毒，細(xì)菌，真菌或寄生蟲。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中抗原衍生自選自下列的病毒HIV，甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，皰疫病毒，腺病毒，流感病毒，黃病毒，艾柯病毒，鼻病毒，柯薩奇病毒，cornovirus,呼吸道合胞病毒，腿腺炎病毒，輪狀病毒，麻疫病毒，風(fēng)疫病毒，細(xì)小病毒，牛痘病毒，HTLV病毒，登革熱病毒，乳頭瘤病毒，軟疣病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，狂犬病毒，JC病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒。
24.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中抗原衍生自選自下列的細(xì)菌衣原體，立克次氏體細(xì)菌，分枝桿菌，葡萄球菌，鏈球菌，肺炎球菌，腦膜炎球菌和conococci，克雷白氏桿菌，變形菌，沙雷氏菌，假單胞菌，軍團(tuán)菌，白喉菌，沙門氏菌，芽孢桿菌，霍亂菌，破傷風(fēng)菌，波特淋菌，炭疽熱菌，疫病菌，細(xì)螺旋體病菌，和萊姆(Iymes)病菌。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中抗原衍生自選自下列的真菌假絲酵母，新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans),曲霉，毛霉，抱子絲菌(Sporothrix schenkii),牙生菌(Blastomyces dermatitidis),苜Ij球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis),粗球抱菌(Coccidioides immitis)和莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasma capsulatum)。
26.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中抗原衍生自選自下列的寄生蟲內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica),結(jié)腸小袋蟲(Balantidium coli),福氏耐格里(Naegleriafowleri),棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba)，賈第鞭毛蟲(Giardia Iambia)，似隱孢 菌(Cryptosporidium)，間質(zhì)性衆(zhòng)細(xì)胞(Pneumocystis carinii), _ 原蟲(Plasmodiumvivax),巴貝西蟲(Babesia microti),布氏維蟲(Trypanosoma brucei),枯西維蟲(Trypanosoma cruzi)，利什曼蟲(Leishmania donovani)，弓衆(zhòng)蟲(Toxoplasma gondi)，和巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
27.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中抗原為腫瘤抗原。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中抗原為gplOO。
29.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中抗原為MAGE。
30.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中抗原為Trp-2。
31.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中抗原為端粒酶。
32.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中抗原為熱休克蛋白(HSP)。
33.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中抗原為阿爾茨海默氏病患者的淀粉樣AP肽。
34.權(quán)利要求20的藥物組合物，其進(jìn)一步包含全細(xì)胞制劑。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞為全腫瘤細(xì)胞的制劑。
36.權(quán)利要求34或35的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞表達(dá)GM-CSF。
37.權(quán)利要求34或35的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞表達(dá)GCSF。
38.權(quán)利要求34或35的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞表達(dá)IL-2。
39.權(quán)利要求34或35的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞表達(dá)IL-I。
40.權(quán)利要求34或35的藥物組合物，其中全細(xì)胞制劑的細(xì)胞表達(dá)IL-6。
41.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中抗體為IODl。
42.權(quán)利要求I的抗體在制備用于誘導(dǎo)、增強或延長個體對抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
43.權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中抗原為 (a)腫瘤抗原，或 (b)病原體抗原。
44.權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中抗原來自病原體，所述病原體為病毒，細(xì)菌，真菌或寄生蟲。
45.權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中抗原為HIV。
46.權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中抗原為腫瘤抗原。
47.權(quán)利要求42-46任一項的應(yīng)用，其中抗原與抗體一起用于所述藥物中。
48.權(quán)利要求42，43和46任一項的應(yīng)用，其中化療劑與抗體一起用于所述藥物中。
49.權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中化療劑與抗體一起用于所述藥物中。
50.權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中腫瘤抗原為前列腺瘤抗原。
51.權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中腫瘤抗原為黑色素瘤抗原。
52.權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中腫瘤抗原為上皮癌抗原。
53.權(quán)利要求I的抗體，其中所述抗體抑制人CTLA-4與B7-1或與B7-2的結(jié)合。
54.權(quán)利要求53的抗體，其中當(dāng)抗體濃度為至少IU g/mL時，抗體使人CTLA-4與B7-1的結(jié)合降低至少50%。
55.權(quán)利要求53的抗體，其中當(dāng)抗體濃度為至少IU g/mL時，抗體使人CTLA-4與B7-2的結(jié)合降低至少50%。
全文摘要
本發(fā)明涉及人CTLA-4抗體及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供了新型抗人CTLA-4的人序列抗體以及應(yīng)用這些抗體治療人類疾病、感染和其他病癥的方法。
文檔編號A61P31/12GK102766210SQ201210037538
公開日2012年11月7日 申請日期2000年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月24日
發(fā)明者亞什萬特·M·德奧, 尼爾斯·朗伯格, 愛德華·L·霍克, 艾倫·J·科曼, 蒂博爾·P·凱萊爾 申請人:梅達(dá)里克斯公司