專利名稱：一種組織工程人角膜基質(zhì)載體支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人角膜培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程人角膜基質(zhì)載體支架，即利用海水魚類膠原蛋白制備的組織工程人角膜基質(zhì)載體支架。
背景技術(shù)：
人角膜基質(zhì)層占角膜厚度的90%，主要由角膜基質(zhì)細(xì)胞和膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分規(guī)則排列而成，透明且具有一定的曲率半徑，有利于光線通過和折曲，在維持整個(gè)角膜的透明度和曲光率等方面具有至關(guān)重要的作用。角膜基質(zhì)層一旦受到任何外傷或炎癥破壞，通常會導(dǎo)致角膜水腫、不透明和瘢痕形成，由于角膜基質(zhì)層中沒有血管故而代謝緩慢，病理代謝產(chǎn)物很難完全去除，即使愈合后也會留下不同程度的混濁從而使視力受損，即角膜翳(corneal nebula)。絕大多數(shù)角膜基質(zhì)病盲患者均可以通過角膜移植手術(shù)來治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏致使絕大部分患者得不到供體角膜而無法復(fù)明。近年來，角膜組織工程的興起及其快速發(fā)展，使組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建及其臨床應(yīng)用成為可能，也為角膜基質(zhì)病盲患者通過組織工程人角膜基質(zhì)的移植和重見光明創(chuàng)造了條件。對組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究開始于上個(gè)世紀(jì)末，如何獲得足量的人角膜基質(zhì)細(xì)胞和生物相容性理想的載體支架是目前組織工程人角膜基質(zhì)體外重建的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者們分別利用癌基因轉(zhuǎn)染的永生化人角膜基質(zhì)細(xì)胞和體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，分別利用膠原蛋白-硫酸軟骨素凝膠、膠原蛋白-聚N-異丙基丙烯酰胺共混聚合物、膠原蛋白-糖胺聚糖-殼聚糖泡沫、聚羥基乙酸未拆解纖維、水凝膠移植用透明人角膜片、多層膠原纖維、人角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)等作為載體支架，在體外成功重建出形態(tài)結(jié)構(gòu)和透明度與正常角膜基質(zhì)相似的人角膜基質(zhì)類似物，為組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建開辟了道路。但由于所用種子細(xì)胞具有潛在致瘤性或數(shù)量有限，且所用載體支架與人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性不夠理想，故而限制了組織工程人角膜基質(zhì)的規(guī)模化體外重建及其臨床應(yīng)用，目前仍局限于實(shí)驗(yàn)研究，根本無法滿足眾多角膜基質(zhì)病盲患者臨床移植的需要。2009年，樊廷俊等首次成功建立了 1個(gè)未經(jīng)任何癌基因轉(zhuǎn)染、無致瘤的人角膜基質(zhì)細(xì)胞系，成功解決了組織工程人角膜基質(zhì)規(guī)模化體外重建缺乏足量種子細(xì)胞的問題。因此，盡早建立與人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞具有理想生物相容性的載體支架的規(guī)?；苽浼夹g(shù)，已成為國內(nèi)外學(xué)者開展組織工程人角膜基質(zhì)體外重建研究的主攻目標(biāo)，是全世界各種角膜基質(zhì)異常相關(guān)患者重見光明的希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組織工程人角膜基質(zhì)載體支架，即一種海水魚類膠原蛋白復(fù)合以硫酸軟骨素制備出的與人角膜基質(zhì)細(xì)胞生物相容性理想的載體支架，以及該支架的制備方法。申請人:在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，以魚類膠原蛋白為主要原料所制備出的膠原蛋白支架，更有利于人角膜基質(zhì)細(xì)胞遷入且體內(nèi)降解速率快，適于組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的規(guī)?；苽浼捌鋺?yīng)用，從而促成了本發(fā)明。本發(fā)明的組織工程人角膜基質(zhì)載體支架，是以魚皮膠原蛋白復(fù)合硫酸軟骨素制備出的。上述的組織工程人角膜基質(zhì)載體支架中包含有質(zhì)量百分比為20% -40%魚皮膠原蛋白和60% -80%的硫酸軟骨素。上述支架的具體制備方法，包括如下的步驟1)將海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉溶解于鹽酸中制成干粉溶液，離心過濾后加入到培養(yǎng)孔中冷凍干燥凍干；2)將N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶解于2-嗎啉乙磺酸_40 %乙醇溶液中，制成NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液混勻制成交聯(lián)劑溶液，最后加入硫酸軟骨素，制成含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液；3)向含有海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉的培養(yǎng)孔中加入含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理后，用Na2HPO4溶液清洗穩(wěn)定交聯(lián)效果；再用NaCl溶液清洗去除交聯(lián)劑；最后，用蒸餾水清洗凍干后完成支架的制備。上述步驟1)中鹽酸濃度為0. 01M-0. 02M,制成的干粉溶液的濃度為5mg/ml-10mg/ml ο為了提高膠原蛋白復(fù)合載體支架的韌性，在步驟1)的干粉溶液中又添加了質(zhì)量百分比為0. 05% -0. 的IV型膠原蛋白。為了進(jìn)一步提高人角膜基質(zhì)細(xì)胞在膠原蛋白復(fù)合載體支架上的貼附效果，步驟1)的干粉溶液中又添加了質(zhì)量百分比0. 05%。-0. 1%。的纖連蛋白。上述步驟2)中的N-羥基琥珀酰亞胺溶解于50mM的2_嗎啉乙磺酸_40 %乙醇溶液中，制成6mM的N-羥基琥珀酰亞胺溶液；硫酸軟骨素在含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液中的終濃度為2. 4% -2.5%。為了提高膠原蛋白復(fù)合載體支架的韌性，本發(fā)明又添加了 0.05% -0. 的IV型膠原蛋白。為了提高人角膜基質(zhì)細(xì)胞在膠原蛋白復(fù)合載體支架上的貼附效果，本發(fā)明又添加7 0. 05%。-0. 1%。纖連蛋白。上述的海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉為鱈魚等深海魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉。本發(fā)明的方法所制備出的組織工程人角膜基質(zhì)載體支架具有透明性好、機(jī)械性強(qiáng)、通透性好、可降解性好、細(xì)胞易遷入且與人角膜基質(zhì)細(xì)胞生物相容性好等特點(diǎn)。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是利用海水魚類膠原蛋白復(fù)合以硫酸軟骨素制備的膠原蛋白復(fù)合材料，經(jīng)修飾后便可直接用作組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架，從而滿足組織工程人角膜基質(zhì)批量生產(chǎn)對載體支架的大量需求，而且抗原性小、易于人角膜基質(zhì)細(xì)胞貼附和生長；且其生產(chǎn)和用作組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的成本低。到目前為止，仍未見有關(guān)利用海水魚類膠原蛋白制備組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的研究報(bào)道，本發(fā)明首次提供出一種利用海水魚類膠原蛋白為主要原料制備組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明支架的制備方法的步驟如下1)魚皮膠原蛋白的處理首先稱取鱈魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉100-120毫克，溶解于12-20毫升0. 01M-0. 02M鹽酸中，充分溶解后9000轉(zhuǎn)/分鐘離心40-50分鐘，將所得上清液用0. 22微米濾膜過濾后，按每孔0. 5-0. 6毫升的量加入到20個(gè)48孔板孔中，經(jīng)_80°C冷凍40-60分鐘后，用冷凍干燥機(jī)凍干10-12小時(shí)。為了提高膠原蛋白復(fù)合載體支架的韌性，本發(fā)明又添加了 0.05% -0. 的IV型膠原蛋白。為了進(jìn)一步提高人角膜基質(zhì)細(xì)胞在膠原蛋白復(fù)合載體支架上的貼附效果，本發(fā)明又添加了 0. 05%。-0. 1%。纖連蛋白。2、交聯(lián)劑溶液的配制稱取2-嗎啉乙磺酸97. 6毫克加入到10毫升40%乙醇中，充分溶解后加入6. 91毫克N-羥基琥珀酰亞胺，充分溶解后再加入1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液50-60微升，最后加入硫酸軟骨素240-250毫克，制成含2. 4% -2. 5%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液。3、膠原蛋白復(fù)合支架材料的制備向含有魚皮膠原蛋白凍干粉的48孔板孔中，按每孔0. 4-0. 6毫升的量加入含2. 4% -2. 5%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理5-7小時(shí)后，用ρΗ9· 1的0. IM Na2HPO4溶液(稱取7. 1克的無水Na2HPO4充分溶于400毫升蒸餾水中，用0. IM NaOH調(diào)ρΗ值至9. 1后用蒸餾水定容至500毫升)清洗1_2小時(shí)，以穩(wěn)定交聯(lián)效果。再用2Μ NaCl清洗1小時(shí)后，再用IM NaCl清洗10-12小時(shí)，每1_2小時(shí)換液1次，充分去除交聯(lián)劑。最后，用蒸餾水清洗5-6次，每次30-40分鐘，用冷凍干燥機(jī)凍干10-12小時(shí)后，即可作為組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架使用。實(shí)施例1稱取鱈魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉120毫克，溶解于12毫升0. 01Μ-0. 02Μ鹽酸中，充分溶解后9000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘，將所得上清液用0. 22微米濾膜過濾后，按每孔0. 6毫升的量加入到20個(gè)48孔板孔中，經(jīng)_80°C冷凍40分鐘后，用冷凍干燥機(jī)凍干10小時(shí)。稱取2-嗎啉乙磺酸97. 6毫克加入到10毫升40%乙醇中，充分溶解后加入6. 91毫克N-羥基琥珀酰亞胺，充分溶解后再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液50微升，最后加入硫酸軟骨素240毫克，充分溶解后制成含2. 4%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液。向含有魚皮膠原蛋白凍干粉的48孔板孔中，按每孔0. 5毫升的量加入含2. 4%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理6小時(shí)后，用pH9. 1的0. IM Na2HPO4溶液清洗2小時(shí)，以穩(wěn)定交聯(lián)效果。用2M NaCl清洗1小時(shí)后，再用IM NaCl清洗12小時(shí)，每2小時(shí)換液1次，充分去除交聯(lián)劑。最后，用蒸餾水清洗5次，每次40分鐘，用冷凍干燥機(jī)凍干10小時(shí)后，即可作為組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架使用。實(shí)施例2稱取鱈魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉100毫克，溶解于20毫升0. 01M-0. 02M鹽酸中，充分溶解后9000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘，將所得上清液用0. 22微米濾膜過濾后，按每孔0. 55毫升的量加入到20個(gè)48孔板孔中，經(jīng)_80°C冷凍60分鐘后，用冷凍干燥機(jī)凍干11小時(shí)。稱取2-嗎啉乙磺酸97. 6毫克加入到10毫升40%乙醇中，充分溶解后加入6. 91毫克N-羥基琥珀酰亞胺，充分溶解后再加入33mM的1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液60微升，最后加入硫酸軟骨素240毫克，充分溶解后制成含2. 4%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液。向含有魚皮膠原蛋白凍干粉的48孔板孔中，按每孔0. 5毫升的量加入含2. 4%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理7小時(shí)后，用pH9. 1的0. IM Na2HPO4溶液清洗1. 5小時(shí)，以穩(wěn)定交聯(lián)效果。用2M NaCl清洗1小時(shí)后，再用IM NaCl清洗10小時(shí)，每1. 5小時(shí)換液1次，充分去除交聯(lián)劑。最后，用蒸餾水清洗6次，每次30分鐘，用冷凍干燥機(jī)凍干11小時(shí)后，即可作為組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架使用。實(shí)施例3稱取鱈魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉110毫克，溶解于15毫升0. 01M-0. 02M鹽酸中，充分溶解后9000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘，將所得上清液用0. 22微米濾膜過濾后，按每孔0. 55毫升的量加入到20個(gè)48孔板孔中，經(jīng)_80°C冷凍50分鐘后，用冷凍干燥機(jī)凍干12小時(shí)。稱取2-嗎啉乙磺酸97. 6毫克加入到10毫升40%乙醇中，充分溶解后加入6. 91毫克N-羥基琥珀酰亞胺，充分溶解后再加入33mM的1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液60微升，最后加入硫酸軟骨素250毫克，充分溶解后制成含2. 5%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液。向含有魚皮膠原蛋白凍干粉的48孔板孔中，按每孔0. 45毫升的量加入含2. 5%硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理6小時(shí)后，用pH9. 1的0. IM Na2HPO4溶液清洗1小時(shí)，以穩(wěn)定交聯(lián)效果。用2M NaCl清洗1小時(shí)后，再用IM NaCl清洗11小時(shí)，每2小時(shí)換液1次，充分去除交聯(lián)劑。最后，用蒸餾水清洗5次，每次40分鐘，用冷凍干燥機(jī)凍干12小時(shí)后，即可作為組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架使用。本發(fā)明所制備載體支架與人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞所重建的組織工程人角膜基質(zhì)移植到新西蘭大白兔角膜中可使角膜保持透明100天以上，沒有出現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)，角膜水腫逐漸消失，角膜厚度逐漸恢復(fù)正常。
權(quán)利要求
1.組織工程人角膜基質(zhì)載體支架，其特征在于所述的載體支架是以魚皮膠原蛋白復(fù)合硫酸軟骨素制備出的。
2.如權(quán)利要求1所述的載體支架，其特征在于所述的魚皮膠原蛋白的質(zhì)量百分比為20% -40%,硫酸軟骨素的含量為60% -80%。
3.權(quán)利要求1所述的載體支架的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)將海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉溶解于鹽酸中制成干粉溶液，離心過濾后加入到培養(yǎng)孔中冷凍干燥凍干；2)將N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶解于2-嗎啉乙磺酸-40%乙醇溶液中，制成NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液混勻制成交聯(lián)劑溶液，最后加入硫酸軟骨素，制成含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液；3)向含有海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉的培養(yǎng)孔中加入含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液，于室溫下交聯(lián)處理后，用Na2HPO4溶液清洗穩(wěn)定交聯(lián)效果；再用NaCl溶液清洗去除交聯(lián)劑；最后，用蒸餾水清洗凍干后完成支架的制備。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟1)中鹽酸濃度為0. 01M-0. 02M，制成的干粉溶液的濃度為5mg/ml-10mg/ml。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟1)的干粉溶液中又添加了質(zhì)量百分比為0. 05% -0. 的IV型膠原蛋白。
6.如權(quán)利要求3或5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟1)的干粉溶液中又添加了質(zhì)量百分比0. 05%。-0. 1%。的纖連蛋白。
7.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的N-羥基琥珀酰亞胺溶解于50mM的2-嗎啉乙磺酸-40%乙醇溶液中，制成6mM的N-羥基琥珀酰亞胺溶液。
8.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟幻中的硫酸軟骨素在含硫酸軟骨素的交聯(lián)劑溶液中的終濃度為2. 4% -2. 5%。
9.如權(quán)利要求1所述的載體支架，其特征在于所述的海水魚類非酶解魚皮膠原蛋白凍干粉為鱈魚等深海魚皮非酶解膠原蛋白凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用海水魚類膠原蛋白制備組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的方法，是采用非酶解鱈魚皮膠原蛋白凍干粉充分溶解于鹽酸中，離心去除沉淀后將上清液分裝入培養(yǎng)板孔中凍干，加入含硫酸軟骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，用堿性Na2HPO4溶液穩(wěn)定交聯(lián)效果后，先后用2M NaCl、1M NaCl和蒸餾水清洗，凍干后即可作為組織工程人角膜基質(zhì)的載體支架使用。本發(fā)明工藝科學(xué)合理，所制備的載體支架可用于批量生產(chǎn)，滿足組織工程人工角膜基質(zhì)規(guī)?；亟▽d體支架的大量需求，為人角膜基質(zhì)病盲通過臨床角膜移植和重見光明創(chuàng)造條件，且此載體支架制備以及應(yīng)用于組織工程人工角膜基質(zhì)體外重建和臨床治療的成本低。
文檔編號A61L27/20GK102552975SQ20121004755
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者李榮福, 杜玉堂, 樊現(xiàn)遠(yuǎn), 王寶泉, 郝蕭 申請人:青島中皓生物工程有限公司