專利名稱：干擾素α受體1抗體及其用途的制作方法
干擾素α受體1抗體及其用途本申請是申請日為2005年6月20日，申請?zhí)枮?00580025034. 5，發(fā)明名稱為“干擾素α受體I抗體及其用途”的發(fā)明專利申請的分案申請。本申請要求2004年6月21日提交的美國臨時申請60/581，747的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
I型干擾素(IFN) (IFN- α，IFN-β，IFN-ω，IFN- τ )是具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的細(xì)胞因子的一個家族(Hardy等(2001)Blood 97 :473 ；Cutrone 和Langer (2001) J. Biol. Chem. 276 :17140)。人IFNa基因座包括兩個亞家族。第一個亞家族由具有至少80%同源性的至少14個非等位基因和4個假基因組成。第二個亞家族，a II 或ω，包括5個假基因和I個功能基因，它們顯示與IFNa基因有70%的同源性(Weissmann 和 Weber(1986)Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. ,33 :251-300)。IFNa 的亞型具有不同的特定活性，但是它們具有相同的生物學(xué)譜(Streuli等(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :2848),并且具有相同的細(xì)胞受體(Agnet M.等Interferon 5， (1· I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London,1983)。干擾素β (IFN^ )由與IFNa基因有大約50%同源性的單基因編碼。Y干擾素是由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，與α/β干擾素沒有任何同源性，并且不與它們的受體反應(yīng)。所有人I型干擾素都與細(xì)胞表面受體(IFNa受體，IFNAR)結(jié)合，IFNAR由兩個跨膜蛋白 IFNAR-I 和 IFNAR-2 組成(Uze 等(1990)Cell60 :225 ；Novick 等(1994)Cell 77 391)。IFNAR-I是IFNAR復(fù)合物的高親和力結(jié)合和特異性差異的關(guān)鍵(Cutrone (2001)，見上)。盡管各種I型IFN亞型的功能差異尚未確定，但是認(rèn)為它們每一種都可能顯示不同的與IFNAR受體成分的相互作用，導(dǎo)致可能多樣化的信號傳導(dǎo)結(jié)果(Cook等(1996). J. Biol. Chem. 271 :13448)。特別是，使用IFNARl和IFNAR2突變形式的研究提示，a和β干擾素通過與相應(yīng)鏈不同地相互作用，通過受體發(fā)出不同的信號(Lewerenz等(1998)J.Mol. Biol. 282 585)。早期對于I型IFN的功能研究集中于抗病毒感染的先天防御(Haller等(1981) J. Exp. Med. 154 199 ；Lindenmann 等(1981)Methods Enzymol. 78 :181)。但是最近的研究提示I型IFN為獲得性免疫應(yīng)答中的強免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。特別是，已經(jīng)顯示I型IFN有利于幼稚T細(xì)胞沿Thl途徑分化(Brinkmann等(1993) J. Exp. Med. 178 :1655)，增強抗體產(chǎn)生(Finkelman等(1991) J. Exp. Med. 174 :1179)，以及支持記憶T細(xì)胞的功能活性和存活 (Santini，等(2000) J. Exp. Med. 191:1777 ;Tough 等(1996) Science 272:1947)。許多研究小組最近的研究提示，IFN-α可以增強樹突細(xì)胞(DC)的成熟或活化 (Santini,等(2000)J. Exp. Med. 1911777 ；Luft 等(1998)J. Immunol. 1611947 ；Luft 等 (2002) Int. Tmmunol. 14 :367 ；Radvanyi 等(1999) Scand. J. Immunol. 50 :499)。此外，已經(jīng)描述了在許多自身免疫病中I型干擾素表達(dá)增加(Foulis等(1987) Lancet 2 :1423 ；Hooks 等(1982)Arthritis Rheum 25 :396 ;Hertzog 等(1988)Clin. Tmmunol. ImmunopathoI. 48 192 ；Hopkins 和 Meager(1988)Cl in. Exp. Immunol.73 :88 ;Arvin 和 Mi IIer (1984) Arthritis Rheum. 27 :582)。對此研究最多的例子是胰島素依賴型糖尿病(IDDM) (Foulis (1987)，見上文)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) (Hooks (1982)，見上)，它們均與IFNa 水平升高有關(guān)，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA) (Hertzog(1988), Hopkins和Meager (1988), Arvin和Miller (1984),見上文)，在該疾病中IFN-β可能起更重要的作用。而且，曾報道干擾素α給藥使牛皮癬和多發(fā)性硬化癥患者的所患疾病惡化，并且在以前沒有自身免疫病史的患者中誘發(fā)SLE樣綜合征。也顯示干擾素α在正常小鼠中誘發(fā)腎小球腎炎，并且加速NZB/W小鼠的自發(fā)性自身免疫病的發(fā)病。此外，IFN-α治療已經(jīng)在某些病例中顯示導(dǎo)致不希望的副作用，包括發(fā)熱和神經(jīng)紊亂。因此，存在抑制I型IFN活性可能對患者有益的病理性情況，并且需要有效抑制I型IFN活性的藥物。發(fā)明概述本發(fā)明提供結(jié)合IFNAR-I并且抑制I型干擾素、優(yōu)選多種I型干擾素的生物活性的分離的人單克隆抗體。而且，該抗體不與鼠抗-IFNAR-I抗體64G12結(jié)合相同的表位。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體特異性結(jié)合IFNAR-I并且表現(xiàn)一種或多種以下特性a)以I X IO^7M的Kd或更高的親和力結(jié)合IFNAR-1 ；b)抑制多種I型干擾素的生物活性；c)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFN a 2b的活性；d)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNco的活性；e)抑制IFNa 2b誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-IO ；f)抑制IFNco誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-IO ；g)抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿介導(dǎo)的樹突細(xì)胞發(fā)育；和h)與鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號92022605)結(jié)合不同的表位。本發(fā)明優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合人干擾素a受體1，并且以I X 10_8M的Kd或更高的親和力或IX 10_9M或5X ΙΟ,Μ更高的親和力或2X KTkiM或更高的親和力結(jié)合。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)是人Vh 4-34或5-51基因的產(chǎn)物或來源于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人干擾素a 受體I。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的輕鏈可變區(qū)是人Vk L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人干擾素a受體I。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)是人Vh 4-34或5_51基因的產(chǎn)物或來源于該基因的重鏈可變區(qū)；和(b)是人Vk L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合人干擾素α受體I。在優(yōu)選實施方案中，該抗體包含AVh 4-34基因的重鏈可變區(qū)和Avk L18基因的輕鏈可變區(qū)，或者該抗體包含人Vh 5-51基因的重鏈可變區(qū)和人Vk Α27基因的輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的人重鏈可變區(qū)；和含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :9、10、11和12和其保守修飾的氨基酸序列；(b)人輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :21、22、23和24和
其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體以至少I X IO-8M的結(jié)合親和力或更高的親和力特異性結(jié)合人干擾素α 受體I ;和(d)該抗體抑制至少一種I型干擾素的生物活性。優(yōu)選地，人重鏈可變區(qū)⑶R2序列含有選自氨基酸序列SEQ ID NO :5、6、7、8和其保守修飾的氨基酸序列；人輕鏈可變區(qū)⑶R2序列含有選自氨基酸序列SEQ ID NO :17,18,19, 20和其保守修飾的氨基酸序列。優(yōu)選地，人重鏈可變區(qū)⑶Rl序列含有選自氨基酸序列SEQ ID N0:l、2、3、4和其保守修飾的氨基酸序列；人輕鏈可變區(qū)CDRl序列含有選自氨基酸序列 SEQ ID N0:13、14、15、16和其保守修飾的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :25、26、27和28的氨基酸序列至少80% 同源的氨基酸序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :29、30、31和32的氨基酸序列至少80% 同源的氨基酸序列；(c)該抗體以至少I X IO-8M的結(jié)合親和力或更高的親和力特異性結(jié)合人干擾素α 受體I ;和(d)該抗體抑制至少一種I型干擾素的生物活性。本發(fā)明優(yōu)選的抗體包括分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3和4的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含選自SEQ ID NO :5、6、7和8的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含選自SEQ ID NO :9、10、11和12的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含選自SEQ ID NO :13、14、15和16的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含選自SEQ ID NO :17、18、19和20的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含選自SEQ ID NO :21、22、23和24的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其中，該抗體以至少IX 10_8M的結(jié)合親和力或更高的親和力特異性結(jié)合人干擾素 α受體I。優(yōu)選的⑶R區(qū)的組合包括以下(a)包含SEQIDNO
(b)包含SEQIDNO
(C)包含SEQIDNO
(d)包含SEQIDNO
(e)包含SEQIDNO
(f)包含SEQIDNO
(a)包含SEQIDNO
(b)包含SEQIDNO
(C)包含SEQIDNO
(d)包含SEQIDNO14的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含SEQIDNO18的人輕鏈可變區(qū)⑶R2 ;和
(f)包含SEQIDNO22的人輕鏈可變區(qū)⑶R3。
(a)包含SEQIDNO3的人重鏈可變區(qū)⑶Rl ；
(b)包含SEQIDNO7的人重鏈可變區(qū)⑶R2 ；
(C)包含SEQIDNO11的人重鏈可變區(qū)⑶R3
(d)包含SEQIDNO15的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含SEQIDNO19的人輕鏈可變區(qū)⑶R2和
(f)包含SEQIDNO23的人輕鏈可變區(qū)⑶R3。
(a)包含SEQIDNO4的人重鏈可變區(qū)⑶Rl ；
(b)包含SEQIDNO8的人重鏈可變區(qū)⑶R2 ；
(C)包含SEQIDNO12的人重鏈可變區(qū)⑶R3
(d)包含SEQIDNO16的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含SEQIDNO20的人輕鏈可變區(qū)⑶R2和
(f)包含SEQIDNO24的人輕鏈可變區(qū)⑶R3。本發(fā)明其他優(yōu)選的抗體包括分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含選自SEQ ID NO :25、26、27和28的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO :29、30、31和32的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)；其中，該抗體以至少IX 10_8M的結(jié)合親和力或更高的親和力特異性結(jié)合人干擾素 α受體I。優(yōu)選的重鏈和輕鏈的組合包括以下
(a)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
(a)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b)包含SEQIDNO 31的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
(a)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b)包含SEQIDNO :32的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明的另一方面涉及與本發(fā)明提供的參比抗體競爭結(jié)合IFNAR-1的抗體。因
此，在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競爭結(jié)合人干擾素α受體1，其中該參比抗體選自a)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :25的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 29的氨基酸序列的抗體；b)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :26的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 30的氨基酸序列的抗體；c)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :27的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 31的氨基酸序列的抗體；
8
d)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :28的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 32的氨基酸序列的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種人抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體不與小鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號92022605)結(jié)合相同的表位(即，不交叉競爭)。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型。優(yōu)選的抗體是IgGl、IgG3或IgG4同種型。本發(fā)明的抗體可以是包含可變區(qū)和恒定區(qū)的全長抗體，或者它們可以是其抗原結(jié)合片段，如單鏈抗體或Fab或Fab’ 2片段。本發(fā)明也提供一種免疫偶聯(lián)物，其含有與治療劑如細(xì)胞毒素或放射性同位素連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也提供一種雙特異性分子，其含有與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。還提供了包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，或其免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，以及包含這些核酸的表達(dá)載體和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。本發(fā)明也提供了基于此處提供的抗-IFNAR-I抗體的序列制備“第二代” 抗-IFNAR-I抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了一種制備抗-IFNAR-I抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :1、2、3和4的CDRl序列，選自 SEQ ID NO :5、6、7 和 8 的 CDR2 序列，和選自 SEQ ID NO :9、10、11 和 12 的 CDR3 序列；或( )輕鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :13、14、15和16的CDRl序列，選自 SEQ ID NO : 17、18、19 和 20 的 CDR2 序列，和選自 SEQID NO :21、22、23 和 24 的 CDR3 序列；(b)改變至少一個可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(C)將改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供一種抑制I型干擾素對表達(dá)干擾素α受體I的細(xì)胞的生物活性的方法，包括使所述細(xì)胞接觸本發(fā)明的抗體，使得I型干擾素的生物活性受到抑制。本發(fā)明也提供一種治療需要治療的受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，包括向該受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，使該受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病得到治療。I型干擾素介導(dǎo)的疾病可以是，例如干擾素α介導(dǎo)的疾病?？梢詰?yīng)用本發(fā)明的方法治療的疾病或病癥的例子包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴型糖尿病、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、HIV感染、AIDS、移植排斥和移植物抗宿主疾病。更具體地，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容第I項，一種特異性結(jié)合人干擾素α受體I(IFNAR-I)的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體表現(xiàn)一種或多種以下特性a)以I X IO^7M的Kd或更高的親和力結(jié)合IFNAR-1 ；0105]b)抑制多種I型干擾素的生物活性；
0106]c)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFN a 2b的活性；
0107]d)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNco的活性；
0108]e)抑制IFNa 2b誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-10 ；
0109]f)抑制IFNco誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-IO ；
0110]g)抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿介導(dǎo)的樹突細(xì)胞發(fā)育；和
0111]h)與鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號92022605)結(jié)合不同的表位。
0112]第2項，第I項的抗體，其中該抗體以I Χ1(Γ8Μ的Kd或更高的親和力結(jié)合人干擾素α受體I。
0113]第3項，第I項的抗體，其中該抗體以I Χ1(Γ9Μ的Kd或更高的親和力結(jié)合人干擾素α受體I。
0114]第4項，一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競爭結(jié)合人干擾素a受體1，其中該參比抗體選自
0115]a)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :25的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 29的氨基酸序列的抗體；
0116]b)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :26的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 30的氨基酸序列的抗體；
0117]c)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :27的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :31的氨基酸序列的抗體；和
0118]d)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO :28的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 32的氨基酸序列的抗體。
0119]第5項，第I項的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)是人
η 4-34或5-51基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
0120]第6項，第I項的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的輕鏈可變區(qū)是人
K L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
0121]第7項，第5項的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的輕鏈可變區(qū)是人\ L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
0122]第8項，第7項的抗體，其包含人Vh 4-34基因的重鏈可變區(qū)和AVk L18基因的輕鏈可變區(qū)。
0123]第9項，第7項的抗體，其包含人Vh 5-51基因的重鏈可變區(qū)和AVk A27基因的輕鏈可變區(qū)。
0124]第10項，第2項的抗體，其包含
0125](a)包含SEQ ID NO 1的人重鏈可變區(qū)CDRl
0126](b)包含SEQ ID NO 5的人重鏈可變區(qū)CDR2
0127](c)包含SEQ ID NO 9的人重鏈可變區(qū)CDR3
0128](d)包含SEQ ID NO 13的人輕鏈可變區(qū)CDRl ；
0129](e)包含SEQ ID NO 17的人輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和
0130](f)包含SEQ ID NO 21的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
0131]第11項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 2的人重鏈可變區(qū)CDRl ；
(b包含SEQ ID NO 6的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；
(c包含SEQ ID NO 10的人重鏈可變區(qū)CDR3
(d包含SEQ ID NO 14的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e包含SEQ ID NO 18的人輕鏈可變區(qū)CDR2和
(f包含SEQ ID NO 22的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
第12項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 3的人重鏈可變區(qū)CDRl ；
(b包含SEQ ID NO 7的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；
(c包含SEQ ID NO 11的人重鏈可變區(qū)CDR3
(d包含SEQ ID NO 15的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e包含SEQ ID NO 19的人輕鏈可變區(qū)CDR2和
(f包含SEQ ID NO 23的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
第13項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 4的人重鏈可變區(qū)CDRl ；
(b包含SEQ ID NO 8的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；
(c包含SEQ ID NO 12的人重鏈可變區(qū)CDR3
(d包含SEQ ID NO 16的人輕鏈可變區(qū)CDRl
(e包含SEQ ID NO 20的人輕鏈可變區(qū)CDR2和
(f包含SEQ ID NO 24的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
第14項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
第15項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
第16項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b包含SEQ ID N031的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
第17項，第2項的抗體，其包含
(a包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和
(b包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
第18項，第I項的人抗體，其中該抗體與小鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號92022605)不結(jié)合相同的表位。
第19項，一種組合物，其含有第I項的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可接受的載體。
第20項，一種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的第I項的抗體或其抗原結(jié)合部分。
第21項，第20項的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
第22項，第20項的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是一種細(xì)胞毒素。第23項，第22項的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。第24項，第20項的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是一種放射性同位素。第25項，第24項的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。第26項，一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的第1-18項中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
第27項，一種組合物，其含有第26項的雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體。
第28項，一種分離的核酸分子，其編碼第1-18項中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部
第29項,一種表達(dá)載體,其包含第28項的核酸分子。
第30項，一種宿主細(xì)胞，其包含第29項的表達(dá)載體。
第31項，一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)第1-18項中任一項的抗體。第32項，由第31項的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。第33項，一種制備抗-IFNAR-I抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :1、2、3和4的CDRl序列，選自 SEQ ID NO :5、6、7 和 8 的 CDR2 序列，和選自 SEQ ID NO :9、10、11 和 12 的 CDR3 序列；或( )輕鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :13、14、15和16的CDRl序列，選自 SEQ ID NO :17、18、19 和 20 的 CDR2 序列，和選自 SEQ ID NO :21、22、23 和 24 的 CDR3 序列；(b)改變至少一個可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(C)將所述改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。第34項，一種抑制I型干擾素對表達(dá)干擾素α受體I的細(xì)胞的生物活性的方法， 包括使所述細(xì)胞接觸第1-18項中任一項的抗體，使得I型干擾素的生物活性受到抑制。第35項，一種治療需要治療的受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，包括向該受試者施用第1-18項中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，使該受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病得到治療。第36項，第35項的方法，其中所述I型干擾素介導(dǎo)的疾病是干擾素α介導(dǎo)的疾病。第37項，第35項的方法，其中所述疾病或病癥是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。第38項，第35項的方法，其中所述疾病或病癥選自胰島素依賴型糖尿病、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎。第39項，第35項的方法，其中所述疾病或病癥是HIV感染或AIDS。第40項，第35項的方法，其中所述疾病或病癥是移植排斥或移植物抗宿主疾病。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點通過下面的詳述和實施例將是顯而易見的，該詳述和實施例不應(yīng)理解為限制性的。在本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank條目、專利和公布的專利申請的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。
附圖簡述圖IA顯示3F11人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO :25)。標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO : I)、CDR2 (SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)區(qū)。圖IB顯示3F11人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 37)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 29) 標(biāo)出了CDRl (SEQ ID NO : 13)、CDR2 (SEQ ID NO 17)和 CDR3 (SEQ ID NO 21)區(qū)。圖2A顯示4G5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 34)和氨基酸序歹丨J (SEQ ID NO 26) 標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO :2)、CDR2 (SEQ ID NO 6)和 CDR3 (SEQ ID NO 10)區(qū)。圖2B顯示4G5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 38)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 30) 標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO :14)、CDR2 (SEQ ID NO :18)和 CDR3 (SEQ ID NO :22)區(qū)。圖3A顯示11E2人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 35)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO :27)。標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO :3)、CDR2 (SEQ ID NO 7)和 CDR3 (SEQ ID NO 11)區(qū)。圖3B顯示11E2人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 39)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 31) 標(biāo)出了CDRl (SEQ ID NO : 15)、CDR2 (SEQ ID NO 19)和 CDR3 (SEQ ID NO 23)區(qū)。圖4A顯示9D4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 36)和氨基酸序歹丨J (SEQ ID NO 28) 標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO :4)、CDR2 (SEQ ID NO 8)和 CDR3 (SEQ ID NO 12)區(qū)。圖4B顯示9D4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO :40)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 32) 標(biāo)出了 CDRl (SEQ ID NO :16)、CDR2 (SEQ ID NO :20)和 CDR3 (SEQ ID NO :24)區(qū)。圖5顯示3F11的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系Vh 4-34氨基酸序列(SEQ ID NO 41)的對比。圖6顯示4G5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh 4_34氨基酸序列(SEQ ID NO: 41)的對比。圖7顯示11E2和9D4的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh 5_51氨基酸序列(SEQ ID NO 42)的對比。圖8顯示3F 11的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vk L18氨基酸序列(SEQ ID NO:43)的對比。圖9顯示4G5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vk L18氨基酸序列(SEQ ID NO 43)的對比。

圖10顯示11E2和9D4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKA27氨基酸序列(SEQ ID NO 44)的對比。圖11顯示實驗結(jié)果，證明抗人IFNAR-I的人單克隆抗體3F11不與小鼠單克隆抗體64G12競爭結(jié)合IFNAR-I。
發(fā)明詳沭本發(fā)明涉及結(jié)合干擾素α受體I (IFNAR-I)并且能夠阻斷I型干擾素作用的分離的單克隆抗體。本發(fā)明提供分離的抗體，制備該抗體的方法，含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子，和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用這些抗體抑制I型干擾素與表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞上的IFNAR-I結(jié)合的方法，例如用于治療患者的免疫介導(dǎo)的疾病，包括自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語。其他的定義在整個發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。術(shù)語“干擾素α受體I ”、“ IFNAR-I ”和“ IFNAR-I抗原”可互換使用，包括人 IFNAR-I的變體、同種型、種同源物，和與IFNAR-I具有至少一個共同表位的類似物。因此， 本發(fā)明的人抗體在某些情況下可以與來自人類以外的物種的IFNAR-I交叉反應(yīng)，或者與在結(jié)構(gòu)上與人IFNAR-I相關(guān)的其他蛋白質(zhì)(例如人IFNAR-I同源物)交叉反應(yīng)。在其他情況下，抗體可能對人IFNAR-I是完全特異性的，不表現(xiàn)物種或其他類型的交叉反應(yīng)性。人IFNAR-I 的完整 cDNA 序列的 Genbank 登記號為 NM_000629。如此處所用的術(shù)語“ I型干擾素”是指I型干擾素分子家族的成員，它們是IFNAR-I 的配體(即，能夠結(jié)合IFNAR-I的分子的I型干擾素家族的成員)。I型干擾素配體的例子有 IFNa l、2a、2b、4、5、6、7、8、10、14、16、17、21、干擾素 β 和干擾素 ω。術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和由上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補體)的作用，導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、感染了病原體的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或在自身免疫或病理性炎癥的情況下，正常人細(xì)胞或組織?！靶盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指在信號從細(xì)胞的一部分傳送到細(xì)胞的另一部分中起作用的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。如此處所用的，短語“細(xì)胞表面受體”包括，例如，能夠接收信號和跨細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的一個例子是IFNAR-I受體。這里提到的術(shù)語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕 (L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和Ch3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為')和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q組成。V1^P'區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。 八均由三個⑶R和四個FR組成，它們從氨基端至羧基端以如下順序排列FR1，⑶Rl，F(xiàn)R2， ⑶R2，F(xiàn)R3，⑶R3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括與免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞) 和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)的結(jié)合。如此處所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留特異性結(jié)合抗原Hf^niFNAR-I)的能力的抗體的一個或多個片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段來行使。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和Cm結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd 片段；Qv)由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段 (Ward 等(1989)Nature 341 :544-546);和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管 Fv 片段的兩個結(jié)構(gòu)域'和Vh由分別的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成接頭連接在一起，從而能夠?qū)⑺鼈冎瞥梢粭l蛋白質(zhì)鏈，其中 '和Vh區(qū)配對構(gòu)成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv);參見，例如 Bird 等(1988) Science 242 :423-426 ;和 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分” 內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段進(jìn)行實用性篩選。如此處所用的，“分離的抗體”是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合IFNAR-I的分離的抗體基本不含特異性結(jié)合IFNAR-I以外抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合IFNAR-I的分離的抗體與其他抗原如來自其他物種的IFNAR-I分子可能具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可能基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。如此處所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一的結(jié)合特異性和親和性。如此處所用的術(shù)語“人抗體”包括具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，如此處所用的術(shù)語“人抗體”不包括其中源自另一哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已移植到人構(gòu)架序列上的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”是指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR 區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞是從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的。如此處所用的術(shù)語“重組人抗體”包括所有通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，例如(a)從人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化后表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(C)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實施方案中，可以對這樣的重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因動物時，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列盡管源自人種系Vh和\序列并與之相關(guān)，但可能不是在體內(nèi)人抗體種系所有組成成分(repertoire)中天然存在的序列。如此處所用的術(shù)語“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或 IgGl)。如此處所用的，“特異性結(jié)合”是指抗體與預(yù)定的抗原結(jié)合。典型地，抗體以10_7M 或更低的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合，并且與預(yù)定抗原結(jié)合的Kd比與預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的Kd至少低兩倍。短語“識別抗原的抗體”和
15“抗原特異性的抗體”在此可以與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換使用。如此處所用的術(shù)語“Kass。?！被颉癒a”是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而如此處所用的術(shù)語“Kdis”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如此處所用的術(shù)語“KD”是指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度(M)。 抗體的Kd值可以用本領(lǐng)域公知的方法確定。確定抗體Kd的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如BiaeQre 系統(tǒng)。如此處所用的術(shù)語“高親和力”對于IgG抗體是指抗體的Kd為10_8M或更低、更優(yōu)選10_9M或更低、甚至更優(yōu)選ΙΟ,Μ或更低。但是對于其他抗體同種型，“高親和力”結(jié)合可能不同。例如，對于IgM同種型，“高親和力”結(jié)合是指抗體的Kd為10_7Μ或更低、更優(yōu)選10_8Μ 或更低。如此處所用的術(shù)語“受試者”包括任何人或非人類動物。術(shù)語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、 兩棲類動物、爬行類動物等。本發(fā)明的各個方面在下面的部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述?？?IFNAR-I抗體本發(fā)明的抗體用抗體的特定功能特征或特性來表征。例如，該抗體特異性結(jié)合 IFNAR-I，優(yōu)選人IFNAR-I。另外，該抗體可以與來自一種或多種非人類靈長類動物如獼猴和 /或恒河猴的IFNAR-I交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與IFNAR-I高親和力地結(jié)合，例如 Kd為10_7Μ或更低，更優(yōu)選Kd為10_8Μ或更低，或10_9Μ或更低，或者甚至δΧΙΟ,Μ或更低， 或2X1(T1QM或更低。此外，本發(fā)明的抗體能夠抑制I型干擾素的生物活性。這些抗體抑制至少一種I 型干擾素的生物活性，優(yōu)選抑制多種I型干擾素(即，至少兩種，更優(yōu)選至少三種，或者至少四種，或者至少五種，或者至少六種，或者至少七種，或者至少八種，或者至少九種，或者至少十種，或者至少11種，或者至少12種，或者至少13種，或者至少14種，或者至少15種不同亞型的I型干擾素)的生物活性。在一個優(yōu)選實施方案中，該抗體抑制以下I型干擾素的生物活性α I、a 2a、a 2b、α 4、α 5、α 6、α 7、α 8、α 10、α 14、α 16、α 17、α 21、β 和 ω。在其他優(yōu)選實施方案中，該抗體抑制類淋巴母細(xì)胞IFN和/或白細(xì)胞IFN的活性?？贵w抑制I型干擾素的生物活性的能力可以通過一種或多種本領(lǐng)域建立的試驗來檢測。非限制性例子包括對I型IFN介導(dǎo)的Daudi細(xì)胞增殖抑制的抑制，I型IFN誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)表達(dá)ΙΡ-10的抑制，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)血漿介導(dǎo)的樹突細(xì)胞發(fā)育的抑制，和I型IFN的抗病毒活性的抑制。如果與非特異性對照抗體相比，一種抗體將活性抑制了至少20 %，更優(yōu)選至少30 %，甚至更優(yōu)選至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少 70%，至少80%，或至少90%，則該抗體“抑制I型干擾素的生物活性”。在優(yōu)選實施方案中，該抗體在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNa 2b的活性，在 Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNco的活性，抑制IFN a 2b或IFNco誘導(dǎo)的PBMC分泌IP-10， 和/或抑制SLE血漿介導(dǎo)的樹突細(xì)胞發(fā)育。在另外一個優(yōu)選實施方案中，該抗體不與鼠抗-IFNAR-I抗體64G12 (ECACC登記號為92022605)交叉競爭(即結(jié)合不同的表位)。評價抗-IFNAR-I抗體的功能活性的試驗在實施例中更詳細(xì)地描述。本發(fā)明優(yōu)選的抗體表現(xiàn)至少一種，更優(yōu)選兩種、三種、四種、五種或更多以下的特性
a)特異性結(jié)合IFNAR-I(優(yōu)選人IFNAR1)；
b)高親和力地結(jié)合IFNARljBKd為I X 10_8M或更高的親和力；
c)抑制多種I型干擾素的生物活性；
d)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNa2b的活性；
e)在Daudi細(xì)胞增殖試驗中抑制IFNco的活性；
f)抑制IFNa2b誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-IO ；
g)抑制IFNco誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞分泌IP-IO；
h)抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿介導(dǎo)的樹突細(xì)胞發(fā)育；和
i)與鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號92022605)結(jié)合不同的表位(即，不交叉本發(fā)明的抗體可以顯示上述功能特征的任意組合，和/或如實施例中所述的功能
競爭)特征。單克隆抗體3F11、4G5、11E2 和 9D4本發(fā)明優(yōu)選的抗體是如實施例所述分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體3F11、 4G5、11E2 和 9D4。3F11、4G5、11E2 和 9D4 的 Vh 氨基酸序列分別顯示在 SEQ ID NO :25、26、 27和28中。3F11、4G5、11E2和9D4的Vl氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO :29、30、31和 32中。假定這些抗體都能夠結(jié)合IFNAR-1，則Vh和\序列可以“混合并匹配”，以產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-IFNAR-I結(jié)合分子。這些“混合并匹配的”抗體的IFNAR-I結(jié)合可以用本文所述的結(jié)合試驗(例如ELISA)和/或用實施例中所述的I型IFN功能抑制試驗來檢測。 優(yōu)選地，當(dāng)Vh和\鏈混合并匹配時，來自特定VH/\配對的Vh序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的 Vh序列。同樣，優(yōu)選地來自特定VH/VL配對的\序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的\序列。例如， 3F11和4G5的Vh和\序列特別適合混合并匹配，因為這些抗體使用源自相同種系序列(Vh 4-34和Vk L18)的Vl序列，因此顯示結(jié)構(gòu)相似性。另外，11E2和9D4的Vh和Vl序列特別適合混合并匹配，因為這些抗體使用源自相同種系序列(Vh 5-51和￥￡ A27)的乂11和' 序列，因此顯示結(jié)構(gòu)相似性。因此，一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含選自SEQ ID NO :25、26、27和28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO :29、30、31和32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IFNAR-I。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 29 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 30 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 31 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供包含3F11、4G5、11E2和9D4的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和 CDR3或其組合的抗體。3卩11、465、1^2和904的乂11 CDRl的氨基酸序列在SEQ ID N0:l、2、 3和4中顯示。3F11、4G5、11E2和9D4的Vh CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO :5、6、7和8 中顯示。3F11、4G5、11E2和9D4的Vh CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO :9、10、11和12中顯示。3F11、4G5、11E2 和 9D4 的乂!^ CDRl 的氨基酸序列在 SEQ ID N0:13、14、15 和 16 中顯示。 3卩11、465、1巧2和904的￥1 CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO : 17、18、19和20中顯示。3F11、 4G5U1E2和9D4的Vk CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO :21、22、23和24中顯示。CDR區(qū)用 Kabat 系統(tǒng)(Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號 91-3242)標(biāo)出。假如這些抗體中的每一個都能夠結(jié)合IFNAR-I并且抗原結(jié)合特異性主要由⑶R1、 2、3區(qū)提供，則Vh⑶Rl、2、3序列與Vk⑶Rl、2、3序列可以“混合并匹配”(即來自不同抗體的⑶R可以混合并匹配，但是每個抗體必須含有Vh⑶Rl、2、3和VKOTR1、2、3)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-IFNAR-I結(jié)合分子。這些“混合并匹配的”抗體的IFNAR-I結(jié)合可以用以上及實施例中所述的結(jié)合試驗(例如ELISA)來檢測。優(yōu)選地，當(dāng)Vh CDR序列混合并匹配時，來自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列被置換為結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列。同樣，當(dāng)VJDR序列混合并匹配時，來自特定Vk序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列優(yōu)選地被置換為結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列。例如，3F 11和4G5的Vh⑶Rl具有一定的結(jié)構(gòu)相似性， 因此適合混合和匹配。作為另一個例子，11E2和9D4的Vh⑶Rl具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，因此適合混合和匹配。作為另一個例子，3F11和4G5的VJDRl具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，因此適合混合和匹配。作為另一個例子，11E2和9D4的Vh⑶Rl具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，因此適合混合和匹配。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，將一個或多個V1^P/或' CDR區(qū)序列置換為來自單克隆抗體3F11、4G5、11E2和9D4此處公開的⑶R序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和\序列。因此，另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3和4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含選自SEQ ID NO :5、6、7和8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含選自SEQ ID NO :9、10、11和12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含選自SEQ ID NO :13、14、15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含選自SEQ ID NO :17、18、19和20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含選自SEQ ID NO :21、22、23和24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其中該抗體特異性結(jié)合IFNAR-I。在一個優(yōu)選實施方案中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO 1的重鏈可變區(qū)CDRl(b)包含SEQ ID NO 5的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQ ID NO 9的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 17的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含SEQ ID NO 21的輕鏈可變區(qū)CDR3。
在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO 2的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 6的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 10的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQ ID NO 14的輕鏈可變區(qū)CDRl(e)包含SEQ ID NO 18的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含SEQ ID NO 22的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQ ID NO 15的輕鏈可變區(qū)CDRl(e)包含SEQ ID NO 19的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO 4的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 8的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 12的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQ ID NO 16的輕鏈可變區(qū)CDRl(e)包含SEQ ID NO 20的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含SEQ ID NO 24的輕鏈可變區(qū)CDR3。與3F11、4G5、11E2和9D4結(jié)合相同表位的抗體在另一個實施方案中，本發(fā)明提供與單克隆抗體3F11、4G5、11E2或9D4 (具有分別如SEQ ID NO :25、26、27和28所示的Vh序列，和分別如SEQ ID NO :29、30、31、32所示的八序列)結(jié)合相同的人IFNAR-I上表位的抗體。這些抗體可以根據(jù)它們在標(biāo)準(zhǔn)IFNAR-I結(jié)合試驗中與3F 11、4G5、11E2或9D4交叉競爭的能力來鑒定。一種試驗抗體抑制3F11、4G5、 11E2或9D4結(jié)合人IFNAR-I的能力證明該試驗抗體能夠與3F11、4G5、11E2或9D4競爭結(jié)合人IFNAR-I，從而與3F11、4G5、11E2或9D4結(jié)合相同的人IFNAR-I上的表位。在一個優(yōu)選實施方案中，與3F11、4G5、11E2或9D4結(jié)合相同的人IFNAR-I上的表位的抗體是一種人單克隆抗體。這種人單克隆抗體可以如實施例所述制備和分離。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體與小鼠單克隆抗體64G12(ECACC登記號 92022605)結(jié)合不同的表位(即，不交叉競爭)。具有特定種系序列的抗體在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-IFNAR-I單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含人VH 4-34或5_51基因的重鏈可變區(qū)；(b)包含人Vk L18或A27基因的輕鏈可變區(qū)；且
(C)該抗體特異性結(jié)合IFNAR-I。分別具有VH 4-34和Vk L18的Vh和Vk的抗體的例子包括3F11和4G5。分別具有VH 5-51和Vk A27的Vh和Vk的抗體的例子包括11E2和9D4如此處所用的，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該抗體包含特定種系序列的或“源自”它的或是它的“產(chǎn)物”的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。人種系免疫球蛋白序列的或“源自” 它的或是它的“產(chǎn)物”的人抗體可以如下鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，并選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性) 的人種系免疫球蛋白序列。特定人種系免疫球蛋白序列的或“源自”它的或是它的“產(chǎn)物” 的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如是由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或有意引入定點突變。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90%相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比時決定該人抗體為人抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、 97%、98%或99%相同。一般來說，源自特定人種系序列的人抗體將顯示與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相差不超過10個氨基酸。在某些情況下，該人抗體可顯示與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相差不超過5個、或者甚至不超過4、3、2或I個氨基酸。同源抗體在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體的需要的功能特性。例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :25、26、27和28的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :29、30、31和32的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(c)該抗體特異性結(jié)合IFNAR-1，并且表現(xiàn)至少一種此處所述的功能特性，優(yōu)選此處所述的幾種功能特性。在另外的實施方案中，/或Vl氨基酸序列可以與上述序列851901951 96%、97%、98%或99%同源。具有分別與上述序列的Vh和Vl區(qū)高度(即80%或以上)同源的Vh和'區(qū)的抗體可以如下獲得誘變(例如定點或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO
33、34、35、36、37、38、39或40的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗來檢測編碼的改變抗體所保留的功能(即以上(C)、⑷和(e)所述的功能)。如此處所用的，兩個氨基酸序列之間的百分同源性相當(dāng)于兩個序列之間的百分同一性。兩個序列之間的百分同一性是考慮了為兩個序列之間進(jìn)行最佳對比所需要引入的空位的數(shù)目和每個空位的長度后，這兩個序列共有的相同位點的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性= 相同位點數(shù)/位點總數(shù)X100% )。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以用如下面的非限制性實施例中所述的數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)。兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2. O版本)中的 E. Meyers 和 ff. Miller (Comput. Appl. Biosci. ,4 :11-17 (1988))的算法來確定，其使用 PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個氨基酸序列之間的百分同一'I"生也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從http://www. gcg. com獲得)的GAP程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444-453 (1970))的算法來確定，其使用 Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空位權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。另外，或者，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步作為“查詢序列”來對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如用來鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10的XBLAST程序(2. O版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50，字長=3，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位對比，可以采用如 Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和 NB LAST)的缺省參數(shù)。參見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。具有保守修飾的抗體在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和含⑶R1XDR2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些⑶R序列中的一個或多個包含基于此處所述優(yōu)選抗體(例如3F11、4G5、11E2和9D4)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-IFNAR-I抗體的需要的功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含⑶R1XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和含⑶R1XDR2和 CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自氨基酸序列SEQ ID N0:9、10、ll和12和其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :21、22、23和24和其保守修飾的氨基酸序列；且(c)該抗體特異性結(jié)合IFNAR-1，并且表現(xiàn)至少一種此處所述的功能特性，優(yōu)選此處所述的幾種功能特性。在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQ ID N0:5、6、7和8的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQ ID NO: 17、
18、19和20的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在又另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :1、2、3和4的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO : 13、14、15和16的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。如此處所用的術(shù)語“保守序列修飾”是指不會顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明的抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是指將氨基酸殘基替換為一個具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、 組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、
21谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β_分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基， 并且可以用此處所述的功能試驗檢測改變的抗體保留的功能(即以上(c)、(d)和(e)所述的功能)。工程化的和修飾的抗體本發(fā)明的抗體還可以如下制備用具有此處所公開的一種或多種VjP/或八序列的抗體作為起始材料，工程化一種修飾的抗體，該修飾的抗體可能具有與起始抗體相比改變的特性?？梢酝ㄟ^修飾一個或兩個可變區(qū)(即％和/或')例如一個或多個CDR區(qū)內(nèi)和 /或一個或多個構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基來工程化一種抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來工程化抗體，例如改變該抗體的效應(yīng)功能?？梢赃M(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程化是⑶R移植?？贵w主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體可以表達(dá)模擬該特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann, L.等(1998)Nature 332 323-327 Jones, P.等(1986)Nature 321:522-525 ；Queen, C.等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :10029-10033 ；ffinter 的美國專利 5，225，539 號，和 Queen 等人的美國專利 5，530，101 ;5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370 號)。因此，本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包含含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)，該⑶R1、⑶R2和⑶R3序列分別包含選自 SEQ ID NO :1、2、3 和 4、SEQ ID NO :5、6、7 和 8、和 SEQ ID NO :9、10、11 和 12 的氨基酸序列，以及含⑶R1XDR2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，該⑶R1XDR2和⑶R3序列分別包含選自 SEQ ID N0:13、14、15 和 16、SEQ ID NO : 17、18、19 和 20、和 SEQ ID NO :21、22、23 和 24 的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體3F 11、465、1巧2或904的￥11和￥1⑶R序列， 但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn) “VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可從因特網(wǎng)上www. mrc-cpe. cam, ac. uk/vbase獲得),以及 Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號 91-3242 ;Tomlinson, I. M.等 (1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops (人種系 \^序列的全部組成成分揭示了具有不同高變環(huán)的大約50 fVH區(qū)段組)”J. Mol. Biol. 227 :776-798 jPCoX，J.P.L.等 (1994)uK Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage (人種系Vh區(qū)段目錄揭示其應(yīng)用的強烈偏好)”Eur. J. Immunol. 24 :827-836 ;其內(nèi)容均在此特別引入作為參考。
用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于本發(fā)明選擇的抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于3F11和4G5單克隆抗體使用的Vh 4-34和\ L18構(gòu)架序列，或11E2和 9D4單克隆抗體使用的Vh5-51和Vl A27構(gòu)架序列?？梢詫EQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11 和 12 的 Vh CDRl、2、3 序列和 SEQ ID NO :13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 和 24的\ CDRl、2、3序列移植到與衍生該構(gòu)架序列的種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者可以將CDR序列移植到與該種系序列相比含有一個或多個突變的構(gòu)架區(qū)上。 例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)的殘基進(jìn)行突變對于保持或增強抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等人的美國專利5，530，101 ；5, 585,089 ;5，693，762和 6，180，370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是將Vh和/或Vl⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區(qū)內(nèi)的氨基酸序列突變，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點誘變或 PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對抗體結(jié)合的影響，或者其他目標(biāo)功能特性，可以用此處所述以及在實施例中提供的體外或體內(nèi)試驗來評價。優(yōu)選引入(如上文所述的)保守修飾。突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般在⑶R區(qū)內(nèi)改變不超過5個殘基。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-IFNAR-I單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a) Vh⑶Rl區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :1、2、3和4的氨基酸序列，或與選自SEQ ID勵1、2、3和4的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH⑶R2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :5、6、7和8的氨基酸序列，或與選自SEQ ID N0:5、6、7和8的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列;(c)VH CDR3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :9、10、11和12的氨基酸序列，或與選自SEQ ID勵9、10、11和12的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(cI)Vl CDRl區(qū)，其包含選自SEQ ID NO : 13、14、15和16 的氨基酸序列，或與選自SEQ ID N0:13、14、15和16的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5 個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL⑶R2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :17,18,19 和20的氨基酸序列，或與選自SEQ ID N0:17、18、19和20的氨基酸序列相比具有1、2、3、 4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)'⑶R3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO:
21、22、23和24的氨基酸序列，或與選自SEQ ID NO :21、22、23和24的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體性質(zhì)而對其Vh和/或 '內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，對于3F11，Vh的氨基酸殘基#43 (FR2內(nèi))是蘇氨酸，而在相應(yīng)的Vh 4-43種系序列中該殘基為丙氨酸(見圖5)。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，通過例如定點誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，體細(xì)胞突變可以“回復(fù)突變”為種系序列(例如，3F11的Vh的殘基43可以從蘇氨酸“回復(fù)突變”為丙氨酸)。作為另一個例子， 對于4G5，Vh的氨基酸殘基#81 (FR3內(nèi))是天冬酰胺，而在相應(yīng)的Vh 4-43種系序列中該殘基為賴氨酸(見圖6)。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，體細(xì)胞突變可以從天冬酰胺“回復(fù)突變”為賴氨酸。作為另一個例子，對于11E2和9D4，Vh的氨基酸殘基#28 (FRl內(nèi)) 是異亮氨酸，而在相應(yīng)的VH5-51種系序列中該殘基為絲氨酸(見圖7)。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，體細(xì)胞突變可以從異亮氨酸“回復(fù)突變”為絲氨酸。這些“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。 另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或者甚至一個或多個CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為“脫免疫”，在Carr等人的美國專利公布號20030153043中詳細(xì)記載。除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾以外，或者作為它的替代，本發(fā)明的抗體可以被工程化為包括Fe區(qū)內(nèi)的修飾，一般是為了改變該抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fe受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以化學(xué)修飾本發(fā)明的抗體(例如一個或多個化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變該抗體的一種或多種功能特性。這些實施方案均在下文詳細(xì)描述。Fe區(qū)中殘基的編號是 Kabat的EU指數(shù)的編號。在一個實施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變， 例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利5，677，425中詳細(xì)記載。改變CHl鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了，例如，有利于輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，對抗體的Fe鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以縮短該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fe-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個或多個氨基酸突變，使得相對于天然Fe-鉸鏈結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌蛋白A(SpA)結(jié)合,該抗體的SpA結(jié)合減弱。該方法在Ward等人的美國專利6，165，745號中詳細(xì)記載。在另一個實施方案中，修飾抗體以延長其生物半衰期。可以使用各種方法。例如， 可以引入一個或多個如下突變T252L、T254S、T256F，如Ward的美國專利6，277，375所述。 或者，為了延長生物半衰期，該抗體可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變，使之含有來自IgG Fe 區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)的補救受體結(jié)合表位，如Presta等人的5，869，046和6，121，022號所述。在其他實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變 Fe區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、 320、322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體具有改變的對效應(yīng)配體的親和力，而保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。對其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)e受體或補體的Cl成分。該方法在Winter等人的美國專利號5，624，821和5，648，260 中更詳細(xì)地描述。在另外一個實施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結(jié)合改變和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) 降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國專利號6，194，551中更詳細(xì)地描述。在另外一個實施例中，改變氨基酸位點231和239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變該抗體固定補體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中進(jìn)一步描述。在另外一個實施例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fe Y受體的親和力，通過修飾在下列位點處的一個或多個氨基酸來修飾Fe 區(qū)238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280， 283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320， 322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388， 389，398，414，416，419，430，434，435，437，438 或 439。該方法在 Presta 的 PCT 公布 WO 00/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgGl上對于Fe Y RI、Fe Y RH、Fe y RIII和FcRn的結(jié)合位點已經(jīng)被作圖，并且已經(jīng)描述了結(jié)合得到改善的變體(參見，Shields，R.L.等(2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位點 256、290、298、333、334 和 339 處的特定突變顯示改善了與Fe Y RIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與Fe Y RIII的結(jié)合T256A/ S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在另一個實施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提聞抗體對抗原的未和力，可以改變糖基化。這樣的糖基化修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點來實現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致一個或多個可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點消失的一個或多個氨基酸置換，從而消除了該位點處的糖基化。這種糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國專利號 5，714，350和6，350，861中進(jìn)一步詳細(xì)描述。另外，或者，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式能提高抗體的ADCC能力。這種糖修飾可以通過例如在糖基化機制改變的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實現(xiàn)。糖基化機制改變的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì)胞在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，Hanai等人的EP1，176，195描述了一種細(xì)胞系，其具有功能破壞的RUT8基因，該基因編碼一種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，因此這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835記載了一種變異CHO 細(xì)胞系，Lecl3細(xì)胞，它的使巖藻糖連接到Asn (297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖基化(參見，Shields，R.L.等(2002) J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342記載了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β (1，4)_乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana 等(1999) Nat. Biotech. 17 :176-180)。本發(fā)明涉及的此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了延長抗體的生物 (例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了 PEG化一種抗體，在使一個或多個PEG基團變?yōu)榕c抗體或抗體片段連接的條件下，一般將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG 的反應(yīng)性酯或醒衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地,通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。如此處所用的術(shù)語“聚乙二醇”包括用于衍生化其他蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質(zhì) PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nisbimura等人的 EP 0154316 和 Ishikawa 等人的 EP 0401384。工程化抗體的方法
因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體如3F11、4G5、11E2和 9D4的結(jié)構(gòu)特征產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗-IFNAR-I抗體，該結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如結(jié)合IFNAR-1。例如，3F11、4G5、11E2或9D4的一個或多個⑶R區(qū)或其突變，可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，如上所述產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種Vh和/或\序列，或其一個或多個CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定實際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種％和/或' 序列或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生源自原始序列的“第二代”序列，然后制備該“第二代”序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-IFNAR-I抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :1、2、3和4的CDRl序列，選自 SEQ ID NO :5、6、7和 8 的 CDR2 序列，和 / 或選自 SEQ ID NO :9、10、11 和 12 的 CDR3 序列；和(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :13、14、15和16的CDRl序列， 選自 SEQ ID NO :17、18、19 和 20 的 CDR2 序列，和 / 或選自 SEQ ID NO :21、22、23 和 24 的 CDR3序列；(b)改變第一抗體序列和/或第二抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(C)制備該改變的抗體序列；和(d)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)改變的抗體序列。優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述的抗-IFNAR-I抗體的一種、 一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(i)結(jié)合 IFNAR-I ；(ii)抑制I型干擾素與IFNAR-I的結(jié)合；(iii)結(jié)合表達(dá)人IFNAR-I的活細(xì)胞；(iv)以I X IO-8M或更低(例如1(Γ9Μ或1(Γ10Μ或更低)的Kd結(jié)合人IFNAR-1 ；(V)結(jié)合IFNAR-I上的獨特表位(以消除具有互補活性的單克隆抗體在組合使用時競爭結(jié)合相同表位的可能性)。改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中可使用的和/或此處所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗來評價。例如，抗體結(jié)合IFNAR-I的能力可以用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗，如實施例中所述的那些試驗 (例如ELISA)來確定。在工程化本發(fā)明抗體的方法的某些實施方案中，可以沿全部或部分抗-IFNAR-I 抗體編碼序列(例如3F11、4G5、11E2或9D4編碼序列)隨機或選擇性地弓I入突變，并可以對結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性篩選獲得的修飾的抗-IFNAR-I抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或其組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679 也記載了利用計算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本純化的形式存在。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/ SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他方法，從其他細(xì)胞成分或其他污染物例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)中分離純化時，該核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見，F(xiàn). Ausubel 等編著(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發(fā)明的核酸可以是例如 DNA 或 RNA, 并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選實施方案中，該核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對于雜交瘤(例如由下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼通過雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術(shù))，編碼抗體的核酸可以從文庫中獲得。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼3F11、4G5、11E2和9D4單克隆抗體的Vh和\序列的核酸分子。編碼3F11的VH和VL序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO 33和37中。 編碼4G5的VH和VL序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO 34和38中。編碼11E2的VH 和VL序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO : 35和39中。編碼9D4的VH和VL序列的DNA 序列分別顯示在SEQ ID NO 36和40中。一旦獲得編碼Vh和 '段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些 DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因，轉(zhuǎn)化為Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，將編碼\或Vh的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性接頭的另一種DNA片段可操作連接。如在本文中使用的術(shù)語“可操作連接(operatively linked)” 意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀框內(nèi)。通過將編碼Vh的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2和CH3)的另外一種DNA分子可操作連接，可以將編碼Vh區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat, B. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，編碼Vh的DNA可以與只編碼重鏈CHl恒定區(qū)的另外一種DNA 分子可操作連接。通過將編碼\的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CK的另外一種DNA分子可操作連接，可以將編碼\區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat, B. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是K恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和\的DNA片段與編碼柔性接頭例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一種片段可操作連接，使得Vh和'序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其八和Vh區(qū)通過柔性接頭連接(參見，例如Bird等(1988) Science 242 :423-426 ； Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ；McCafferty 等(1990)Nature348 :552-554)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生通過多種技術(shù)能制備本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌
基因轉(zhuǎn)化。制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是非常完善確立的程序。免疫程序和用于融合的免疫脾細(xì)胞的分離技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是公知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。 編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)工程化為含有非鼠(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國專利 4，816，567號)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國專利5，225，539號，和Queen等人的美國專利5，530，101 ； 5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370 號)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗IFNAR-I的人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通稱作“人 Ig小鼠”。HuMAb小鼠 (Medarex, Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(μ和Y )和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和滅活內(nèi)源μ和K鏈基因座的靶向突變(參見,例如，Lonberg等(1994) Nature 368(6474) :856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或 K表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變， 產(chǎn)生高親和性人IgGK單克隆(Lonberg, N.等(1994),見上；綜述見Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101 ;Lonberg,N.和 Huszar,D. (1995) Intern. Rev. Tmmunol. Vol. 13 :65-93,和 Harding, F.和 Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 :536-546)。HuMAb小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，詳細(xì)描述于下面的文獻(xiàn)中Tay I or. L.等(1992) Nucleic Acids Research 20 :6287-6295 ;Chen, J.等(1993)International Immunology 5:647-656 ;Tuaillon等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :3720-3724 ；Choi 等(1993)Nature Genetics 4 :117-123 ；Chen, J.等(1993) EMBO J. 12 :821-830 ;Tuaillon 等(1994) J. Immunol. 152 :2912-2920 ；Taylor, L.等(1994) International Immunology 6 :579-591;和Fishwild,D.等(1996)Nature Biotechnology 14 :845-851,這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，美國專利5，545，806 ； 5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，789，650 ;5，877，397 ;5，661，016 ;5，814，318 ； 5，874，299 ;和 5，770，429 ;都屬于 Lonberg 和 Kay ;和 Surani 等人的美國專利 5，545，807 ； PCT 公布號 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 和 WO 99/45962，都屬于 Lonberg 和 Kay ;和 Korman 等人的 PCT 公布號 WO 01/14424。在另一個實施方案中，可以用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小
28鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此稱為“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中詳細(xì)記載。再者，在本領(lǐng)域中可以獲得替代的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體。例如，可以使用一種被稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)的替代的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利5，939，598 ； 6，075，181 ;6，114，598 ;6，150，584 和 6，162，963 中記載。而且，在本領(lǐng)域中可以獲得替代的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)， 能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱為“TC小鼠”；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中記載。另外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛在本領(lǐng)域中已經(jīng)記載(Kuroiwa 等(2002)Nature Biotechnology 20 :889-894),并且能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備。用于分離人抗體的這些噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國專利5，223,409 ;5，403，484 ;和5，571,698 ;Dower等人的美國專利 5，427，908 和 5，580，717 ；McCafferty 等人的美國專利 5，969，108 和 6，172，197 ；和 Griffiths 等人的美國專利 5，885，793 ;6，521，404 ;6，544，731 ;6，555，313 ;6，582，915 和 6，593，081。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，SCID小鼠中重構(gòu)了人類免疫細(xì)胞，因此在免疫時能夠產(chǎn)生人類抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國專利 5，476，996 和 5，698，767 中記載。人Ig小鼠的免疫當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時，如Lonberg, N.等(1994)Nature 368(6474) :856-859 ；Fishwild, D.等(1996)Nature Biotechnology 14 :845-851 ;和 PCT 公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用純化的或富集的IFNAR-I抗原制劑和/或表達(dá) IFNAR-I的細(xì)胞免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或富集的IFNAR-I抗原制劑(5-50 μ g)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。在使用純化的或富集的IFNAR-I抗原制劑免疫不產(chǎn)生抗體的情況下，也可以用表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞如人T細(xì)胞系免疫小鼠，促進(jìn)免疫應(yīng)答。產(chǎn)生抗IFNAR-I完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在下面的實施例I中描述。應(yīng)用各種抗原的積累的經(jīng)驗證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)沒有佐劑的全細(xì)胞具有高度免疫原性。免疫方案進(jìn)程中用眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應(yīng)答。可以通過ELISA(如下所述)篩選血漿，使用具有足夠抗-IFNAR-I人免疫球蛋白效價的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對小鼠靜脈內(nèi)加強免疫，3天后處死小鼠并且取出脾。預(yù)期每次免疫可能需要融合2-3次。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCol2系都使用。另外，HCo7和HCol2轉(zhuǎn)基因可以雜交在一起，產(chǎn)生一種具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因的小鼠(HCo7/HCol2)。產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生
為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從接受免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖細(xì)胞系例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50% PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8. 653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1580)融合。細(xì)胞以大約2X IO5接種于平底微量滴定板，接著在含有20%胎克隆血清，18% “653” 條件基質(zhì)，5% Origen (IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，ImM 丙酮酸鈉，5mM HEPES,0. 055mM 2-巰基乙醇,50單位/毫升青霉素,50mg/ml鏈霉素,50mg/ml慶大霉素和I XHAT (Sigma ； 融合24小時后加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了 HAT 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA篩選各孔的人單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。再次接種分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N. J.)進(jìn)行親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，用I. 43的消光系數(shù)根據(jù)0D280測定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在_80°C 下保存。產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生例如，利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)，在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中也能產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤的PCR擴增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，并將其插入到表達(dá)載體中，使得該基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作連接。在本文中，術(shù)語“可操作連接”意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，兩個基因插入到同一表達(dá)載體中。抗體基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入到表達(dá)載體中(例如,抗體基因片段和載體上的互補限制性位點連接，或者如果不存在限制性位點，則平端連接)。通過將此處描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)插入到已經(jīng)編碼所需同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得Vh區(qū)段與載體中的Ch區(qū)段可操作連接，而\區(qū)段與載體中的Q區(qū)段可操作連接，能用來產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者，重組表達(dá)載體能編碼促進(jìn)由宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號肽?？贵w鏈基因能被克隆到載體中，使得該信號肽在閱讀框內(nèi)與該抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。這些調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素。用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括引導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。此外，也可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動子或β_珠蛋白啟動子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自不同來源的序列組成，例如SRa啟動子系統(tǒng)，其含有來自SV40早期啟動子的序列和人I型T細(xì)胞白血病病毒的長末端重復(fù)序列(Takebe，Y.等 (1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點)和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(參見，例如，美國專利4，399，216， 4，634，665和5，179，017，都屬于Axel等人)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細(xì)胞中，用于氨甲喋呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然理論上在原核或真核宿主細(xì)胞中都可能表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中表達(dá)抗體，最優(yōu)選在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)，因為這些真核細(xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報道，抗體基因的原核表達(dá)無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss, Μ. Α.和 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢 (CH0 細(xì)胞)(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，在 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 =4216-4220中描述，和DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，例如，如R. J. Kaufman和 P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601-621 所述)、NSO 骨髓瘤細(xì)胞、COS 細(xì)胞和 SP2 細(xì)胞。 特別地，用于NSO骨髓瘤細(xì)胞時，另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338，841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一段時間，或更優(yōu)選地，足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞生長所處培養(yǎng)基中的一段時間，來產(chǎn)生抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體?？贵w與抗原結(jié)合的表征例如通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以檢測本發(fā)明的抗體與IFNAR-I的結(jié)合。簡要地說，用在I3BS中的0. 25 μ g/ml純化IFNAR-I包被微量滴定板，然后用PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。向各個孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自IFNAR-I免疫小鼠的血漿的稀釋液)，在 37°C下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗板，之后和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二試劑(例如，對于人抗體，為山羊抗人IgG Fe特異性多克隆試劑)一起在37°C下溫育I小時。洗滌后，平板用pNPP底物(lmg/ml)顯色,并且在OD 405-650下分析。優(yōu)選地,顯示最高效價的小鼠用于融合。如上所述的ELI SA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與IFNAR-I免疫原有陽性反應(yīng)性的雜交瘤。將與IFNAR-I高親合力結(jié)合的雜交瘤亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個雜交瘤中選擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性(通過ELISA)的一個克隆，制備5-10小瓶細(xì)胞庫，在-140°C下保存，用于抗體純化。為了純化抗-IFNAR-I抗體，在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中培養(yǎng)選擇的雜交瘤。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白質(zhì)A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) 進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用I. 43的消光系數(shù)根據(jù)0D280測定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80°C下保存。為了確定選擇的抗-IFNAR-I單克隆抗體是否與獨特表位結(jié)合，使用商售試劑 (Pierce, Rockford, IL)將各種抗體生物素化。如上所述，使用IFNAR-I包被的ELISA板應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行競爭研究。使用鏈抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針檢測生物素化mAb的結(jié)合。為了確定純化抗體的同種型，可以用對于特定同種型抗體特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4°C下用I μ g/ml抗人免疫球蛋白將微量滴定板的孔包被過夜。用1% BSA封閉之后，平板與I μ g/ml或更少的測試單克隆抗體或純化的同種型對照物在室溫下反應(yīng)1-2小時。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。為了證明單克隆抗體與表達(dá)IFNAR-I的活細(xì)胞的結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞術(shù)。簡要地說，表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)與不同濃度的單克隆抗體在含 O. 1% BSA和10%胎牛血清的PBS中混合，37°C溫育I小時。洗滌后，細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體在與第一抗體染色相同的條件下反應(yīng)。使用光和側(cè)向散射特性用門圈出(gate) 單細(xì)胞，通過FACScan儀器分析樣品。(除了或者替代)流式細(xì)胞試驗，可以使用一種利用熒光顯微鏡的替代試驗。細(xì)胞可以完全如上所述染色，并通過熒光顯微鏡檢查。該方法允許顯示個別細(xì)胞，但是根據(jù)抗原密度靈敏度可能降低?？梢酝ㄟ^Western印跡法進(jìn)一步檢測抗-IFNAR-I人IgG與IFNAR-I抗原的反應(yīng)性。簡要地說，從表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測的單克隆抗體探查。人IgG的結(jié)合可以用抗人IgG堿性磷酸酶檢測，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem. Co. , St. Louis, Mo.)顯色。免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明提供與治療性部分如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素偶聯(lián)的抗-IFNAR-I抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為“免疫偶聯(lián)物”。包括一個或多個細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物稱作“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對細(xì)胞有害(例如殺傷)的任何試劑。實例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼白毒吡喃葡糖苷、表鬼白毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧唳、氨烯咪胺(decarbazine)),燒化劑(例如,氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C 和順-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素) 和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D (以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin，和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個例子是可以作為商品購得的 Mylotarg (Wyeth-Ayerst)?？梢岳帽绢I(lǐng)域可用的接頭技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的接頭類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接頭。 可以選擇，例如，在溶酶體室內(nèi)易被低PH切割或易被蛋白酶切割的接頭，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的接頭和方法的進(jìn)一步討論，參 B Saito, G.等(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199-215 ；Trail, P. A.等(2003)Cancer. Immunol. Tmmunother. 52 :328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3 :207-212 ；Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763 ；Pastan, I.和 Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 ；Senter, P. D.和 Springer, C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev.53 247-264o本發(fā)明的抗體也可與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也被稱為放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦m、釔9°和镥m。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和 Bexxar (Corixa Pharmaceuticals),能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素- Y ;或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物， 如淋巴因子、白細(xì)胞介素-I ( “IL-1”)、白細(xì)胞介素-2 ( “IL-2”)、白細(xì)胞介素-6 ( “IL-6”)、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。用于將這種治療部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等， “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy (在癌癥治療中用于藥物的免疫祀向的單克隆抗體)”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldt 等(編)，pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery (用于給藥的抗體)，，，in Controlled Drug Delivery (第二版)，Robinson 等(編)，pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987) ；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy A Review (癌癥治療中細(xì)胞毒劑的抗體載體綜述)”，in Monoclonal Antibodies’ 84 :Biological And Clinical Applications, Pinchera 等(編)，pp. 475-506 (1985) "‘Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy (放射性標(biāo)記抗體在癌癥治療中的治療用途的分析、結(jié)果和未來前景)”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(編)， pp. 303-16(Academic Press 1985),和 Thorpe 等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates (抗體-毒素偶聯(lián)物的制備和細(xì)胞毒性)”, Immunol. Rev. ,62:119-58 (1982)。雙特異性分子另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體或其片段的雙特異性分子。 可將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分衍生化或連接到另一功能性分子上，如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如另一種抗體或受體的配體)上，以生成可與至少兩個不同結(jié)合位點或靶分子結(jié)合的雙特異性分子。實際上可以將本發(fā)明的抗體衍生化或連接到一種以上的其他功能性分子上，以生成可與兩個以上不同結(jié)合位點和/或靶分子結(jié)合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在此處所用的術(shù)語“雙特異性分子”內(nèi)。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子， 本發(fā)明的抗體可與一種或多種其他結(jié)合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合等)，從而得到雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括包含至少一種對IFNAR-I的第一結(jié)合特異性和對第二個目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。在本發(fā)明一個特定實施方案中，第二個目標(biāo)表位是 Fe受體，如人Fe Y RI (⑶64)或人Fca受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達(dá)Fe Y R、 Fe a R或Fe ε R的效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))結(jié)合，又能與表達(dá) IFNAR-I的靶細(xì)胞結(jié)合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞導(dǎo)向于效應(yīng)細(xì)胞，并且觸發(fā)Fe受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞的吞噬作用、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放或超氧陰離子的生成。在其中雙特異性分子是多特異性分子的本發(fā)明的一個實施方案中，除抗-Fe結(jié)合特異性和抗-IFNAR-I結(jié)合特異性之外，該分子可進(jìn)一步包括第三結(jié)合特異性。在一個實施方案中，該第三結(jié)合特異性是抗增強因子(EF)部分，例如結(jié)合參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)并因而增強抗靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的分子。“抗增強因子部分”可以是結(jié)合特定分子如抗原或受體，并因而導(dǎo)致對Fe受體或靶細(xì)胞抗原的結(jié)合決定簇作用增強的抗體、功能性抗體片段或配體?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨膳cFe受體或靶細(xì)胞抗原結(jié)合?；蛘撸乖鰪娨蜃硬糠挚梢耘c一種實體結(jié)合，該實體不同于第一和第二結(jié)合特異性所結(jié)合的實體。例如，抗增強因子部分可結(jié)合細(xì)胞毒性T細(xì)胞(如通過導(dǎo)致抗靶細(xì)胞免疫應(yīng)答增強的⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、 CD4、CD40、ICAM-I或其他免疫細(xì)胞)。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladnor等人的美國專利號4，946，778所述， 該專利的內(nèi)容引入作為參考。在一個實施方案中，對Fe Y受體的結(jié)合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如此處所用的術(shù)語“IgG受體”是指位于染色體I 上的8個Y-鏈基因的任何一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分為 3 個 Fe Y 受體類型=Fc Y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16)。在一
34個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)e Y受體是人高親和力Fe Y R I。人Fe Y R I是72kDa的分子，表現(xiàn)出對單體IgG的高親和力(IO8-IO9M-1)。某些優(yōu)選抗-Fe Y單克隆抗體的制備和表征在Fanger等人的PCT公布WO 88/00052和美國專利號4，954，617中描述，在此處將其教導(dǎo)整體引入作為參考。這些抗體在與受體的Fe Y結(jié)合位點不同的位點處與Fe Y RI、FcyRII或Fe Y RIII的表位結(jié)合，因而，其結(jié)合基本不被生理學(xué)水平的IgG阻斷?？捎糜诒景l(fā)明的特定抗-Fe Y RI抗體為mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。產(chǎn)生mAb 32的雜交瘤可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，ATCC保藏號為HB9469。在另外的實施方案申，抗-Fe Y RI受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征在Graziano，R. F.等(1995) J. Immunol 155(10) :4996-5002和PCT公布WO 94/10332中描述。產(chǎn)生H22抗體的細(xì)胞系以HA022CL1 的名稱保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CRL 11177。在另外一些優(yōu)選實施方案中，對Fe受體的結(jié)合特異性由與人IgA受體如Fc-α受體(FcaRI(CD89))結(jié)合的抗體提供，其結(jié)合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語 “IgA受體”包括位于染色體19上的一個a -基因的基因產(chǎn)物(Fe a RI)。已知該基因編碼幾個55-110kDa的可變剪接的跨膜同種型。Fe a RI (⑶89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達(dá)，但不在非效應(yīng)細(xì)胞群體上組成型表達(dá)。Fe a RI對IgAl和 IgA2兩者均具有中等親和力(約5 X IO7M.1)，在暴露于細(xì)胞因子如G-CSF或GM-CSF后該親和力增加(Morton, H. C.等(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。已描述了 4種Fe a RI-特異性單克隆抗體，標(biāo)識為A3、Α59、Α62和Α77，它們在IgA配體結(jié)合域之外結(jié)合 Fe a RI (Monteiro, R. C.等(1992) J. Immunol. 148 :1764)。Fca RI和Fe Y RI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選觸發(fā)受體，因為它們⑴主要表達(dá)于免疫效應(yīng)細(xì)胞上，如單核細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞；(2)以高水平表達(dá)(如每個細(xì)胞5，000-100，000個)；(3)是細(xì)胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導(dǎo)導(dǎo)向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強的抗原呈遞。優(yōu)選人單克隆抗體，而在本發(fā)明雙特異性分子中使用的其他抗體是鼠、嵌合和人源化單克隆抗體?？赏ㄟ^應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的方法偶聯(lián)組成結(jié)合特異性，如抗-FcR和抗-IFNAR-I 結(jié)合特異性，來制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結(jié)合特異性可單獨生成，然后彼此偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時，多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑可用于共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸酯 (SATA)、5，5’ - 二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N_琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(STOP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己基-I-羧酸酯(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ;Liu，MA 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ;Brennan 等(1985)Science 229 :81-83 和 Glennie 等 (1987) J. Immunol. 139 :2367-2375所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可從 Pierce Chemical Co. (Rockfoford, IL)獲得。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時，它們可通過兩個重鏈C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合來偶聯(lián)。 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，對鉸鏈區(qū)進(jìn)行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個巰基殘基，優(yōu)選I個?；蛘撸瑑煞N結(jié)合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。 當(dāng)雙特異性分子是mAbxmAb,mAbxFab, FabxF (ab’)2或配體xFab融合蛋白時,該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇的單鏈分子或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法例如在美國專利號5，260，203、美國專利號5，455，030、美國專利號4，881，175、美國專利號5，132，405，美國專利號5，091，513、美國專利號5，476，786、美國專利號5，013，653、美國專利號5，258，498和美國專利號5，482，858中描述。雙特異性分子與其特異性靶標(biāo)的結(jié)合可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(如生長抑制)或Western Blot測定進(jìn)行證實。 這些試驗通常通過應(yīng)用對感興趣的復(fù)合物特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)來檢測特別感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，利用如識別和特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段可檢測FcR-抗體復(fù)合物?；蛘?，這些復(fù)合物可利用多種其他免疫分析中的任意一種來檢測。例如，可對抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記并且在放射免疫測定(RIA)中使用(參見， 例如，Weintraub, B. , Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986 年 3 月，在此引入作為參考)。通過如使用Y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器的方法或者通過放射自顯影方法，能檢測放射性同位素。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以含有可與靶抗原上不同表位結(jié)合或具有互補活性的組合的抗體(或免疫偶聯(lián)物或雙特異性劑)。本發(fā)明的藥物組合物也可在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體與至少一種其他的免疫抑制劑組合。如此處所用的，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包被于一種材料中，以保護(hù)該化合物免于可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽” 是指保持了親代化合物的所需生物活性且不引起任何不想要的毒理學(xué)作用的鹽(參見如 Berge, S.M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。 酸加成鹽包括那些由無毒性無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等衍生的鹽，以及由無毒性有機酸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等衍生的鹽，以及由無毒性有機胺如N，N’- 二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等衍生的鹽。
本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(I)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉， 亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(DHT)、 卵磷脂、沒食子酸丙酯、α -生育酚等；和⑶金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇， 多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過上述的滅菌程序或通過包含各種抗細(xì)菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等來確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的情況外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補充的活性化合物。治療組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、 乙醇、多元醇(例如，丙三醇、聚乙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)和它們的合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持所需的顆粒大小， 以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑， 例如單硬脂酸鹽和明膠，可實現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和來自上面所列舉的其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其前述無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末?？梢耘c載體材料組合以制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定的給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合以制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100%計，這個量的范圍是大約O. 01%至大約99% 的活性成分，優(yōu)選大約O. 1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的需要的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，劑量可以按比例減小或增加。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易施用并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載
37體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a) 活性化合物的獨特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。對于抗體的給藥，齊Li量范圍為約O. 0001至100mg/kg,更通常為O. 01至5mg/kg受者體重。例如，劑量可以是O. 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或IOmg/ kg體重，或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。一個治療方案的實例需要每周給藥一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予lmg/kg體重或3mg/kg體重,該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次,共6次,然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg 體重一次，然后每3周lmg/kg體重。在一些方法中，具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體同時給藥，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)?？贵w通常在有必要時多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約I-IOOOyg/ ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300 μ g/ml。另外，抗體可以作為持續(xù)釋放制劑給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。 在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者顯示疾病癥狀部分或完全改善。之后，患者可以以預(yù)防性方案給藥。本發(fā)明藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變，以獲得可有效實現(xiàn)對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括所用本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，所用特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與所用特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、 總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體的“治療有效劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的情況中，治療有效劑量優(yōu)選地防止SLE相關(guān)物理癥狀如疼痛或乏力進(jìn)一步惡化。治療有效劑量優(yōu)選地也防止或延緩SLE的發(fā)病，例如在出現(xiàn)疾病早期或初步征兆時這可能是希望的。同樣，也包括延緩SLE相關(guān)的慢性進(jìn)展。SLE診斷中使用的實驗室檢測包括化學(xué)、血液學(xué)、血清學(xué)和放射學(xué)方法。因此，監(jiān)測以上所述指標(biāo)的任何臨床或生化測定都可以用來確定特定治療是否是用于治療SLE的治療有效劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或施用途徑。本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域公知的一種或多種方法通過一種或多種施用途徑施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，施用途徑和/或方式根據(jù)需要的結(jié)果而不同。用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外施用途徑，例如注射或輸注。如此處所用的短語“腸胃外施用”是指不同于腸和局部施用的施用模式，通常是通過注射，包括但不局限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。此外，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑施用，如局部、表皮或粘膜途徑施用，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部?；钚曰衔锟梢允褂帽Ｗo(hù)化合物不被快速釋放的載體制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法是專利或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，Sustained and controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編著，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978。治療組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置施用。例如,在一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置施用，如在美國專利號5，399，163 ;5，383,851 ； 5，312，335 ;5，064，413 ;4，941,880 ;4，790，824 或 4，596，556 中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和組件的例子包括美國專利號4，487，603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利號4，486，194，該專利公開了用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號4，447，233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利號4，447，224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利號4，439，196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利號4，475，196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和組件。在某些實施方案中，可配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物能夠穿過BBB (如果需要時)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4，522，811 ;5，374，548和5，399，331。脂質(zhì)體可包含被選擇性地轉(zhuǎn)運入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個或多個部分，從而增強定向藥物遞送(參見，例如，V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 :685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low 等人的美國專利 5，416, 016);甘露糖苷(Umezawa 等(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 :1038);抗體(P. G. Bloeman 等(1995) FEBS Lett. 357 :140 ；M. Owais 等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39 :180);表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe 等(1995) Am. J. Physiol. 1233 :134) ;pl20 (Schreier 等(1994)J. Biol. Chem. 269 :9090);也參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 :123 ；J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994) Immunomethods4 :273。本發(fā)明的使用和方法本發(fā)明的抗體(和免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子)具有體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。例如，這些分子可以施用于例如在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者例如在體內(nèi)施用于人類受試者，以治療、預(yù)防或診斷多種疾病。如此處使用的術(shù)語“受試者”包括人和非人動物。 非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動物和爬行類動物。這些方法特別適合治療患有與異?；虿划?dāng)I型干擾素表達(dá)(例如過量表達(dá))相關(guān)的疾病的人類患者。當(dāng)抗IFNAR-I抗體與另一種藥物一起給藥時，這兩種藥物可以依次或同時給藥。 例如,本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以與一種或多種以下藥物組合使用抗-IFNa抗體、抗 IFN Y受體抗體、可溶性IFN Y受體、抗-TNF抗體、抗-TNF受體抗體和/或可溶性TNF受體 (參見例如美國專利5，888，511)。此外，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以與Flt3配體拮抗劑組合使用(參見例如美國申請2002/0160974)。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體(和免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子)可以用于檢測IFNAR-I的水平或表達(dá)IFNAR-I的細(xì)胞的水平。例如，這可以如下實現(xiàn)使樣品(如體外樣品)和對照樣品在允許該抗體和IFNAR-I之間形成復(fù)合物的條件下接觸抗-IFNAR-I抗體。檢測在抗體和IFNAR-I之間形成的任何復(fù)合物，并在樣品和對照之間進(jìn)行比較。例如， 可以用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如ELISA和流式細(xì)胞試驗。因此，一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測樣品中IFNAR-1(例如人IFNAR-I抗原) 的存在，或測定IFNAR-I的量的方法，包括在允許抗體或其部分與IFNAR-I之間形成復(fù)合物的條件下使樣品和對照樣品接觸特異性結(jié)合IFNAR-I的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。然后檢測復(fù)合物的形成，其中樣品與對照樣品之間復(fù)合物形成的不同表示樣品中存在 IFNAR-I 抗原。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括藥盒,其中包括本發(fā)明的組合物(例如抗體、人抗體、免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子)和使用說明。該藥盒可以進(jìn)一步包括至少一種另外的試劑，或本發(fā)明的一種或多種另外的抗體(例如，具有互補活性的抗體，它所結(jié)合的靶抗原上的表位與第一抗體不同)。藥盒一般包括表明藥盒內(nèi)容物目標(biāo)用途的標(biāo)記。術(shù)語標(biāo)記包括藥盒提供的或以其他方式附帶的任何書面或記錄材料。IFNAR-I是I型干擾素的細(xì)胞受體的一部分，眾所周知I型干擾素是與T細(xì)胞分化、抗體產(chǎn)生和記憶T細(xì)胞活性和存活有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。而且，在許多自身免疫病、HIV感染、移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)中已經(jīng)描述了 I型干擾素的表達(dá)提高。 因此，抑制I型干擾素功能活性的本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體(和免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子)可以用于與異?；虿幌Ｍ腎型干擾素活性有關(guān)的多種臨床適應(yīng)癥。因此，本發(fā)明提供一種抑制I型干擾素介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，其中該方法包括施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分(或本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子)，使I型干擾素介導(dǎo)的疾病或病癥得到治療。可以應(yīng)用本發(fā)明的抗體治療的自身免疫病的具體例子包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、炎性腸病(IBD)(包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和乳糜瀉)、多發(fā)性硬化癥(MS)、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和腎小球腎炎。此外，本發(fā)明的抗體組合物能夠用于抑制或預(yù)防移植排斥或用于治療移植物抗宿主疾病(GVHD)或治療HIV感染/AIDS。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清中觀察到高水平的IFNa (參見，例如，Kim等 (1987)Clin. Exp. Immunol. 70 :5662-569)。而且，例如在癌癥或病毒性感染治療中的IFNa 給藥已經(jīng)顯不誘發(fā) SLE(Garcia-Porrua 等(1998)Clin. Exp. Rheumatol. 16 107-108)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以通過對需要治療的受試者施用抗體用于治療SLE。該抗體可以單獨使用或者與其他抗SLE藥物如非留體抗炎藥(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、皮質(zhì)類固醇(例如強的松、氫化可的松)、免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤和氨甲喋呤)、抗瘧藥(如羥氯喹)和抑制產(chǎn)生dsDNA抗體的生物藥物(例如LJP394)組合使用。IFNa也與I型糖尿病的病理學(xué)有關(guān)。例如，已經(jīng)報道了在I型糖尿病患者的胰島 β細(xì)胞中存在免疫反應(yīng)性IFNa (Foulis等(1987) Lancet2 :1423-1427)。在抗病毒治療中長期使用 IFNa 也顯不誘發(fā) I 型糖尿病(Waguri 等(1994)Diabetes Res. Clin. Pract. 23 33-36)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療I型糖尿病。該抗體可以單獨使用或者與其他抗糖尿病藥物如胰島素組合使用。IFNAR的抗體已經(jīng)證明在炎性腸病動物模型中有效(參見美國專利申請 60/465, 155)。因此，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療炎性腸病(IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。該抗體可以單獨使用或者與其他抗IBD藥物如含有關(guān)沙拉秦的藥物(包括柳氮磺吡啶和含有5-氨基水楊酸(5-ASA)的其他藥物，如奧沙拉秦和巴柳氮)、非留體抗炎藥(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、皮質(zhì)類固醇(例如強的松、氫化可的松)、TNF抑制劑(包括adilimumab (Humira )、依那西普(Enbrel )和英夫利昔單抗(Remicade ))、免疫抑制劑(如6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤和環(huán)孢素A)和抗生素組合使用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用IFN α治療可誘發(fā)自身免疫性甲狀腺炎(Monzani等(2004) Cl in. Exp. Med. 3 :199-210 ；Prummel 和 Laurberg (2003) Thyroid 13 :547-551)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療自身免疫性甲狀腺病，包括自身免疫性原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎和伴有甲狀腺功能減退的破壞性甲狀腺炎。該抗體可以單獨使用或者與其他藥物或治療如抗甲狀腺藥物、放射性碘和甲狀腺次全切除術(shù)組合使用。在RA患者血清中已經(jīng)觀察到水平升高的I型干擾素，特別是IFN-β (參見例如 Hertzog 等(1988)Clin. Immunol. Immunopath. 48 :192)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療RA。該抗體可以單獨使用或者與一種或多種其他抗RA藥物如非留體抗炎藥(NSAID)、C0X-2抑制劑、鎮(zhèn)痛藥、皮質(zhì)類固醇(例如強的松、氫化可的松)、金、免疫抑制劑(如氨甲喋呤)、B細(xì)胞消耗劑 (例如Rituxan )、B細(xì)胞激動劑(例如LymphoStat-B )和抗-TNF- α劑(例如EMBREL 、 HUMIRA 和 REMICADE )組合使用。曾經(jīng)報道IFNa給藥使牛皮癬惡化。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體可以用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療牛皮癬和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎。該抗體可以單獨使用或者與一種或多種其他抗牛皮癬治療如光療、局部治療(例如局部糖皮質(zhì)激素)或全身治療(例如氨甲喋呤、合成類維生素A、環(huán)孢素)、抗-TNF-a劑 (例如EMBREL 、HUMIRA 和REMICADE )和T細(xì)胞抑制劑(例如Raptiva )組合使用。在HIV感染患者的循環(huán)中也曾經(jīng)觀察到高水平的IFNa，并且它的存在是AIDS進(jìn)展的預(yù)測性標(biāo)記(DeStefano 等(1982) J. Infec. Disease 146 :451 ;Vadhan_Raj 等(1986) Cancer Res. 46 :417)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體用于通過對需要治療的受試者施用抗體來治療HIV感染或AIDS。該抗體可以單獨使用或者與其他抗HIV劑如核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和融合抑制劑組合使用。已經(jīng)證明IFNAR-I的抗體在抑制同種異體移植排斥和延長同種異體移植存活期中有效(參見，例如，Tovey 等(1996) J. Leukoc. Biol. 59 :512-517 ;Benizri 等(1998) J. Interferon Cytokine Res. 18 :273-284)。因此,本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體也可以用于移植物接受者，以抑制同種異體移植排斥和/或延長同種異體移植存活期。本發(fā)明提供一種通過對需要治療的移植接受者施用本發(fā)明的抗-IFNAR-I抗體來抑制移植排斥的方法?？梢灾委煹慕M織移植的例子包括但不限于肝、肺、腎、心臟、小腸和胰島細(xì)胞，以及移植物抗宿主病(GVHD)的治療。該抗體可以單獨使用或者與其他抑制移植排斥的藥物如免疫抑制劑(例如環(huán)孢素、硫唑嘌呤、甲基強的松龍、強的松龍、強的松、麥考酚酸莫酯、西羅莫司、雷帕霉素、他克莫司)、抗感染劑(例如阿昔洛韋、克霉唑、更昔洛韋、制霉菌素、復(fù)方新諾明)、 利尿劑(例如布美他尼、呋塞米、美托拉宗)和潰瘍藥物(例如西咪替丁、法莫替丁、蘭索拉唑、奧美拉唑、雷尼替丁、硫糖鋁)組合使用。本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將該實施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請的內(nèi)容均引用作為參考。
實施例實施例I :抗IFNAR-I人單克隆抗體的產(chǎn)生抗原含有IFNAR-I胞外域的可溶性IFNAR-I通過重組方法產(chǎn)生，并且用作免疫的抗原。轉(zhuǎn)基因HuMab小鼠用均表達(dá)人抗體基因的HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠HCo7、HCo12和HCo7XHCol2系制備抗IFNAR-I的完全人單克隆抗體。在這些小鼠系中，已經(jīng)如Chen等(1993)EMBO J. 12 811-820所述將內(nèi)源小鼠K輕鏈基因純合地破壞，并且已經(jīng)如PCT公布WO 01/09187的實施例I所述將內(nèi)源小鼠重鏈基因純合地破壞。這些小鼠系均攜帶人K輕鏈轉(zhuǎn)基因，KCo5， 如 Fishwild 等(1996) Nature Biotechnology 14 :845-851 所述。HCo7 系攜帶 HCo7 人重鏈轉(zhuǎn)基因，如美國專利No. 5，545，806,5, 625，825和5，545，807所述。Hco12系攜帶Hco12人重鏈轉(zhuǎn)基因，如PCT公布WO 01/09187的實施例2所述。HCo7XHCol2系攜帶HCo7和HCol2 轉(zhuǎn)基因，通過使兩個系繁殖而產(chǎn)生。HuMab小鼠的免疫為了產(chǎn)生抗IFNAR-I的完全人單克隆抗體，用純化的重組IFNAR-I作為抗原免疫HuMab小鼠。用于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg, N.等(1994)Nature 368 856-859 ；Fishwild, D.等(1996)Nature Biotechnology 14:845-851 和 PCT 公布 WO 98/24884中描述。在第一次輸注抗原時小鼠為6_16周齡。利用純化的重組可溶性IFNAR-I 抗原制劑(5-50 μ g)經(jīng)腹膜內(nèi)、皮下(Sc)或通過足墊注射來免疫HuMab小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠用完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)、皮下(Sc)或通過足墊(FP)免疫兩次，然后用不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原經(jīng)腹膜內(nèi)、皮下或通過足墊免疫3-21天(最多可達(dá)總共11次免疫)。通過眶后采血監(jiān)測免疫應(yīng)答。通過ELISA對血漿進(jìn)行篩選(如下文所述)，具有足夠的抗-IFNAR-I人免疫球蛋白效價的小鼠用于進(jìn)行融合。用抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對小鼠進(jìn)行加強免疫，3天及2天后處死小鼠并取出脾臟。每種抗原一般進(jìn)行10-35次融合。每種抗原使用數(shù)十只小鼠。產(chǎn)生抗-IFNAR-I抗體的HuMab小鼠的選擇為了選擇產(chǎn)生可結(jié)合IFNAR-I的抗體的HuMab小鼠，如Fishwild, D.等(1996) 所述通過ELISA檢測來自被免疫小鼠的血清。簡要地說，用來自大腸桿菌的純化的重組 IFNAR-I，在PBS中以I-2 μ g/ml的濃度，50 μ I/孔的量，包被微量滴定板，4°C下溫育過夜， 然后用PBS/Tween (O. 05% )中的5%雞血清以200 μ I/孔封閉。將來自IFNAR-I免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中，室溫下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗板，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgG Fe多克隆抗體在室溫下溫育I小時。洗滌后，平板用ABTS 底物(Sigma，A-1888,0. 22mg/ml)顯色，并用分光光度計在OD 415-495下分析。顯示最高抗-IFNAR-I抗體效價的小鼠用于進(jìn)行融合。融合如下文所述進(jìn)行，通過ELISA檢測雜交瘤上清液的抗-IFNAR-I活性。產(chǎn)生抗IFNAR-I人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生從HuMab小鼠中分離脾細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序用PEG將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。使用50% PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液與1/4數(shù)目的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， CRL 1581)融合。將細(xì)胞以約I X IO5/孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基中溫育約兩周，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、10% P388D1(ATCC，CRL TIB-63)條件介質(zhì)、3-5%于DMEM(MediateCh，CRL 10013，含高濃度葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)加 5mMHEPES 中的 origen (IGEN)、0· 055mM 2-巰基乙醇、50mg/ml 慶大霉素和 I X HAT (Sigma, CRL P-7185)。1-2周后，將細(xì)胞在用HT替代了其中的HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過 ELISA(如上所述)對各個孔進(jìn)行人抗IFNAR-I單克隆IgG抗體的篩選。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天后監(jiān)測培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次接種，再次篩選，并且如果對于人IgG仍然是陽性的，則通過有限稀釋將抗IFNAR-I單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的抗體用于進(jìn)一步表征。選擇雜交瘤克隆3F11、4G5、11E2和9D4用于進(jìn)一步的分析。實施例2 :人單克隆抗體3F11、4G5、11E2和9D4的結(jié)構(gòu)表征編碼3F11、4G5、11E2和9D4單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列利用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)分別從3F11、4G5、11E2和9D4雜交瘤獲得，并利用標(biāo)準(zhǔn)DNA測序技術(shù)進(jìn)行測序。3F11的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖IA和SEQ ID NO 33和 25中。3F11的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖IB和SEQ ID NO 37和 29中。3F11重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，3F11 重鏈應(yīng)用了來自人種系VH 4-34的Vh區(qū)段，一個未確定的D區(qū)段，和來自人種系Jh 6b的Jh 區(qū)段。3F11 Vh序列與種系VH 4-34序列的對比顯示于圖5中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對3F11 Vh序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，分別如圖IA和圖5和 SEQ ID NO :1、5 和 9 所示。
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3F11輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，3F11 輕鏈應(yīng)用了來自人種系Vk L18的'區(qū)段和來自人種系JK 5的JK區(qū)段。3F11 '序列與種系Vk L18序列的對比顯示于圖8中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對3F11八序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，分別如圖IB和圖8和SEQ ID NO: 13、17和21 所示。4G5的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQ ID NO :34和26中。4G5的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQ ID NO :38和30中。4G5重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，4G5重鏈應(yīng)用了來自人種系Vh 4-34的Vh區(qū)段、未確定的D區(qū)段和來自人種系JH 4b的JH區(qū)段。 4G5VH序列與種系Vh 4-34序列的對比顯示于圖6中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對4G5VH 序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了重鏈⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)，分別如圖2A和圖6以及SEQ ID NO 2、6、10 所示。4G5輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，4G5輕鏈應(yīng)用了來自人種系\ L18的VL區(qū)段和來自人種系JK 2的JK區(qū)段。4G5VL序列與種系 Vk L18序列的對比顯示于圖9中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對4G5VL序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，分別如圖2B和圖9以及SEQ ID NO :14、18、22所示。11E2的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3A和SEQ ID NO :35和 27中。11E2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3B和SEQ ID NO :39和 31中。11E2重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，11E2 重鏈來源于或者高度類似于來自人種系VH 5-51的Vh區(qū)段、未確定的D區(qū)段和來自人種系 JH 4b的JH區(qū)段。11E2VH序列與種系VH 5_51序列的對比顯示于圖7中。利用Kabat CDR 區(qū)測定系統(tǒng)對11E2VH序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了重鏈⑶Rl XDR2和⑶R3區(qū)，分別如圖3A和圖 7 以及 SEQ ID NO :3、7、11 所示。11E2輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，11E2 輕鏈應(yīng)用了來自人種系Vk A27的VL區(qū)段和來自人種系JK 5的JK區(qū)段。11E2VL序列與種系乂!^ A27序列的對比顯示于圖10中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對11E2VL序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了輕鏈⑶R1、⑶R2和CDR3區(qū)，分別如圖3B和圖10以及SEQ ID N0:15、19、23所
9D4的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQ ID NO 36和28中。9D4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQ ID NO 40和32中。9D4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，9D4重鏈來源于或者高度類似于來自人種系VH 5-51的Vh區(qū)段，未確定的D區(qū)段，和來自人種系 Jh 4b的Jh區(qū)段。9D4 Vh序列與種系VH 5-51序列的對比顯示于圖7中。利用Kabat CDR區(qū)測定系統(tǒng)對9D4 Vh序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出了重鏈⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)，分別如圖4A和圖7和SEQ ID NO :4、8和12所示。9D4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，9D4輕鏈應(yīng)用了來自人種系Vk A27的\區(qū)段和來自人種系JK 5的JK區(qū)段。9D4 Vl序列與種系 Vk A27序列的對比顯示于圖10中。利用Kabat⑶R區(qū)測定系統(tǒng)對9D4 \序列的進(jìn)一步分析標(biāo)出7輕鏈CDRl、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3B和圖10和SEQ ID NO : 16、20和24所示。實施例3 :抗-IFNAR-I人單克隆抗體抑制干擾素a 2b的生物活性來源于人B淋巴母細(xì)胞burkitts淋巴瘤的Daudi細(xì)胞系表達(dá)高水平的IFNAR-1, 這些細(xì)胞的生長被I型干擾素抑制。為了測定人抗-IFNAR-I抗體的功能阻斷能力，進(jìn)行兩個不同的試驗，即細(xì)胞增殖試驗和報道(importer)試驗。在第一個試驗中，Daudi細(xì)胞與干擾素a 2b在存在或不存在抗體的情況下培養(yǎng)， 通過3 [H]-胸苷的攝取測定增殖。Daudi細(xì)胞(ATCC CCL-213)在含有10% FCS和2mM β-巰基乙醇的RPMI (培養(yǎng)基)中生長。旋轉(zhuǎn)離心細(xì)胞，以I X IO6細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于添加了 I %人血清白蛋白的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基+HS)中。向96孔板的每孔中加入100 μ I含有適當(dāng)濃度抗體的200U/ml干擾素a 2b (Schering Corporation)。向孔中加入100 μ I在培養(yǎng)基 +HS中的Daudi細(xì)胞，培養(yǎng)板在37°C下溫育48小時。用I μ Ci3[H]-胸苷對該板進(jìn)行脈沖， 再溫育24小時。收集該板，合并到96孔纖維濾板上，用TopCount閃爍計數(shù)器(Packard) 計數(shù)。將每分鐘的計數(shù)對抗體濃度作圖，使用Prism軟件(San Diego, CA),通過非線性回歸，S形劑量應(yīng)答(可變斜率)分析數(shù)據(jù)。在第二個試驗中，用一種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，該構(gòu)建體中干擾素刺激的應(yīng)答成分與報道基因連接(ISRE-RG)，測定人源化抗-IFNAR-I抗體阻斷IFN-誘導(dǎo)的報道基因表達(dá)的能力。細(xì)胞在含有10% FCS和2mM β -巰基乙醇的RPMI (培養(yǎng)基)中生長。將細(xì)胞 (I X IO6細(xì)胞/ml)重懸浮于添加了 2%人血清的培養(yǎng)基中。向96孔板中加入100 μ I細(xì)胞。 抗體用含有200U/ml干擾素a 2b (Schering Corporation)的培養(yǎng)基系列稀釋，向每孔中加 AlOOyl0培養(yǎng)板在37°C下溫育過夜。溫育后，通過流式細(xì)胞術(shù)評價報道基因的表達(dá)。將幾何平均熒光強度對抗體濃度作圖，使用Prism軟件(San Diego, CA)，通過非線性回歸，S 形劑量應(yīng)答(可變斜率)分析數(shù)據(jù)。使用上述兩個試驗，比較3F11人單克隆抗體與鼠抗-IFNAR-I抗體64G12(ECACC 登記號92022605)和人源化抗-IFNAR-I抗體Dl H3K1 (在美國系列號60/465，058中描述) 的效價。顯示3F11的效價5-10倍高于小鼠抗體，6-30倍高于人源化抗體。結(jié)果總結(jié)在以下的表I中。表I :人抗-IFNAR-I抗體時干擾素a 2b的阻斷能力同種型細(xì)胞增殖(Daudi) EC50 ( nM)ISRE-RG報道基因 (U937 )EC50( nM)64G12m IgGl3.16.0DI H3K1hlgGl9.38.03F11hlgGl0.31.2實施例4 -M -IFNAR-I人單克隆抗體抑制IFNco的生物活性利用如實施例3所述的Daudi增殖試驗，檢測了人抗-IFNAR-I抗體抑制IFNco應(yīng)答的能力。向96孔板的每孔中加入100 μ I含有適當(dāng)濃度抗體的200U/ml干擾素ω (PBL)。 人抗體3F11、4G5、11E2和9D4比小鼠64G12抗體強4-18倍(根據(jù)EC50確定)。結(jié)果總結(jié)在以下的表2中。表2 :人抗-IFNAR-I抗體對干擾素ω的阻斷能力
同種型細(xì)胞增殖(Daudi) EC50 ( nM)64G12m IgGl5.5DI H3K1hlgGl30.73F11hlgGl0.64G5hlgGl1.411E2hlgGl0.39D4hlgGl0.3實施例5 :抗-IFNAR-I人單克隆抗體抑制多種I型IFN的生物活性如實施例3所述，干擾素α以劑量依賴的方式抑制Daudi (burkitts淋巴瘤, ATCC#CCL-213)的增殖。阻斷干擾素與其受體結(jié)合的中和抗體將使增殖得到恢復(fù)。利用這種細(xì)胞增殖試驗，通過檢測天然類淋巴母細(xì)胞IFNa、天然白細(xì)胞干擾素、13種重組IFNa 亞型、IFN0和IFNco的阻斷，檢測了純化的人抗-IFNa抗體的特異性。Daudi細(xì)胞在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中在添加及不加IFN α的培養(yǎng)基(RPMI 1640， 補充10% FCS，1X2-ME，L-谷氨酰胺和青霉素鏈霉素)中生長。檢測的各種I型干擾素在EC5tl下測定，并與一般從50 μ g/ml (312nM)至381pg/ml (2· 4pM)兩倍連續(xù)稀釋的抗-IFNAR-I抗體3F11混合。將抗體/IFN混合物加至96孔平底培養(yǎng)板的Daudi細(xì)胞中，至終密度為I X IO4Daudi細(xì)胞/100 μ I/孔，并在37°C,5% CO2下溫育72小時。加入20 μ I/ 孔的MTS (Promega)測定增殖，再溫育3小時后測量490nm下的0D?；罴?xì)胞數(shù)與OD讀數(shù)成比例。相對于不含IFN( = 100%阻斷)和只存在IFN( = 0%阻斷)時的Daudi增殖，計算干擾素阻斷百分比。根據(jù)阻斷程度對3F11抗體進(jìn)行評分，產(chǎn)生IFNa亞型特異性的分布圖。 結(jié)果證明，人抗-干擾素α受體-I抗體3F11抑制多種IFNa亞型的作用，包括IFN a 6， 2b，2a，l，16，10，8，5，14，17，7，4 和 21，以及類淋巴母細(xì)胞 IFN、白細(xì)胞 IFN 和 IFNco。3F11是IFN0的低水平抑制劑，但是觀察到大于50%的抑制。干擾素的％阻斷和標(biāo)準(zhǔn)差在下面的表3中顯示。表3 :多種I型干擾素的抗體抑制
3F11 在 IOOOxAb 時的 IFN 阻斷(％)IFN平均值標(biāo)準(zhǔn)差類淋巴母細(xì)胞IFN94.92.9IFNa 6107.16.6IFNa 2b101.90.4IFNa 2a103.13.0IFNa I111.61.9白細(xì)胞IFN109.41.4IFNa 16105.71.4IFNa 1096.75.5IFNa 887.52.6IFNa 5105.13.9IFNa 14100.31.4IFNa 1799.82.4IFNa 7102.83.2IFNa 4100.52.5IFNa 21104.42.3IFN-β53.01.7IFN-ω107.11.3實施例6 -M -IFNAR-I抗體對IFN誘導(dǎo)的IP-10分泌的抑制已經(jīng)證明向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFNa 2b誘導(dǎo)正常外周血單核細(xì)胞(PBMNC)分泌IP-10。通過ELISA結(jié)合試驗檢測人抗-IFNAR-I抗體3F 11抑制干擾素誘導(dǎo)的正常PBMNC 培養(yǎng)物分泌ip- ο的活性。PBMNC 在培養(yǎng)基(RPMI 1640+10% FBS+1%人血清)中與白細(xì)胞 IFN、IFN a 2b 或 IFNco溫育24-48小時。收集上清液，用定量夾心ELiSA試劑盒(Quantikine , R&D Systems)按照廠商推薦以I : 30的稀釋度分析IP-10/CXCL10濃度。結(jié)果證明人單克隆抗體3F11抑制白細(xì)胞IFN、重組IFNa 2b和重組IFNco誘導(dǎo)的正常PBMNC培養(yǎng)物分泌IP-10。 這些結(jié)果顯示在表4中。表4 :IFN誘導(dǎo)的正常PBMNC的IP-10表達(dá)的抗體抑制
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合人干擾素α受體I (IFNAR-I)的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體a)以IX 10_7M或更低的Kd結(jié)合IFNAR-I ；b)抑制IFN-β的生物活性；而且c)與鼠單克隆抗體64G12 (ECACC登記號92022605)不結(jié)合相同的表位。
2.權(quán)利要求I的抗體，其中該抗體以IXKT8M或更低的Kd結(jié)合人干擾素α受體I。
3.權(quán)利要求I的抗體，其中該抗體以IXKT9M或更低的Kd結(jié)合人干擾素α受體I。
4.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競爭結(jié)合人干擾素α受體1，其中該參比抗體選自a)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQID NO :25的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 29的氨基酸序列的抗體；b)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQID NO :26的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 30的氨基酸序列的抗體；和c)其所含的重鏈可變區(qū)含有SEQID NO :27的氨基酸序列、所含的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 31的氨基酸序列的抗體。
5.權(quán)利要求1-4的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)是人Vh 4-34或5-51基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
6.權(quán)利要求I的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的輕鏈可變區(qū)是人Vk L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
7.權(quán)利要求5的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的輕鏈可變區(qū)是人Vk L18或A27基因的產(chǎn)物或來源于該基因。
8.權(quán)利要求7的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含人Vh4-34基因的重鏈可變區(qū)和AVk L18基因的輕鏈可變區(qū)。
9.權(quán)利要求7的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含人Vh5-51基因的重鏈可變區(qū)和AVk A27基因的輕鏈可變區(qū)。
10.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含包含SEQ ID NO 1的人重鏈可變區(qū)CDRl 包含SEQ ID NO 5的人重鏈可變區(qū)CDR2 包含SEQ ID NO 9的人重鏈可變區(qū)CDR3 包含SEQ ID NO 13的人輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 17的人輕鏈可變區(qū)⑶R2 ;和包含SEQ ID NO 21的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
11.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含包含SEQ ID NO 2的人重鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 6的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 10的人重鏈可變區(qū)CDR3 包含SEQ ID NO 14的人輕鏈可變區(qū)CDRl 包含SEQ ID NO 18的人輕鏈可變區(qū)⑶R2 ;和包含SEQ ID NO 22的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
12.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQID NO 3的人重鏈可變區(qū)CDR1 ；(b)包含SEQID NO 7的人重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQID NO 11的人重鏈可變區(qū)⑶R3 ；(d)包含SEQID NO 15的人輕鏈可變區(qū)CDR1 ；(e)包含SEQID NO 19的人輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和(f)包含SEQID NO 23的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
13.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQID NO 25的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQID NO 29的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
14.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQID NO 26的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQID NO 30的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
15.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQID NO 27的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQID NO 31的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。
16.一種特異性結(jié)合人干擾素a受體l(IFNAR-l)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合 部分，其中所述抗體包含含有⑶R1XDR2和⑶R3序列的人重鏈可變區(qū)和含有⑶R1XDR2和 ⑶R3序列的人輕鏈可變區(qū)，其中a)人重鏈可變區(qū)⑶R3序列包括選自SEQID NO :9、10和11的氨基酸序列；b)人輕鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自SEQID NO 2U22和23的氨基酸序列；而且c)所述抗體抑制至少一種I型干擾素的生物活性。
17.—種組合物，其含有權(quán)利要求1-16中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上 可接受的載體。
18.—種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的權(quán)利要求1-16中任一項的抗體或其抗原 結(jié)合部分。
19.權(quán)利要求18的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
20.權(quán)利要求18的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是一種細(xì)胞毒素。
21.權(quán)利要求20的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
22.權(quán)利要求18的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是一種放射性同位素。
23.權(quán)利要求22的免疫偶聯(lián)物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
24.一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的權(quán)利要求1-16中任一項的抗體 或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
25.一種組合物，其含有權(quán)利要求24的雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體。
26.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-16中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分。
27.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求26的核酸分子。
28.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求27的表達(dá)載體。
29.—種制備分離的抗-IFNAR-1抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :1、2和3的⑶R1序列，選自 SEQ ID NO :5、6 和 7 的 CDR2 序列，和選自 SEQ ID NO :9、10 和 11 的 CDR3 序列；或(ii) 輕鏈可變區(qū)抗體序列，其含有選自SEQ ID NO :13、14和15的⑶Rl序列，選自SEQ ID NO .17、18和19的CDR2序列，和選自SEQ ID NO :21、22和23的CDR3序列；(b)將所述抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
30.一種抑制I型干擾素對表達(dá)干擾素α受體I的細(xì)胞的生物活性的體外方法，包括使所述細(xì)胞接觸權(quán)利要求1-16中任一項的抗體，使得I型干擾素的生物活性受到抑制。
31.一種治療需要治療的受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，包括向該受試者施用權(quán)利要求1-16中任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，使該受試者中I型干擾素介導(dǎo)的疾病得到治療。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述I型干擾素介導(dǎo)的疾病是干擾素α介導(dǎo)的疾病。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病或病癥是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病或病癥選自胰島素依賴型糖尿病、炎性腸病、 多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病或病癥是HIV感染或AIDS。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病或病癥是移植排斥或移植物抗宿主疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供結(jié)合IFNAR-1并且能夠抑制I型干擾素生物活性的分離的人單克隆抗體。也提供了包含本發(fā)明抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本發(fā)明還提供應(yīng)用本發(fā)明的抗體抑制I型干擾素介導(dǎo)的疾病的生物活性的方法，包括應(yīng)用本發(fā)明的抗體治療自身免疫病、移植排斥或移植物抗宿主疾病的方法。
文檔編號A61P13/12GK102603894SQ201210053959
公開日2012年7月25日 申請日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者約瑟芬·M·卡達(dá)雷爾利, 艾莉森·威特, 莫漢·斯里尼瓦桑 申請人:米德列斯公司