專利名稱：含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，具體涉及含有穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物及其在制備治療肝癌、胃癌、 肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一大類疾病，世界衛(wèi)生組織調(diào)查報(bào)告表明，全球癌癥狀況日益嚴(yán)重，因癌癥而死亡的人數(shù)將由每年的600萬(wàn)增加至1000萬(wàn)。其中肺癌為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，源于各級(jí)支氣管上皮，分為細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌；原發(fā)性肝癌為發(fā)生在肝細(xì)胞與肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的癌變，是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一；結(jié)腸癌的發(fā)病與環(huán)境、生活習(xí)慣尤其是飲食方式有關(guān)，隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，其起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，為顱內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35-60%。目前，惡性腫瘤的藥物治療已經(jīng)成為腫瘤三大治療手段之一，開(kāi)發(fā)具有抗腫瘤的天然藥物成為目前研究的熱點(diǎn)，中藥配伍增進(jìn)療效是研究抗腫瘤藥物的新方向。穿山龍具有祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)，活血止痛的功效，近些年，關(guān)于穿山龍?zhí)崛∥锞哂锌鼓[瘤活性的報(bào)道越來(lái)越多，從中分離出單體薯蕷皂苷等也具有抗癌活性。蒺藜具有平肝解郁，活血祛風(fēng)等功效，從中提取出的哈爾滿堿具有抗菌活性，發(fā)明人前期工作發(fā)現(xiàn)其也具有抗腫瘤功效。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，1992年英國(guó)科學(xué)家Hickman等提出將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為以后腫瘤治療研究中的主要目標(biāo)和手段。細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條一條是通過(guò)胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase 條是通過(guò)胞內(nèi)線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，引起細(xì)胞凋亡。caspase_3 蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子。判斷聯(lián)合用藥效果的方法和數(shù)學(xué)模型有很多種，其中等效曲線-相互指數(shù)法 (Isobole-Interaction index method)是諸方法中最實(shí)用、最具操作性和最可靠的方法。 合理的聯(lián)合用藥有單用藥物不可比擬的優(yōu)越性，聯(lián)合用藥針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療將不僅旨在減少或延緩耐藥性的出現(xiàn)、降低毒性，而且通過(guò)多種藥物對(duì)癌細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用取得更好的療效。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種藥物組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體為含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物及其在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物中，所述哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物可以為哈爾滿堿、其衍生物及其結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明藥物組合物中的哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物優(yōu)選為哈爾滿堿。本發(fā)明藥物組合物中，所述組分包括但不限于哈爾滿堿藥物本身，還可以是其可藥用的鹽、水合物或衍生物等。本發(fā)明中，所述穿山龍?zhí)崛∥?extractfrom Dioscoreae nipponicae Rhizoma, DNR)是將穿山龍藥材粗粉用濃度為60% 80%乙醇提取后過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮干燥后得粗提物，將所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水層，再用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯萃取液得穿山龍?zhí)崛∥?。本發(fā)明藥物組合物中穿山龍?zhí)崛∥飪?yōu)選是將穿山龍藥材粗粉用濃度為70%乙醇提取3次后過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮干燥后得粗提物，將所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水層，再用乙酸乙酯萃取，減壓回收得穿山龍?zhí)崛∥?。本發(fā)明含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物中，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的重量比為O. 25 4 I;進(jìn)一步優(yōu)選穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的重量比為O. 5 2 I ;更優(yōu)選的，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的重量比為2 I。本發(fā)明含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物可以用于制備治療各種腫瘤的藥物，所述腫瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌。本發(fā)明粉穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物優(yōu)選用于制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用中，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿的重量比為O. 25 4 I ;進(jìn)一步優(yōu)選穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿的重量比為O. 5 2 I ； 更優(yōu)選的，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿的重量比為2 I。含有穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物的組合物在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物的應(yīng)用中，在將本發(fā)明組合物制成同時(shí)給藥的藥劑的方案中，穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物可以含在同一種藥物制劑如片劑或膠囊中，也可以將穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物分別做成制劑，如分別做成片劑或膠囊，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說(shuō)明書的指示同時(shí)服用；在將本發(fā)明組合物制成先后給藥的藥劑的方案中，可以將穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物分別做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說(shuō)明書指示的先后順序進(jìn)行服用，或?qū)⑸鲜鼋M合物中的兩種成分制成一種控釋的制劑，先釋放組合物中的一種成分、然后再釋放組合物中的另一種成分，患者只需要服用該控釋組合物制劑；在將本發(fā)明組合物制備成交叉給藥的藥劑的方案中，可以將穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物分別做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說(shuō)明書指示的交叉順序服用，或者將該藥物組合物制備成穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物交叉釋放的控釋制劑。穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物組合物在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用中，所述組合物中的穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物可以同時(shí)使用或以任何先后的順序使用，如可以將穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物同時(shí)給患者服用；也可以先將穿山龍?zhí)崛∥锝o患者服用、然后服用哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物藥物，或先服用哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物藥物、然后服用穿山龍?zhí)崛∥铮瑢?duì)于兩者服用的時(shí)間間隔沒(méi)有特別要求，但優(yōu)選服用兩種藥物的時(shí)間間隔不超過(guò)一天；或者兩種藥物交替給藥。本發(fā)明中，可將本發(fā)明穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成適于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選將穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物制成胃腸道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊、或控釋、緩釋制劑。在本發(fā)明穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物組合物的藥物制劑中，根據(jù)不同的制劑形式和制劑規(guī)格，所述組合物在制劑中的含量可以為質(zhì)量計(jì)為1-99%，優(yōu)選為10% -90% ;制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明組合物發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提；所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進(jìn)行制備。本發(fā)明中，組合物的制備方法沒(méi)有什么限制，穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物兩者可以進(jìn)行直接混合然后做成制劑，或分別和/或相應(yīng)的輔料混合分別做成制劑，然后再按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式包裝在一起，或分別和相應(yīng)的輔料混合然后再混合做成制劑。本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對(duì)象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能夠達(dá)到有效的血藥濃度為前提。本發(fā)明通過(guò)MTT法檢測(cè)了穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物進(jìn)行聯(lián)合對(duì)癌癥細(xì)胞增殖的影響；進(jìn)一步應(yīng)用等效曲線-相互指數(shù)法(Isobole-Interaction index method)評(píng)價(jià)兩藥的相互作用；還應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western印跡法檢測(cè)凋亡蛋白procaspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，本發(fā)明穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿及哈爾滿堿類衍生物組合治療肝癌具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，提高了藥物的療效，降低了給藥劑量，減少了副作用的發(fā)生。


圖I至圖3所示為DNR聯(lián)合哈爾滿堿對(duì)H印G2細(xì)胞增殖的抑制作用；圖4所示為DNR聯(lián)合哈爾滿堿對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果；圖5和圖6所示為DNR聯(lián)合哈爾滿堿對(duì)H印G2細(xì)胞凋亡的影響。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明并不受限于此。
取一定量穿山龍藥材粗粉，分別用濃度為60 %、65 %、70 %、75 %、80 %的乙醇進(jìn)行超聲提取，每個(gè)濃度下分別進(jìn)行了 2次提取和3次提取，獲得相應(yīng)的提取物。分別合并提取的濾液，減壓回收乙醇，干燥后得相應(yīng)的粗提物。將所得粗提物用水溶解后，用石油醚萃取后棄掉石油醚萃取層，剩余水層再用乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，獲得相應(yīng)的穿山龍?zhí)崛∥?DNR)。分別對(duì)獲得的提取物的活性進(jìn)行考察，活性結(jié)果顯示，上述提取物都具有較好的活性。為了便于后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)操作和對(duì)比，本發(fā)明活性實(shí)驗(yàn)選取70%的乙醇提取3次后獲得的提取物進(jìn)行。具體見(jiàn)樣品的提取分離部分所述。發(fā)明人考察了穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿聯(lián)合用藥對(duì)多種有代表性的癌細(xì)胞模型的抗癌效果，如肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿聯(lián)合用藥對(duì)上述癌細(xì)胞都具有不同程度的協(xié)同 (增強(qiáng))或相加作用。為了進(jìn)一步采用相互作用指數(shù)評(píng)價(jià)聯(lián)合作用效果，以及驗(yàn)證聯(lián)合用藥對(duì)癌癥細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用，選取較常見(jiàn)的人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞進(jìn)行具體細(xì)胞觀察實(shí)驗(yàn)。儀器N-1100D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化)；Maxi_dry Iyo凍干機(jī)(美國(guó) Heto-Holten公司)；C02培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司);倒置顯微鏡(德國(guó)Leica)； 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Forma公司);XS105DU型電子天平(瑞士 mettler toledo)； 超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Forma公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；電泳儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)。穿山龍(Dioscoreae nipponicae Rhizoma)購(gòu)自遼寧省醫(yī)藥實(shí)業(yè)有限公司；哈爾滿堿(美國(guó)ALDRICH，純度98% );石油醚(分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20100901-2)； 乙酸乙酯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20100805-2);無(wú)水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20100908);胎牛牛血清(FBS，美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)709778)； DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)NVM0345) ;0. 25%胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司，批號(hào) 842964);青霉素，鏈霉素(美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)691025)) ;DMS0(二甲基亞砜)，MTT(四甲基噻唑藍(lán))，碘化吡啶(PI)(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)試劑盒(購(gòu)自Clontech公司)；Procaspase_3 (半胱天冬酶_3酶原)(購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司)；抗β-actin抗體(購(gòu)自美國(guó)eBioscience)。人肝癌細(xì)胞株HepG2 (購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù))。樣品的提取分離取一定量穿山龍藥材粗粉，用70%乙醇超聲提取3次，合并濾液，減壓回收乙醇，干燥后得粗提物。將所得粗提物用水溶解后，用石油醚萃取后棄之， 剩余水層再用乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得穿山龍?zhí)崛∥?DNR)。用DMSO溶解配成 IOOmg · ml/1，置于_20°C冰箱密閉避光保存。臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液的制備人肝癌細(xì)胞株H印G2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。方法I :腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法，設(shè)空白組、對(duì)照組、DNR、哈爾滿堿和聯(lián)合用藥組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞IXlO5Amr1接種于96孔板上，每孔接種10(^匕置371、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，棄上清，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入100 μ L培養(yǎng)液稀釋的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h，在終止培養(yǎng)前 4h，每孔加入10 μ L MTT (5g .L—1)，再培養(yǎng)4h，小心吸棄上清，并加入100 μ L DMS0，用振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上用570nm,630nm處測(cè)定吸光度值(absorbance, A)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，
實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(Inhibitory rate, IR) = (I-實(shí)驗(yàn)組 A57tl,63(| 值 / 對(duì)照組 A57tl,63(| 值)X 100%。方法2:藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)采用兩藥相互作用指數(shù)(Interaction index, I)評(píng)價(jià)兩藥相互作用的性質(zhì),為了研究DNR和哈爾滿堿聯(lián)合用藥的效果，實(shí)驗(yàn)分別選取DNR和哈爾滿堿濃度比為4 : 1，2 : 1，
I: 1，1 : 2,1 4五個(gè)聯(lián)合用藥組，根據(jù)等效線圖的方法，藥物單獨(dú)作用時(shí)的IC5tl為等效線圖線X和Y軸的基點(diǎn)，連接兩者的聯(lián)線就為理論上的等效線，在線上的任何一點(diǎn)都代表聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)都為50%。當(dāng)產(chǎn)生協(xié)同(增強(qiáng))效應(yīng)時(shí)，等效線圖(連接聯(lián)合用藥和單獨(dú)用藥產(chǎn)生50%抑制作用的點(diǎn)的曲線)呈凹形；當(dāng)?shù)刃Ь€圖與理論等效線接近重合時(shí)，產(chǎn)生相加作用；當(dāng)產(chǎn)生拮抗作用時(shí)，等效線圖呈凸形。按下列公式計(jì)算Ix = ax/A+bx/Bo根據(jù)活細(xì)胞數(shù)(吸光度)進(jìn)行計(jì)算，ax、bx表示聯(lián)合用藥產(chǎn)生半數(shù)抑制率的藥物濃度；A、B表示單獨(dú)用藥產(chǎn)生50%抑制效應(yīng)時(shí)的藥物濃度。當(dāng)I < I時(shí)，表示協(xié)同(增強(qiáng))作用，點(diǎn)將落在等效曲線的下方；當(dāng)I = I時(shí)，表示相加作用，點(diǎn)落在等效曲線上；當(dāng)I > I時(shí)，表示拮抗作用，點(diǎn)落在等效曲線的上方。方法3:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于96孔板中，每孔加入I X IO5個(gè)ml/1細(xì)胞100 μ L，分別用不同濃度的DNR、哈爾滿堿及聯(lián)合用藥組處理細(xì)胞48h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。方法4 :流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期!fepG2細(xì)胞，以DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至2 X IO5個(gè)πι Λ 接種于12孔板中，每孔lmL。37°C、5% 0)2條件下培養(yǎng)過(guò)夜貼壁。次日分組加藥，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、DNR、哈爾滿堿及聯(lián)合用藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)48h、72h后，用O. 25%的胰酶消化收集細(xì)胞，2000rpm離心5min棄上清，用I Xbinding buffer清洗細(xì)胞一次，加入200 μ L Buffer,按AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)試劑盒說(shuō)明，分別加入AnnexinV-FITC 5 μ L和 PI 10 μ L，室溫避光孵育30min，上流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定細(xì)胞凋亡率。方法5 :統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用(S±s)表示，用單因素方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)間的顯著性檢驗(yàn)。以P < O. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下DNR聯(lián)合哈爾滿堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示，DNR和哈爾滿堿單獨(dú)用藥時(shí)的IC5tl分別為8.和13. 34 μ g.mL—1，當(dāng)兩者濃度比在O. 25 4 I 時(shí)，等效線圖呈凹形或與理論等效線接近，相應(yīng)的I < I或I與I接近，表明兩者聯(lián)合用藥在產(chǎn)生50%抑制效果時(shí)沒(méi)有拮抗作用。當(dāng)兩者濃度比在0.5 2 I時(shí)，等效線圖呈凹形或與理論等效線接近重合，相應(yīng)的I < I或I 1，表明兩者聯(lián)合用藥在產(chǎn)生50%抑制效果時(shí)有相加或協(xié)同(增強(qiáng))作用。最優(yōu)選的，當(dāng)濃度比為2 : I時(shí)，IC50為DNR 4. 92 yg .mL—1 和哈爾滿堿2. 4 等效線圖呈凹形且I = 0. 768 < I，表明此時(shí)DNR和哈爾滿堿能協(xié)同(增強(qiáng))抑制H印G2細(xì)胞的增殖，且用量分別為單獨(dú)用藥時(shí)的1/5，比單獨(dú)用藥時(shí)有極大的降低，見(jiàn)圖I至圖3和表I所示。
圖I (a)和圖I (b)所示為DNR和哈爾滿堿單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)H印G2細(xì)胞的抑制效果， H印G2細(xì)胞被作用于不同濃度的DNR或哈爾滿堿，作用時(shí)間是48小時(shí)。圖2 (a)和圖2 (b)所示為DNR和哈爾滿堿聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制效果， 以等體積的DNR和哈爾滿堿二者濃度比為2 I和I : 2的不同濃度的DNR和哈爾滿堿作用于H印G2細(xì)胞。圖3 (a)和圖3 (e)所示為DNR和哈爾滿堿聯(lián)合用藥對(duì)IfepG2細(xì)胞IC5tl等效線圖， 分別以濃度比為4 : 1，2 : 1，1 : 1，1 : 2和I : 4對(duì)！fepG2細(xì)胞聯(lián)合用藥。對(duì)角直線反映的是DNR和哈爾滿堿的IC5tl值，表示添加不同的固定的劑量比例的理論線。直線之下的凹形曲線表示協(xié)同(增強(qiáng))作用，與直線接近重合的線表示相加作用，接近直線的凸形曲線表示非拮抗作用。圖 3 (a)表不 DNR/Harmane = 4 : I,圖 3 (b)表不 DNR/Harmane = 2 : I,圖 3 (c) 表不 DNR/Harmane = I : I,圖 3 (d)表不 DNR/Harmane = I : 2,圖 3 (e)表不 DNR/Harmane = 1:4。表I所示是DNR、哈爾滿堿、DNR和哈爾滿堿聯(lián)合用藥的IC5tl值。表I、DNR、哈爾滿堿、DNR和哈爾滿堿聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的作用效果。
組別IC5o%g.mL-1)IDNR哈爾滿堿DNR8.43±0.29——哈爾滿堿—13.34 士 0.40—DNR/哈爾滿堿=4:19.96±0.132.49 士 0.121.368DNR/哈爾滿堿=2:14.92 士 0.072.46 士 0.040.768DNR/哈爾滿堿=1:15.48 士 0.245.48 士 0.081.061DNR哈爾滿堿=1:23.88±0.117.76 士 0.221.041DNR/哈爾滿堿=1:43.02 士 0.2612.08 士 0.321.264腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，大小均一，貼壁增長(zhǎng)呈梭行，細(xì)胞輪廓清楚，透明飽滿，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密。經(jīng)DNR 8yg ^mi;1和哈爾滿堿4 μ g · mL—1聯(lián)合用藥作用48h后,細(xì)胞密度減少,細(xì)胞呈圓形或橢圓形。并可見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征核固縮、體積縮小。圖4所示為經(jīng)48h用藥后腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(X200)，A :對(duì)照組；B :DNR(8l·! g .mL—1) ；C :哈爾滿堿(4 μ g · mL—1) ；D :聯(lián)合用藥(DNR 8 μ g · mL :+ @爾4 μ g · mLDNR聯(lián)合哈爾滿堿對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，藥物作用48h 后，對(duì)照組和哈爾滿堿(4 μ g · ml/1)的凋亡百分率分別為4. 99%，4. 52%，兩組間無(wú)顯著性差異。DNR (8μ g .mL-1)細(xì)胞凋亡率為42. 34%，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率達(dá)到52. 78%，比 DNR細(xì)胞凋亡率增加10. 44%，且聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < O. 05);藥物作用72h后，DNR進(jìn)入晚期凋亡，哈爾滿堿細(xì)胞凋亡率增加，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < O. 05)，聯(lián)合用藥后細(xì)胞凋亡率高達(dá)96%，細(xì)胞出現(xiàn)大面積的晚期凋亡。見(jiàn)圖5和圖6以及表2所示。圖5是DNR(8 μ g .mL’、哈爾滿堿(4 μ g .mL-1)以及聯(lián)合用藥48小時(shí)后H印G2細(xì)胞的凋亡情況，A :對(duì)照組；B DNR(8yg .mL—1) ；C :哈爾滿堿(4μ g .mL—1) ；D :聯(lián)合用藥(DNR8 μ g · ml/1+ 哈爾滿堿 4 μ g · ml/1)圖6是DNR (8 μ g .mL—1)、哈爾滿堿(4 μ g .mL—1)以及聯(lián)合用藥72小時(shí)后H印G2細(xì)胞的凋亡情況，A :對(duì)照組；B DNR(8yg .mL—1) ；C :哈爾滿堿(4μ g .mL—1) ；D :聯(lián)合用藥(DNR 8 μ g · ml/1+ 哈爾滿堿 4 μ g · ml/1)表2、DNR(8y g哈爾滿堿(4μ g .mL-1)以及聯(lián)合用藥對(duì)H印G2細(xì)胞凋亡影響(η = 3,χ士S )
凋亡率(％)
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，所述穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的重量比為O. 25 4 I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的重量比為O. 5 2 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的藥物組合物，其特征在于，所述穿山龍?zhí)崛∥锸菍⒋┥烬埶幉拇址塾脻舛葹?0% 80%乙醇提取后過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮干燥后得粗提物，將所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水層，再用乙酸乙酯萃取， 減壓回收乙酸乙酯萃取液得穿山龍?zhí)崛∥?；所述哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物為哈爾滿堿。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的藥物組合物在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述穿山龍?zhí)崛∥锸菍⒋┥烬埶幉拇址塾脻舛葹?0 % 80 %乙醇提取后過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮干燥后得粗提物，將所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水層，再用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯萃取液得穿山龍?zhí)崛∥?；所述哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物為哈爾滿堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，在制備治療肝癌的藥物的應(yīng)用中，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿的重量比為O. 25 4 I。
8.權(quán)利要求4所述的藥物組合物在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，在制備治療肝癌的藥物的應(yīng)用中，穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿的重量比為O. 25 4 I。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物中的穿山龍?zhí)崛∥锖凸枬M堿同時(shí)使用或以任何先后的順序使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有穿山龍?zhí)崛∥锱c哈爾滿堿及哈爾滿堿類衍生物的藥物組合物及其在制備治療肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明藥物組合物具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，提高了藥物的療效，降低了給藥劑量，減少了副作用的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61K31/437GK102579756SQ20121006703
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者方慧娟, 李東祥, 殷果, 焦健, 王玨, 王鐵杰, 肖麗和, 魯藝 申請(qǐng)人:深圳市藥品檢驗(yàn)所