專利名稱：石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，該石斛水提物具有雌激素樣作用，可有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病。
背景技術(shù)：
蘭科植物石斛(Dendrobium nobile Lindl.)，全年均可采收，采收后，除去雜質(zhì)， 用開(kāi)水略燙或烘軟，再邊搓邊烘曬，至葉鞘搓凈，干燥，即可。歷代名家對(duì)其均有論述和研究，認(rèn)為其性甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，益胃生津，滋陰清熱。主治陰傷津虧，口感煩渴，食少干嘔，病后虛熱等?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等作用，對(duì)惡性腫瘤的輔助治療，以及慢性胃炎、糖尿病、慢性咽炎和久病體虛免疫功能低下等方面都有廣泛的應(yīng)用。但尚未有關(guān)于石斛雌激素樣活性方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的就是提供一種石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，可有效解決制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病，從而用于解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病(如婦女更年期綜合癥等)的用藥問(wèn)題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，該石斛水提物是，將石斛每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次池，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物，該石斛水提物即為有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病(如婦女更年期綜合癥等)的藥物，即石斛水提物在制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病(如婦女更年期綜合癥等)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明水提物制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，并經(jīng)多次以上試驗(yàn)，均取得了相同或相近似的結(jié)果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開(kāi)辟了石斛藥用新用途，臨床意義巨大。


圖1為本發(fā)明石斛水提物對(duì)MCF-7增殖的影響(5 士s，n=6)示意圖。圖2為本發(fā)明石斛水提物對(duì)性未成熟小鼠子宮系數(shù)的影響& 士s，n=10)示意圖。圖3為本發(fā)明石斛水提物對(duì)ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果&士s，n=3)示意圖。圖4為本發(fā)明石斛水提物對(duì)ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果& 士s，n=3)示意圖。
具體實(shí)施方式
CN 102526500 A
以下結(jié)合實(shí)施例和有關(guān)試驗(yàn)資料對(duì)本發(fā)明的具體情況作詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明在具體實(shí)施中，所述的石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，該石斛水提物是由以下實(shí)施例給出實(shí)施例1該石斛水提物是，將石斛IOOg用其10倍重量的水IOOOg(即1000ml)煎煮2 次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為
15.65%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。實(shí)施例2該石斛水提物是，將石斛200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2 次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為
16.73%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。實(shí)施例3該石斛水提物是，將石斛300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2 次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為
17.23%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。根據(jù)上述方法按石斛和水的比例可以通過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)制得任意量的石斛水提物， 用于制備雌激素類藥物，有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病(如婦女更年期綜合癥等)的用藥治療問(wèn)題，并經(jīng)試驗(yàn)得到了充分證明，有關(guān)試驗(yàn)資料如下采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及報(bào)告基因技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了充分證明，其有關(guān)試驗(yàn)資料如下首先通過(guò)MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(E-SCREEN)，發(fā)現(xiàn)石斛水提物能夠顯著促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的增殖，說(shuō)明其在體外具有雌激素樣作用。其次通過(guò)小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)，證明石斛水提物能夠顯著增加性未成熟雌性小鼠的子宮系數(shù)，說(shuō)明其在體內(nèi)具有雌激素樣作用。最后通過(guò)ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證石斛水提物是通過(guò)與雌激素受體ER α和ER β的結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣作用。發(fā)明人已通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明藥物在制備雌激素類藥物中的新用途。其主要實(shí)施方案如下一、實(shí)驗(yàn)材料與方法1.實(shí)驗(yàn)藥物蘭科植物石斛(Dendrobium nobiIe Lindl.)采收后，除去雜質(zhì)，用開(kāi)水略燙或烘軟，再邊搓邊烘曬，至葉鞘搓凈，干燥，即可。石斛以10倍量的水煎煮2次，每次池，水煎液減壓干燥濃縮干燥得到石斛水提物。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株及質(zhì)粒昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9 12g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供。HEK293細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)對(duì)照質(zhì)粒P β gal-Contro 1、重組報(bào)告基因pERE-TAL-luc由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈(zèng)。重組人ER α (humanER α，hER α )表達(dá)載體pCXN2_hER α和重組人 ERβ (humanERβ，hERβ )表達(dá)載體pCXN2-hERβ由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系&itoshi Inoue博士惠贈(zèng)。3.主要試劑RPMI1640 培養(yǎng)基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000Reagent購(gòu)自 Gibco hvitrogen 公司；胎牛血清、無(wú)酚紅RPMI1640 培養(yǎng)基、17 β-雌二醇(17 β-estrogen，氏)、氨芐青霉素(Amp)、Tris堿和活性炭(Charcoal) 均購(gòu)自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；己烯雌酚片(合肥久聯(lián)制藥)；鄰-硝基苯-β -D-半乳吡喃糖苷(Ο-Nitrophenyl- β -D-galactopy ranoside, 0NPG)、EDTA, MTT 及 DMSO 為 Amresco 公司產(chǎn)品；Steady-GloR穩(wěn)定熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)、閃亮裂解緩沖液(Glo lysis Buffer)購(gòu)自Promega公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。4.所用主要儀器普通手術(shù)器械；二氧化碳培養(yǎng)箱(REVCO)；倒置顯微鏡(NIKON ECLIPSE TS100)； KDC-160HR高速低溫冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；酶標(biāo)儀(BI0-RAD 680)；純水儀(Sartorius 611VF) ；90_3磁力攪拌器(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ZRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(Nichipet EX PLUS)； AB204-N電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；IOcm培養(yǎng)皿、 96孔培養(yǎng)板、凍存管均為Corning公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán))；UV-7504PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(福州健洋科技儀器有限公司)；VeritasTM微板光度計(jì)(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；SHP-150型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。5.實(shí)驗(yàn)方法5. 1 MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MCF-7細(xì)胞經(jīng)無(wú)酚紅含10%去激素血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗兩次，用0. 25 %胰蛋白酶消化后，加入無(wú)酚紅含2 %去激素血清的 1^^11640培養(yǎng)基吹打均勻，以1\104個(gè)/!111的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為 200 μ L·培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37°C、5%C02培養(yǎng)7 后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μ 1DMS0， 震蕩5 lOmin，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度值 (A)，計(jì)算平均A值和增殖率(Proliferation Rate，RP)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。RP =實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值)4X 100%5.2小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組。給藥持續(xù)7天?？瞻讓?duì)照組每日蒸餾水0. 2ml/10g灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組每日己烯雌酚懸濁液(0. 35mg/kg/d)灌胃；石斛水提物按臨床用藥的20倍量X提取率計(jì)算，配成相應(yīng)濃度的混懸液，每日按O.anl/lOg灌胃。最后一次給藥24h后，脫頸處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮濕重X (體重F1XlOO^ )。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與空白組相比，計(jì)算P值考察有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5. 3 ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)5. 3.1細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)染前7 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞接種于M孔板，密度為16. OX IO4 個(gè)/0. 5ml/孔，且培養(yǎng)液為含10%去雌激素血清的無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白對(duì)照孔、雌二醇孔及待測(cè)藥物孔。5. 3. 2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染(1)7 后開(kāi)始轉(zhuǎn)染，小心吸出原培養(yǎng)基，加入400μ 1含10%去雌激素血清的無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)基。(2)取 3 只 EP 管，ER α 管中加 500 μ 1 無(wú)酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、8 μ lpCXN2_hERa 質(zhì)粒、8 μ IpERE-TAL-luc 質(zhì)粒、8 μ Ip β gal-Control 質(zhì)粒；ER β 管中加 500 μ 1 無(wú)酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、8 μ lpCXN2-hER β 質(zhì)粒、8 μ lpERE-TAL-Iuc 質(zhì)粒、8 μ 1 β gal-Control 質(zhì)粒；脂質(zhì)體管中加入1000 μ 1無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)基和M μ 1脂質(zhì)體。(3)倒轉(zhuǎn)混勻脂質(zhì)體管，室溫放置5min，取500 μ 1分別加入ER α和ER β管，室溫放置20min ；(4)倒轉(zhuǎn)混勻ER α和ER β管，取80 μ IER α管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入M 孔板ER α實(shí)驗(yàn)孔，取80 μ IER β管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入M孔板ER β實(shí)驗(yàn)孔。前后搖勻，放入培養(yǎng)箱。(5) 6h后加入對(duì)照藥物和檢測(cè)藥物。5. 3. 3 ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)加藥后Mh的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用ImlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-GloR 穩(wěn)定熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)及閃亮裂解緩沖液(Glolysis Buffer)改良操作步驟操作，收集細(xì)胞裂解上清液，加入熒光素酶反應(yīng)底物 (熒光素)，置于暗處，用VeritasTM微板光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。5. 3.4 β-gal 活性檢測(cè)為了考察轉(zhuǎn)染效率，對(duì)內(nèi)參照β -gal活性進(jìn)行了檢測(cè)。(1)54μ 1β-巰基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ 1 ；(2)每管加20 μ 1裂解上清液；(3)每管加400 μ 1 0NPG，倒轉(zhuǎn)混勻；(4)放置37°C溫箱，至顯黃色；(5)力卩 Na2CO3Iml 終止反應(yīng)；(6)測(cè) OD42tl 值；二、統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以S ±s表示，SPSS 13. 0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way AN0VA)統(tǒng)計(jì)處理。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.石斛水提物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，石斛水提物在0. 0001,0. 001,0. 01,0. lmg/ml時(shí)與空白組比對(duì)MCF-7細(xì)胞均有顯著的促增殖作用(P < 0.05)，說(shuō)明石斛水提物在體外具有雌激素樣活性，見(jiàn)表1， 圖1。
表1石斛水提物對(duì)MCF-7增殖的影響(；±s，n=6)
權(quán)利要求
1. 一種石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，該石斛水提物是將石斛每次用其 10倍重量的水煎煮2次，每次池，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物。
全文摘要
本發(fā)明涉及石斛水提物在制備雌激素類藥物中的應(yīng)用，可有效解決制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病，從而用于解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病的用藥問(wèn)題，該石斛水提物是，將石斛每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到石斛水提物，該石斛水提物即為有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病的藥物，即石斛水提物在制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明水提物制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開(kāi)辟了石斛藥用新用途。
文檔編號(hào)A61P15/12GK102526500SQ20121006895
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 劉朝妍, 王小蘭, 蔣云, 鄭曉珂 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院