專利名稱：一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備禽用疫苗的病毒液的制備方法，尤其是一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法。
背景技術(shù)：
雞新城疫(ND)及雞傳染性支氣管炎(IB)目前仍然是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病，具有傳播迅速、危害大的特點(diǎn)，能引起急性高度接觸性疾病。在養(yǎng)禽業(yè)趨于集約化、工業(yè)化的高密度飼養(yǎng)方式之后，為了預(yù)防雞新城疫及雞傳染性支氣管炎的發(fā)生，對疫苗的要求也更高，這兩類疾病的防控已引起業(yè)內(nèi)極大的重視。新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，被國際獸醫(yī)局定為A類烈性傳染病。該病自1926年首次發(fā)現(xiàn)于印尼，同年發(fā)現(xiàn)與英國新城， 因此命名為新城疫。雞新城疫廣泛分布于世界上許多國家，禽類動物極易感染，其中以雞的感受性最強(qiáng)，能引起一種急性、發(fā)熱性的傳染病，發(fā)病率和死亡率都很高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。雞新城疫病毒是副粘病毒科副粘病毒屬中的一個(gè)具有代表性的種，對外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，病毒對低溫的抵抗力強(qiáng)，在4°C可存活數(shù)天，-20°C存活數(shù)周，_70°C時(shí)數(shù)年仍保存感染力。55°C作用45min和直射陽光下作用30min 才能使病毒滅活。在新城疫爆發(fā)后8周內(nèi)仍可從雞舍、羽毛、蛋巢分離出病毒。雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種高度接觸傳染的疾病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。雛雞發(fā)病后通常表現(xiàn)流鼻液、呼吸困難等呼吸道癥狀，甚至?xí)l(fā)生死亡；此外，該病還可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降和蛋白品質(zhì)下降。該病目前在世界大多數(shù)養(yǎng)雞地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，我國于1972年由鄺榮祿教授在廣東首先報(bào)道了該病的存在，現(xiàn)已蔓延至全國各地，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著禽類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，疾病的發(fā)生也日益趨向與復(fù)雜化。雞新城疫和雞傳染性支氣管炎在養(yǎng)雞生產(chǎn)中發(fā)病率較高，危害尤為嚴(yán)重。免疫接種是預(yù)防該病的重要措施， 但由于疫苗接種時(shí)母源抗體過高，或者疫苗質(zhì)量和保存不當(dāng)，免疫接種程序不合理等原因會造成雞群免疫狀態(tài)的差異，抵抗水平低的免疫雞群不能抵抗強(qiáng)毒的侵襲，引起疾病的傳播。禽用疫苗及預(yù)防技術(shù)的研究受到廣泛的關(guān)注，疫苗的免疫反應(yīng)，簡化的免疫程序、 簡單的制苗生產(chǎn)工藝、更低的疫苗生產(chǎn)及使用成本等問題成為關(guān)注的重點(diǎn)，禽用疫苗的制備工藝也在隨之不斷發(fā)展中。目前已有雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗，用于這兩種疾病的防控。在雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗制備過程中，須首先將兩種病毒在雞胚中增殖培養(yǎng)， 病毒效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求后，收獲得雞新城疫和雞傳染性支氣管炎的病毒液，即制苗用毒液， 之后進(jìn)行相應(yīng)的制劑手段制苗，獲得二聯(lián)疫苗。傳統(tǒng)的雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備工藝是將兩種毒種適當(dāng)稀釋后，分別接種雞胚，分別收獲雞胚液后按照一定比例混合，制劑，得到二聯(lián)疫苗。這樣病毒的繁殖效果達(dá)標(biāo)，但工藝復(fù)雜，原材料使用量大。目前，也有研究分別將NDV和IBV稀釋后混合，一次性同胚接種，經(jīng)過孵化、收獲雞胚液得到雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液。這種同胚增殖的技術(shù)，通過調(diào)整病毒的接種量及收毒時(shí)間，試圖使兩種病毒的增殖均達(dá)到最佳狀態(tài)。但是，由于雞傳染性支氣管炎病毒的生長會明顯抑制雞新城疫病毒的繁殖，同時(shí)， 繁殖過程中兩者之間存在相互干擾現(xiàn)象。在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中，同胚增殖如果是同時(shí)一步接種，必然會造成IBV和NDV的繁殖不理想，影響疫苗的質(zhì)量和免疫效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過一種將雞新城疫病毒與雞傳染性支氣管炎病毒先后分兩步接種同一雞胚的方法(簡稱“同胚雙毒兩步接種法”)，在制苗過程中選擇適當(dāng)?shù)慕臃N濃度和收獲時(shí)間，有效地減少IBV和NDV之間的干擾，使兩種病毒均能得到充分的增殖。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，包括以下步驟；(I)分別取雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種，用滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋；(2)取十日齡無特異抗體的雞胚，每胚接種雞新城疫毒種稀釋液O. lml，37°C孵育 24小時(shí)后，再向雞胚中接種雞傳染性支氣管炎毒種稀釋液O. 1ml，密封針孔；(3)繼續(xù)37°C孵育96小時(shí)。孵育過程中，60小時(shí)以前每24小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚棄去，60小時(shí)后每6小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，置于2-8°C冷藏保存，直至 96小時(shí)后，不論雞胚死亡與否，全部取出，置于2-8°C冷卻4-24小時(shí)，無菌收獲胎兒病變明顯的雞胚液，既得雞新城疫-傳染性支氣管炎病毒液。所述的雞新城疫毒種為La Sota株。所述的雞傳染性支氣管炎毒種為M41株。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過同胚雙毒兩步接種法，對兩種病毒進(jìn)行培養(yǎng)增殖，減少兩種病毒繁殖過程中的相互干擾，提高病毒的效價(jià)。(I)采用分別將NDV和IBV先后在雞胚10日齡和11日齡時(shí)兩次接種同一雞胚的制備工藝，能有效避免兩種病毒在接種和繁殖過程中的相互干擾制約，降低了培養(yǎng)過程中的雞胚的死淘率，提高雞胚的利用率，增加病毒繁殖數(shù)量，增大病毒效價(jià)，提高產(chǎn)品質(zhì)量；(2)兩種病毒向同一雞胚進(jìn)行接種，同時(shí)收獲兩種抗原，雞胚的用量減少一半，節(jié)約原材料，降低了生產(chǎn)成本，保證了質(zhì)量，同時(shí)簡化了工藝，減少勞動成本，節(jié)約工時(shí)，適用于大批量生產(chǎn)。(3)選擇收獲66-96小時(shí)死亡的雞胚和96小時(shí)后所有的雞胚，使NDV有足夠的時(shí)間增殖到最佳滴度，也不會因?yàn)榉跤龝r(shí)間過長而導(dǎo)致IBV毒力減弱。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明公開了一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，具體是將雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種稀釋后，采用同胚雙毒兩步接種方法，在雞胚10曰齡時(shí)接種接種雞新城疫毒種稀釋液，37°C孵育24小時(shí)，再于雞胚11日齡時(shí)，同胚接種雞傳染性支氣管炎毒種稀釋液。此后，37°C孵育，收取66-96小時(shí)死亡的雞胚，以及96小時(shí)后所有的雞胚，置于2-8°C冷卻4-24小時(shí)，無菌收獲兩種病毒均充分增殖的雞胚液，既得雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液。同胚雙毒兩步接種法可以減少IBV對NDV的相互干擾。對收獲的雞胚液(病毒液) 分別測定IB M41和ND La Sota病毒的效價(jià)，ND La Sota病毒效價(jià)1(T8_ 5EID5(I/U Iml以上， IB Μ41病毒效價(jià)達(dá)到10-6 3EID5Q/0. Iml以上，兩種病毒均能達(dá)到并超過國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。毒種的標(biāo)準(zhǔn)及保存方法同《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(以下簡稱“規(guī)程，，)在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，IBV對NDV的干擾作用受其接種順序及收毒時(shí)間影響，毒株不同干擾作用的強(qiáng)弱也有差異。通常IBV毒株的強(qiáng)度越弱、濃度越小對NDV的影響越小，反之越大。此外，同胚接種后，孵育時(shí)間的選擇也很重要。通常NDV的增長高峰為90-96小時(shí)，IBV的增長高峰為30小時(shí)左右，本發(fā)明的所述的同胚雙毒增殖方法，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證， 選擇收獲66-96小時(shí)死亡的雞胚和96小時(shí)后所有的雞胚，使NDV有足夠的時(shí)間增殖到最佳滴度，而不至于因?yàn)榉跤龝r(shí)間過長而導(dǎo)致IBV毒力減弱。本發(fā)明的實(shí)施例是為進(jìn)一步更好的說明本發(fā)明，不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實(shí)施例I兩種方法制備雞新城疫-雞傳染性支氣管炎的病毒液的對比I.同胚雙毒兩步接種試驗(yàn)方法I. I毒種稀釋將雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種用滅菌生理鹽水按照規(guī)程方法稀釋，得毒種稀釋液，其中，雞傳染性支氣管炎毒種(IB M41)作1(Γ3倍稀釋，雞新城疫毒種(ND La Sota)作10_4倍稀釋。I. 2 接種取十日齡SPF雞胚共2500枚，進(jìn)行平行試驗(yàn)5批，每批次注雞胚500枚。接種時(shí)每胚接種雞新城疫毒種稀釋液O. lml，37°C孵育24小時(shí)后，再向雞胚中接種雞傳染性支氣管炎毒種稀釋液O. 1ml，密封針孔，繼續(xù)37°C孵育。I. 3孵育和收獲經(jīng)接種過ND La Sota和IB M41的雞胚，37°C孵育96小時(shí)，60小時(shí)以前每24小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚棄去，60小時(shí)后每6小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，置于2-8°C 冷藏保存，直至96小時(shí)后，不論雞胚死亡與否，全部取出，置于2-8°C冷卻4-24小時(shí)，無菌收獲胎兒病變明顯的雞胚液。每批接種500枚雞胚，收獲雞胚液后合并為一批的病毒液。2.同胚雙毒一步接種試驗(yàn)方法進(jìn)行傳統(tǒng)的同胚雙毒一步注胚方法進(jìn)行培養(yǎng)，毒種稀釋、孵育和收獲方法同I. I、 I. 3，不同之處在于接種方法，接種前將NDV和IBV兩種毒種等體積比混合后，一次性接種 0.2ml于10日齡SPF雞胚中，進(jìn)行37°C孵育、收獲雞胚液。比較各種病毒的效價(jià)。進(jìn)行5 個(gè)批次的平行試驗(yàn)，每批接種500枚雞胚，收獲雞胚液后合并為一批的病毒液。
3.病毒含量的檢測3. I檢測方法3. I. I測定雞傳染性支氣管炎病毒效價(jià)取雞新城疫、雞傳染性支氣管炎的病毒液稀釋后，取Iml加入I號管中，繼續(xù)向I 號管加入等量的2倍稀釋的雞新城疫抗血清，室溫中中和I小時(shí)，中間震蕩一次，再向一號管中加入8ml生理鹽水，此時(shí)稀釋度為10_5，繼續(xù)10倍稀釋，取10_5，10_6，10^3個(gè)稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種SPF十日胚5個(gè)，每胚O. 1ml，于37°C觀察6日，根據(jù)接種后24_144h死胚及6日時(shí)存活的雞胚中出現(xiàn)失水、縮水、發(fā)育小(接種胎兒比對照最輕胎兒重量低2g以上) 等特異性病變胚的總和，計(jì)算EID5Q。3. I. 2測定雞新城疫病毒效價(jià)取新城疫、雞傳染性支氣管炎的病毒液稀釋至10_6，取Iml加入2號管中繼續(xù)向2 號管中加入等量的4倍稀釋的雞傳染性支氣管炎抗血清，室溫中中和I小時(shí)，中間震蕩一次，再向2號管中加入8ml生理鹽水，此時(shí)稀釋度為10_7，繼續(xù)10倍稀釋，取10' 10_8，10_93 個(gè)稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種SPFlO日雞胚5個(gè)，每胚O. lml，48h以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，隨時(shí)取出48-120小時(shí)死亡的雞胚，收獲雞胚液，同稀釋度等量混合，至120h取出活胚， 逐個(gè)收獲胚液，分別測定血凝價(jià)，I 160(1 128)以上判為感染，計(jì)算EID5Q。3. 2試驗(yàn)結(jié)果與分析3. 2. I試驗(yàn)數(shù)據(jù)同胚雙毒兩步接種方法培養(yǎng)，按照I. I、I. 2、I. 3的方法將雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種進(jìn)行稀釋，接種。依照3. I. 1,3. I. 2的方法對兩種病毒的含量進(jìn)行檢測，考察NDV和IBV的增殖情況。同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)的同胚雙毒一步注胚方法進(jìn)行培養(yǎng)，比較各種病毒的效價(jià)。按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》方法檢測胚液中NDV和IBV各自的效價(jià)EID5tl，最后取5批的EID5tl平均值。具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表I。表I :兩種不同接種方法培養(yǎng)的雞胚液中NDV和IBV的效價(jià)(EID5tl)
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟；(1)將雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種用滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋；(2)取十日齡無特異抗體的雞胚，每胚接種雞新城疫毒種稀釋液O.1ml，經(jīng)過37°C孵育 24小時(shí)后，再向雞胚中接種雞傳染性支氣管炎毒種稀釋液O. 1ml，密封針孔；(3)37°C孵育96小時(shí)，孵育過程中，60小時(shí)以前每24小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚棄去， 60小時(shí)后每6小時(shí)照胚一次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，置于2-8°C冷藏保存，直至96小時(shí)后， 不論雞胚死亡與否，全部取出，置于2-8°C冷卻4-24小時(shí)，無菌收獲胎兒病變明顯的雞胚液，既得雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，所述的雞新城疫毒種為La Sota株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雞新城疫傳染性支氣管炎毒種為M41株。-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，所述的雞
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液的制備方法，具體為，首先將雞新城疫毒種和雞傳染性支氣管炎毒種進(jìn)行稀釋；向雞胚中接種雞新城疫毒種稀釋液，孵育24小時(shí)后，再向同一雞胚中接種雞傳染性支氣管炎毒種稀釋液；經(jīng)過37℃孵育，收獲得雞新城疫-雞傳染性支氣管炎病毒液。本發(fā)明方法有效減少了兩種病毒在接種和繁殖過程中的相互干擾制約，降低了培養(yǎng)過程中的雞胚死淘率，增加病毒繁殖數(shù)量，同時(shí)簡化工藝，節(jié)約原材料，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號A61K39/17GK102580080SQ20121007101
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者劉建, 楊旭, 陳利紅, 黃娜 申請人:天津瑞普高科生物藥業(yè)有限公司