專利名稱：一種血腦屏障藥動學(xué)持續(xù)給藥系統(tǒng)及檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測系統(tǒng)領(lǐng)域，涉及一套實時檢測藥物透過血腦屏障的檢測系統(tǒng)，具體涉及一種血腦屏障藥動學(xué)持續(xù)給藥系統(tǒng)及檢測系統(tǒng)，尤其涉及一套在大鼠清醒狀態(tài)下的持續(xù)給藥裝置和持續(xù)抽取腦脊液進行HPLC分析以實時檢測血腦屏障的藥物動力學(xué)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元周圍微環(huán)境穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)，從而保證神經(jīng)元正常功能活動。根據(jù)形態(tài)的不同，腦屏障分三類血-腦屏障(BBB)、血-腦脊液屏障、腦脊液-腦屏障。其中，血腦屏障為三者中最重要的組成部分。血腦屏障起著限嚴格制外部物質(zhì)進入腦組織神經(jīng)系統(tǒng)并維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境穩(wěn)定的作用。藥物能否透過血腦屏障對研究藥物的體內(nèi)分布、藥物量效關(guān)系具有十分重要的意義，其透過程度也是藥物是否作用·于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的一個重要指標，因此，評價藥物是能否透過血腦屏障及透過程度成為藥物學(xué)研究中的一個重要課題，同時也是當前藥物學(xué)家所面臨的一個難題。目前，檢測藥物能否通過血腦屏障的方法主要有四大類動物活體法、離體腦組織法、建立體外血腦屏障模型、建立數(shù)學(xué)模型。具體實驗中可根據(jù)實驗動物的不同選擇適當?shù)臋z測方法。動物活體檢測法評價藥物通過血腦屏障狀況的方法主要分為四類第一，監(jiān)測腦脊液(CSF)。腦脊液-腦屏障可使CSF與細胞外液互相交通，現(xiàn)認為物質(zhì)一旦從血液進入CSF，便可自由擴散進入腦組織，監(jiān)測CSF是篩查能通過血腦屏障的藥物的重要手段，故多年來一直以CSF的變化來反映腦內(nèi)神經(jīng)元生存環(huán)境。第二，腦內(nèi)微透析法是一種在動物清醒狀態(tài)下連續(xù)灌注藥物并采集特定腦區(qū)灌流液的方法。由于此技術(shù)是經(jīng)半透膜收集標本的，標本基本上不含大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此標本可直接進行HPLC分析。該檢測方法的不足是其提取物僅是經(jīng)探針半透膜透析而來的局部細胞間液的小分子物質(zhì)，無法反映整個大腦內(nèi)的狀況；第三，藥物放射性標記法是一種利用放射影像學(xué)方法檢測藥物是否可通透血腦屏障的方法。如經(jīng)大鼠尾靜脈注射99Tc標記的磁性納米粒子，并將大鼠頭部置于磁場，然后通過單光子發(fā)射計算機斷層顯像儀進行觀察，檢測結(jié)果可以表明該載體系統(tǒng)能成功攜帶99Tc跨過正常大鼠血腦屏障到達腦部；第四，在活體動物進行藥代參數(shù)測定也可間接證明藥物透過血腦屏障的能力。活體動物的觀察監(jiān)測可充分利用機體整體調(diào)節(jié)機制，等同于藥物實際使用時的生理狀況。但該方法由于受限于時間、經(jīng)費、技術(shù)條件等，難以進行大規(guī)模藥物篩查，其對藥物過血腦屏障的生理、病理機制的觀察研究存在局限性。通過離體腦組織檢測評價藥物透過血腦屏障情況的方法有五種第一，單次頸動脈注射技術(shù)。動物頸動脈置管后，把溶有待檢藥物和已進行放射性標記的內(nèi)對照物的林格液快速推注入頸總動脈，斷頭，取腦，進行分析計算。此技術(shù)操作快，適于高通量篩查，但因?qū)嶒炛形磳嵭型獠縿用}結(jié)扎，目標化合物可擴散到全身，且由于時間限制，技術(shù)難度較大；第二，原位腦灌流技術(shù)。操作需結(jié)扎頸外動脈分支枕動脈、甲狀腺上動脈以及結(jié)扎頸內(nèi)動脈翼突腭動脈。經(jīng)頸外動脈輸藥，輸入時要夾閉頸總動脈，輸藥完畢后繼續(xù)輸入生理鹽水以灌洗。本技術(shù)敏感性高，可以準確研究PH值、離子、流速、蛋白質(zhì)量濃度等因素對物質(zhì)吸收入腦的影響。但此方法技術(shù)操作難度大，完成實驗所需動物數(shù)量多，實驗數(shù)據(jù)分析工作量大。第三，靜脈注射技術(shù)。該技術(shù)被譽為評價BBB通透性的“金標準”。大鼠或小鼠經(jīng)股靜脈或尾靜脈置管注入目標化合物及血漿體積標記物，經(jīng)股動脈置管于不同時間點取血。實驗畢，殺死動物，測腦內(nèi)化合物濃度。此操作被認為是最接近藥物在人體內(nèi)真實狀況的檢測技術(shù)。第四，放射自顯影技術(shù)。該技術(shù)是將放射性同位素標記化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，一定時間的放射性曝光處理，然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和濃度。但有該法存在一個缺陷，即無法分辨究竟是目標化合物還是其代謝產(chǎn)物的顯影。第五，高效液相色譜分析，該技術(shù)具有分離效率高，選擇性好，分析速度快，靈敏度高等特點，在物質(zhì)檢測分析中被廣泛運用。應(yīng)用體外血腦屏障模型(blood-brain barrier model, BBBM)檢測評價藥物通過BBB的方法近來腦血管碎段BBBM在實驗中應(yīng)用廣泛，也能長期保存且保留具有大量活體BBB特征(如緊密連接復(fù)合體、囊泡結(jié)構(gòu)、緊密連接轉(zhuǎn)運子、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、來普汀受體等)的被培養(yǎng)出來的離體BBBM。BBBM因其可在實驗中取代活體動物，省時省力，且避免了倫理學(xué)上的爭議，故在研究藥物通過BBB的動力學(xué)方面得到廣泛應(yīng)用。但其也有局限性，如培養(yǎng)·
評價藥物通過血腦屏障及通過程度是非常困難的，現(xiàn)有的檢測手段都有其優(yōu)勢和劣勢，而不同的藥物也往往呈現(xiàn)出不同的藥物分布，因此，現(xiàn)有的檢測手段中沒有哪種方法可以適用于所有的藥物分布評價，因而研發(fā)一種適用面廣、效率高、操作簡便的通過血腦屏障的技術(shù)方式成為目前醫(yī)藥研發(fā)過程中所亟需的，這對于藥物開發(fā)特別是腦疾病治療藥物的開發(fā)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述一系列的血腦屏障藥物動力學(xué)檢測技術(shù)的局限性，本發(fā)明提供了一種血腦屏障藥動學(xué)持續(xù)給藥系統(tǒng)及檢測系統(tǒng)，尤其涉及一種在動物清醒狀態(tài)下的持續(xù)給藥裝置以及持續(xù)抽取腦脊液進行HPLC分析的實時檢測血腦屏障藥物動力學(xué)的系統(tǒng)，通過建立經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)模型和清醒狀態(tài)下腦脊液持續(xù)抽取系統(tǒng)以及使用HPLC作腦脊液檢測，達到建立一種檢測藥物能否通過血腦屏障以及通過程度的測定方法。本發(fā)明所提供的檢測血腦屏障藥物動力學(xué)的系統(tǒng)操作簡單，檢測準確性高，避免了持續(xù)給藥給動物造成的痛苦，其應(yīng)用對動物實驗科學(xué)具有十分重要的意義。本發(fā)明的一種動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)包括經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)、實驗動物清醒狀態(tài)下腦脊液持續(xù)抽取系統(tǒng)和HPLC腦脊液檢測系統(tǒng)。本發(fā)明的第一個方面是提供了一種結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便且成本低廉的經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)。本發(fā)明建立的經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)，包括給藥部分、連接部分。其中給藥部分包括肝素帽、螺絲、硬性導(dǎo)管、注射內(nèi)管、螺帽。肝素帽，連接于硬性導(dǎo)管豎直部末端，防止漏液和氣栓。螺絲，上端可與肝素帽旋緊，防止漏液；下端可與螺帽旋緊，從而固定注射內(nèi)管和硬導(dǎo)管連接。硬性導(dǎo)管，呈L形彎折狀，分豎直部和水平部，豎直部上部外面套有螺絲，可與導(dǎo)管帽和螺帽鎖緊，硬性導(dǎo)管的外徑優(yōu)選為O. 56mm±0. IOmm ;注射內(nèi)管，后連接PE軟管，前端插入硬性導(dǎo)管內(nèi)，用于注射藥物；螺帽位于螺絲外側(cè)，用于鎖緊注射內(nèi)管和硬性導(dǎo)管；連接部分由PE軟管組成，PE軟管的一端與前述的硬性導(dǎo)管的水平部連接，另一端為自由端；PE軟管的規(guī)格可以根據(jù)具體血管管腔的內(nèi)徑進行調(diào)整，優(yōu)選為外徑O. 85mm,內(nèi)徑O. 42mm的PE軟管；PE軟管的長度也可根據(jù)具體情況進行確定,優(yōu)選為3cm_10cm。上述經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)的還可以包括墊片、粘結(jié)塊、Epon、止血夾和線結(jié)，其中墊片位于硬性導(dǎo)管轉(zhuǎn)彎處垂直于硬性導(dǎo)管的豎直部放置，可以起到固定和防止靜脈給藥時藥液溢出的作用；所述粘結(jié)塊由AB膠制成，位于硬性導(dǎo)管和墊片之間，作用是將前述的硬性導(dǎo)管粘結(jié)于墊片的端面上，而前述的豎直部則垂直墊片設(shè)置；所述Epon(環(huán)氧樹脂)是由AB膠水繞軟管自由端做成的球狀物，便于固定；止血夾，用于靜脈給藥時夾緊血管，防止血液上行溢出；線結(jié)主要用于PE軟管植入血管后，打結(jié)捆綁固定PE軟管和血管。上述經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)的工作原理為體內(nèi)結(jié)扎一側(cè)頸靜脈遠心端后，在近心端插入PE軟管并結(jié)扎牢固，建立頸靜脈插管模型；體外在大鼠頭頂埋植肝素帽給藥端·口，端口與之前的PE軟管插管接合(PE軟管穿過皮下)，從而實現(xiàn)從體外至頸靜脈的長期多次給藥。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種利用上述持續(xù)給藥裝置的動物給藥方法，它包括如下步驟(I)麻醉用適當藥物麻醉實驗動物，取其仰臥位固定，手術(shù)暴露實驗動物的頸靜脈；(2)頸靜脈插管模型制作顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管；(3)系統(tǒng)測試及給藥實驗動物頸部固定安裝經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合后即可給予待測藥物。本發(fā)明的第二個方面是提供一種清醒狀態(tài)下腦脊液的持續(xù)抽取裝置及其方法，該腦脊液持續(xù)抽取裝置使用玻璃電極作為針頭，刺破實驗動物的寰枕筋膜，可實現(xiàn)實驗動物清醒狀態(tài)下于小腦延髓池持續(xù)抽取腦脊液。本發(fā)明所建立的腦脊液持續(xù)抽取裝置由圖釘式插管、連接部分和固定部分三個組成部分；其中圖釘式插管由細玻璃針頭、PE軟管、醫(yī)用透明敷料及502膠組成；PE軟管前端插入細玻璃針頭內(nèi)，并用502膠水固定；醫(yī)用透明敷料位于圖釘式插管的前端，其與圖釘式插管的相對位置可以控制圖釘式插管進入寰枕筋膜的深度；插管和醫(yī)用透明敷料之間也用502粘好，穩(wěn)固而富有彈性，可沿寰枕筋膜貼穩(wěn)。其中連接部分主要有PE軟管和單向瓣膜組成。PE軟管主要起連接作用，PE軟管的前端與細玻璃針頭相連，后端延續(xù)，其后端延續(xù)部分可以外接微量進樣器，微量進樣器拉伸可形成真空抽取腦脊液。單向瓣膜主要是起到單向開關(guān)作用，微量進樣器針頭插入時開啟，拔出時關(guān)閉，防止腦脊液抽取時腦脊液的回流。單向瓣膜的存在可以實現(xiàn)隨時抽取腦脊液，又可避免腦脊液漏出。其中固定部分包括粘結(jié)塊和基板組成，其中粘結(jié)塊為組織膠遇組織液形成的凝固塊，可以固定PE軟管并使復(fù)合體直立于基板上面。上述持續(xù)抽取腦脊液裝置中，所用材料均可根據(jù)實驗需要選用，當抽取大鼠腦脊液時，所用的耗材及規(guī)格優(yōu)選為所述細玻璃管優(yōu)選為細玻璃電極尖端，極細、斜坡狀，故其在寰枕筋膜上的開口極小且極少漏液。細玻璃針頭長度為4-5mm ；PE軟管優(yōu)選為由單體乙烯聚合形成PE樹脂組成，其管外徑優(yōu)選為O. 85mm、內(nèi)徑優(yōu)選為O. 42mm ;所述醫(yī)用透氣敷料的孔間間隙;所述粘結(jié)塊為聚乙烯材質(zhì),底面直徑O. 85cm,高I. 15cm ;所述基板的材質(zhì)同粘結(jié)塊，O. 95cm*2. 15cm ;所述單向瓣的材質(zhì)同粘結(jié)塊，由單體乙烯聚合而成，管外徑
I.OOmm.內(nèi)徑 O. 60mm。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種利用上述持續(xù)抽取腦脊液裝置抽取動物腦脊液的方法，其特征在于包括如下步驟 (I)麻醉用適當藥物麻醉實驗動物，取其仰臥位固定，確定好小腦延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，用蒸餾水沖洗創(chuàng)面，無菌棉球擦凈；(2)固定及測試將圖釘式插管按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定，用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功；(3)定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液。上述腦脊液持續(xù)抽取裝置抽取實驗動物腦脊液的方法中，實驗操作在顯微直視下操作，成功率較高。本發(fā)明所述持續(xù)抽取腦脊液裝置，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下意想不到的技術(shù)優(yōu)勢a)本發(fā)明所述持續(xù)抽取腦脊液裝置在大鼠清醒狀態(tài)下抽去腦脊液，且抽去的量較微透析多，亦不局限于局部細胞間液的小分子物質(zhì)，可反映整個大腦內(nèi)的狀況。b)本發(fā)明持續(xù)抽取腦脊液裝置結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉、制作簡單、封閉性良好，可普及使用。且利用本發(fā)明持續(xù)抽取腦脊液裝置可在清醒狀態(tài)下隨時隨量抽去動物腦脊液分析，更大程度地保證藥物通過血腦屏障結(jié)果的真實性和準確性c)本發(fā)明持續(xù)抽取腦脊液裝置所用的組織膠是一種組織粘合劑，由單體η-丁基-2-丙烯酸氰構(gòu)成，該物質(zhì)粘合強度高，在接觸組織液后會迅速發(fā)生聚合反應(yīng)。實驗過程中無需縫拆線，無需使用局麻藥物；對實驗動物的局部損傷少，從而可以有效防止細菌感染，粘合層防水、防污染；無毒。另外PE軟管及開關(guān)為硅橡膠材質(zhì)。上述材料均能夠最大限度的減少感染，并保證最終結(jié)果測定的準確性。d)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點還在于本發(fā)明持續(xù)抽取腦脊液裝置可在大鼠清醒狀態(tài)下取腦脊液。抽取裝置結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)制造方便，材料易得，制造成本較低，便于推廣使用，符合國際上遵循的“ 3R”原則。本發(fā)明的第三個方面是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種HPLC腦脊液檢測系統(tǒng)，主要對持續(xù)抽取實驗動物的腦脊液進行HPLC分析，即利用已經(jīng)熟練掌握的抽取腦脊液方法多次抽取非血性腦脊液并運用高效液相色譜法以檢測腦脊液中是否含有帶篩選的藥物及其含量濃度，以評價該藥物透過血腦屏障的的具體情況。一種利用HPLC腦脊液檢測系統(tǒng)檢測腦脊液中藥物含量的方法，其包括以下步驟a)腦脊液取樣每隔一段時間利用所述持續(xù)抽取腦脊液裝置系統(tǒng)抽取一定體積動物腦脊液。進一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一般每隔5分鐘抽取一次腦脊液可以滿足反映藥物在腦脊液中的含量情況。b)腦脊液處理腦脊液中含有大量其他物質(zhì)如大分子蛋白，會影響高效液相對藥物檢測的準度。因此在腦脊液處理過程中，將抽取得到的腦脊液用高速冷凍離心機離心除去大分子蛋白。c)高效液相檢測利用高效液相常規(guī)手段檢測藥物在腦脊液中的濃度，并結(jié)合給藥情況對檢測結(jié)果分析，得出結(jié)論。本發(fā)明還提供了一種利用上述所述動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)測定藥物通過血腦屏障的方法，其主要包括如下步驟a)將實驗動物用合適藥物麻醉后，安裝經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥持續(xù)給藥裝置，給予待測藥物；b)安裝經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥裝置后，能實現(xiàn)在有效時間跨度內(nèi)多次經(jīng)頸靜脈給予待測藥物；·c)給藥一定時間后，在實驗動物上安裝腦脊液持續(xù)抽取裝置，在清醒狀態(tài)下按一定頻次于實驗動物小腦延髓池抽取腦脊液；d)將腦脊液冷凍離心除去大蛋白，利用高效液相色譜檢測腦脊液中藥物濃度。上述測定藥物通過血腦屏障的方法，可以適用于常見的實驗動物，如大鼠、小鼠、貓、犬、兔、鴨、豬、猴等，優(yōu)選適用于以大鼠為造模動物測定藥物通過血腦屏障的情形。上述所述動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)測定藥物通過血腦屏障的方法，其最佳的實施方式如下所述a)實驗動物麻醉用適當藥物麻醉實驗動物,取其仰臥位固定；b)頸靜脈插管模型制作手術(shù)暴露實驗動物的頸靜脈，顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管；c)經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)固定、測試及給藥實驗動物頸部固定系統(tǒng)，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合后即可給予待測藥物。d)持續(xù)腦脊液抽取系統(tǒng)固定及測試確定好小腦延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，將圖釘式插管按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定，用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功。e)腦脊液抽取及處理定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液，高速冷凍離心機離心除去大分子蛋白后待測。f)腦脊液中藥物檢測利用高效液相色譜法確定腦脊液中待測藥物的有無及含量。本發(fā)明所述的動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)相比，至少取得了如下突出預(yù)想不到的技術(shù)效果I.實驗動物特別是大鼠或小鼠的靜脈注射難度大，且持續(xù)給藥給實驗動物帶來諸多痛苦，本發(fā)明通過采用頸靜脈插管技術(shù)解決了實驗動物的持續(xù)給藥的難題，且操作簡單；
2.本發(fā)明對常規(guī)靜脈插管技術(shù)的改進，解決了由于實驗動物自身活動時易導(dǎo)致插管脫落的問題；3.手術(shù)技術(shù)的改進，使得實驗動物頸靜脈插管模型存活率大大提高；4.本發(fā)明使用玻璃電極作為針頭抽取腦脊液，并用醫(yī)用敷料控制針頭進入深度，有效的解決了因進針過深導(dǎo)致實驗動物死亡的問題；5.本發(fā)明使用玻璃電極因其針頭細，解決了因重復(fù)抽取導(dǎo)致寰枕筋膜破裂的問題；6.本發(fā)明檢測系統(tǒng)使用時均在顯微鏡下操作，解決了抽取的腦脊液帶血的問題，從而提高了藥物通過血腦屏障檢測結(jié)果的準確性和可靠性。


圖I為經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)示意圖；圖2持續(xù)抽取腦脊液裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖3持續(xù)抽取腦脊液裝置固定部分的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4持續(xù)抽取腦脊液裝置插管結(jié)構(gòu)示意圖；圖5持續(xù)抽取腦脊液裝置開關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖；圖6大鼠插入寰枕筋膜仿真圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，實施例并不以任何方式限制本發(fā)明，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上所做的等同替代均在本發(fā)明要求保護的范圍之內(nèi)。實施例I本發(fā)明所示血腦屏障動力學(xué)檢測系統(tǒng)圖I到6示出了本發(fā)明清醒狀態(tài)下血腦屏障動力學(xué)檢測系統(tǒng)的一種最佳的優(yōu)選方式。如圖I所示，本發(fā)明所建立的一種實驗動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥動學(xué)持續(xù)給藥系統(tǒng)，包括給藥部分、連接部分和固定部分。其中給藥部分包括肝素帽I、螺絲2、硬性導(dǎo)管
3、注射內(nèi)管5、螺帽6。肝素帽1，連接于硬性導(dǎo)管豎直部末端，能夠防止漏液和氣栓。螺絲2，上端可與肝素帽I旋緊，下端可與螺帽6旋緊，從而固定注射內(nèi)管和硬導(dǎo)管連接。硬性導(dǎo)管3，呈L形彎折狀，分豎直部和水平部，豎直部上部外套有螺絲2，可與肝素帽I和螺帽6鎖緊，硬性導(dǎo)管3的外徑優(yōu)選為O. 56mm±0. IOmm ;注射內(nèi)管5，后接PE軟管，前端插入硬性導(dǎo)管內(nèi)，用于注射藥物；螺帽6，用于鎖緊注射內(nèi)管和硬性導(dǎo)管；連接部分由PE軟管7組成，PE軟管7的一端與前述硬性導(dǎo)管3的水平部連接，另一端為自由端；在給藥時，自由端可以插入到動物的血管中。上述PE軟管7的規(guī)格可以根據(jù)具體血管管腔的內(nèi)徑進行調(diào)整，優(yōu)選為外徑O. 85mm,內(nèi)徑O. 42mm的PE軟管；PE軟管的長度也可根據(jù)具體情況進行確定，優(yōu)選為3cm-10cm。上述經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)的還可以包括墊片4、粘結(jié)塊、Epon 8、止血夾9和線結(jié)10，其中墊片4位于硬性導(dǎo)管轉(zhuǎn)彎處垂直于硬性導(dǎo)管的豎直部放置，可以起到固定和防止靜脈給藥時藥液溢出的作用；所述粘結(jié)塊由AB膠制成，位于硬性導(dǎo)管和墊片之間，作用是將前述的硬性導(dǎo)管粘結(jié)于墊片的端面上，而前述的豎直部則垂直墊片設(shè)置；所述Epon8 (環(huán)氧樹脂)是由AB膠水繞軟管自由端做成的球狀物，便于固定；止血夾9，用于靜脈給藥時夾緊血管，防止血液上行溢出；線結(jié)10主要用于PE軟管植入血管后，打結(jié)捆綁固定PE軟
管和血管。上述給藥系統(tǒng)的工作原理為給藥前將PE軟管最前端拉長，在約2_3mm處用AB膠做好Epon。用止血夾9在體內(nèi)結(jié)扎一側(cè)頸靜脈遠心端后,在近心端插入PE管7的自由端，并通過線結(jié)10結(jié)扎牢固。體外在大鼠頭頂埋植肝素帽給藥端口，其中體內(nèi)端一緊接體內(nèi)部分的PE管(即7，穿過皮下)，從而實驗按照一定的注射速率在體外給藥至頸靜脈。附圖2到附圖5示出了動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)腦脊液持續(xù)抽取裝置部分，其中如圖2所示，所述的腦脊液持續(xù)抽取裝置由圖釘式插管、連接部分和固定部分三個組成部分；其中，如圖4持續(xù)抽取腦脊液裝置插管結(jié)構(gòu)示意圖所示，圖釘式插管由細玻璃針·頭5、PE軟管8、醫(yī)用透明敷料6及502膠4組成；PE軟管8前端插入細玻璃針頭內(nèi)，并用502膠水固定；醫(yī)用透明敷料位于圖釘式插管的前端，其與圖釘式插管的相對位置可以控制圖釘式插管進入寰枕筋膜的深度；插管和醫(yī)用透明敷料之間也用502粘好，穩(wěn)固而富有彈性，可沿寰枕筋膜貼穩(wěn)。組織膠遇組織液立即凝固，且粘性好進一步加強了插管的穩(wěn)固性。為進一步保證末端牽拉時插管不移動，我們用敷料和組織液將軟管沿著枕骨一直往上貼。其中連接部分主要有PE軟管I和單向瓣膜3組成。PE軟管主要起連接作用，PE軟管的前端與細玻璃針頭相連，后端延續(xù)，其后端延續(xù)部分可以外接微量進樣器，微量進樣器拉伸可形成真空抽取腦脊液。單向瓣膜主要是起到單向開關(guān)作用，微量進樣器針頭插入時開啟，拔出時關(guān)閉，防止腦脊液抽取時腦脊液的回流。單向瓣膜的存在可以實現(xiàn)隨時抽取腦脊液，又可避免腦脊液漏出。其中固定部分包括粘結(jié)塊9和基板7組成，其中粘結(jié)塊為組織膠遇組織液形成的凝固塊，可以固定PE軟管并使復(fù)合體直立于基板7上面。本發(fā)明圖3示出了持續(xù)抽取腦脊液裝置固定部分的結(jié)構(gòu)示意圖，其中單向瓣膜3位于PE軟管2中，主要是起到單向開關(guān)作用，微量進樣器針頭插入時開啟，拔出時關(guān)閉，防止腦脊液抽取時腦脊液的回流，PE軟管2的外側(cè)由502膠包裹形成復(fù)合體，該復(fù)合體與基板附圖I中基板7相連，便于抽取裝置的固定。本發(fā)明附圖6所示為大鼠插入寰枕筋膜仿真圖，該仿真圖示出了腦脊液持續(xù)抽取裝置的固定部位，其中圖釘式插管的細玻璃針頭I穿破筋膜，醫(yī)用透明敷料2粘在筋膜上固定，其與圖釘式插管的相對位置可以控制圖釘式插管的進入深度。將PE軟管4沿著枕骨貼好，用組織膠水3將圖釘式插管進一步固定好。本發(fā)明所建立的HPLC腦脊液檢測系統(tǒng)為本領(lǐng)域的常用手段，在此不做贅述。一種利用上述實驗動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥動學(xué)測定系統(tǒng)測定藥物通過血腦屏障的方法，其包含以下步驟a)實驗動物麻醉用適當藥物麻醉實驗動物,取其仰臥位固定；b)頸靜脈插管模型制作手術(shù)暴露實驗動物的頸靜脈，顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管；c)經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)固定、測試及給藥實驗動物頸部固定系統(tǒng)，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合后即可給予待測藥物。d)持續(xù)腦脊液抽取系統(tǒng)固定及測試確定好小腦延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，將圖釘式插管按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定，用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功。e)腦脊液抽取及處理定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液，高速冷凍離心機離心除去大分子蛋白后待測。f)腦脊液中藥物檢測利用高效液相色譜法確定腦脊液中待測藥物的有無及含
量?！嵤├帽景l(fā)明所示檢測系統(tǒng)研究肝素通過大鼠血腦屏障情況I、利用經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)給藥①10%水合氯醒O. 3ml/100g烏拉坦(I. 2g/kg)麻醉大鼠,取仰臥位固定；用金霉素眼藥膏封眼，在門牙一右腋窩與右耳前一左腋窩連線的交點區(qū)域劃定第一手術(shù)區(qū)域并進行第一次備皮，在第一手術(shù)區(qū)域消毒，鋪設(shè)帶孔的手術(shù)巾，在第一手術(shù)區(qū)域切成縱向皮膚切口，約1-1. 5cm，切割皮下深淺筋膜，進行及時止血處理，沿肌間隙順纖維方向鈍性分離皮下組織及肌肉組織，顯露并游離右頸靜脈，在其下方穿線結(jié)扎備用；②顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管,插管總長度約為3. 5-4. 5cm ；③在大鼠兩耳朵連線前約Icm的頭骨平臺上開約O. 8-1. 5cm的開口，顯微止血鉗夾持插管的另一端，從頸部皮下開始繞過耳后到達頭部開口處，將其與已充滿肝素的頭部部件相連，將頭部部件埋于頭皮下，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合，在縫合處涂抹金霉素眼藥膏。將預(yù)先配置好的肝素溶液(肝素濃度為20%，IOOmg肝素溶于O. 9%生理鹽水400mL中)經(jīng)上述經(jīng)頸靜脈給藥系統(tǒng)給藥，給藥完畢后20min開始抽取腦脊液。2、利用本發(fā)明持續(xù)抽取腦脊液裝置抽取大鼠腦脊液①腹腔注射O. 3ml/100g的10%水合氯醛麻醉大鼠。用手確定好小腦延髓池大致位置，外科剪剪去表面毛發(fā)。利用腦立體定位耳桿、門齒桿固定大鼠頭部。沿后正中線小腦延髓池體表投影切一縱行切口(約I. 5-2. 5cm)，在顯微操作下用止血鉗和鑷子鈍性分離后頸部肌肉、組織。最深層附著在枕骨L的肌肉用手術(shù)刀背刮開，以避免出血，暴露寰枕筋膜后，用蒸餾水沖洗創(chuàng)面，無菌棉球擦凈。②將圖釘式插管通過軟管與單向開關(guān)連接，外科膠涂抹圖釘四周，顯微鏡直視下，將圖釘按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定插管。用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功。將軟管沿枕骨貼緊固定，縫合肌肉和開口，開關(guān)半埋與皮下。給大鼠注射青霉素。③定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液20ul。時間梯度優(yōu)選為每5分鐘抽取一次腦脊液，共抽取5次或更多次數(shù)。
3、高效液相色譜檢測腦脊液中藥物濃度3. I腦脊液前處理用微量進樣槍通過本發(fā)明中的持續(xù)抽取腦脊液裝置取腦脊液20微升，加O. 4mol/L過氯酸$04)180微升，混勻，371，120001'1^11離心lOmin。取上清液20微升稀釋至500微升。3. 2高效液相色譜檢測腦脊液中藥物濃度實驗步驟I)適合于物質(zhì)A的HPLC流動相體系采用ODS柱，以乙腈/水為流動相系統(tǒng)。通過調(diào)節(jié)磷酸鹽/乙腈洗脫體系的PH值，使目標寡肽與腦脊液以及血漿中的干擾性組分分離，觀察目標峰是否出現(xiàn)。 2)A物質(zhì)在組織液中的穩(wěn)定性根據(jù)物質(zhì)A出峰時間以及pH體系，取5個不同時間樣本I號、2號、3號、4號、5號,按設(shè)定的時間間隔取10微升樣品溶液注入HPLC分析討論自給藥后20min起，每隔5min取一次腦脊液樣品，腦脊液樣品處理后進入高效液相色譜測定，檢測結(jié)果顯示，給藥20min-45min中內(nèi)腦脊液中未發(fā)現(xiàn)肝素的存在，提示肝素在20min-45min不能通過血腦屏障。實施例三利用本發(fā)明所示檢測系統(tǒng)研究玉米低聚肽、小麥低聚肽通過大鼠血腦屏障情況實驗操作步驟及模型制作同實施例一，不同的是給藥為玉米低聚肽、小麥低聚肽，配成O. Olmg/ml溶液,每只鼠注射O. 5ml,結(jié)果顯示,給藥20min后,腦脊液中顯示有玉米低聚肽、小麥低聚肽存在，且在20min-45min內(nèi)，玉米低聚肽、小麥低聚肽在40min時腦脊液中藥物濃度最高，提示該藥物易通過血腦屏障。
權(quán)利要求
1.一種動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)，其特征在于，它包括經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)、實驗動物清醒狀態(tài)下腦脊液持續(xù)抽取系統(tǒng)和HPLC腦脊液檢測系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求I所述的動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述的經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)包括給藥部分、連接部分； 其中給藥部分包括肝素帽、螺絲、硬性導(dǎo)管、注射內(nèi)管、螺帽；肝素帽，連接于硬性導(dǎo)管豎直部末端，防止漏液和氣栓；螺絲，上端可與肝素帽旋緊，防止漏液；下端可與螺帽旋緊，從而固定注射內(nèi)管和硬導(dǎo)管連接；硬性導(dǎo)管，呈L形彎折狀，分豎直部和水平部，豎直部上部外面套有螺絲，可與導(dǎo)管帽和螺帽鎖緊，硬性導(dǎo)管的外徑優(yōu)選為0. 56mm±0. IOmm ;注射內(nèi)管，后連接PE軟管，前端插入硬性導(dǎo)管內(nèi)，用于注射藥物；螺帽位于螺絲外側(cè)，用于鎖緊注射內(nèi)管和硬性導(dǎo)管； 其中連接部分由PE軟管組成，PE軟管的一端與前述的硬性導(dǎo)管的水平部連接，另一端為自由端。
3.如權(quán)利要求2所述的動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述的經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)還可以包括墊片、粘結(jié)塊、Epon、止血夾和線結(jié)；其中墊片位于硬性導(dǎo)管轉(zhuǎn)彎處垂直于硬性導(dǎo)管的豎直部放置；所述粘結(jié)塊由AB膠制成，位于硬性導(dǎo)管和墊片之間，而前述的豎直部則垂直墊片設(shè)置；所述Epon(環(huán)氧樹脂)是由AB膠水繞軟管自由端做成的球狀物，便于固定；止血夾，用于靜脈給藥時夾緊血管；線結(jié)主要用于PE軟管植入血管后，打結(jié)捆綁固定PE軟管和血管。
4.一種利用權(quán)利要求2所述的持續(xù)給藥裝置的給藥方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)麻醉用適當藥物麻醉實驗動物，取其仰臥位固定，手術(shù)暴露實驗動物的頸靜脈； (2)頸靜脈插管模型制作顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管； (3)系統(tǒng)測試及給藥實驗動物頸部固定經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合后即可給予待測藥物。
5.如權(quán)利要求I所述的動物清醒狀態(tài)下血腦屏障藥物動力學(xué)檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述實驗動物清醒狀態(tài)下腦脊液的持續(xù)抽取裝置由圖釘式插管、連接部分和固定部分組成； 其中圖釘式插管由細玻璃針頭、PE軟管、醫(yī)用透明敷料及502膠組成；PE軟管前端插入細玻璃針頭內(nèi)，并用502膠水固定；醫(yī)用透明敷料位于圖釘式插管的前端，其于圖釘式插管的相對位置可以控制圖釘式插管；前端可插入并固定于寰枕筋膜上，其可通過醫(yī)用透明敷料控制； 其中連接部分主要有PE軟管和單向瓣膜組成；PE軟管主要起連接作用，單向瓣膜主要是起到單向開關(guān)作用，微量進樣器針頭插入時開啟，拔出時關(guān)閉，防止腦脊液抽取時腦脊液的回流；單向瓣膜的存在可以實現(xiàn)隨時抽取腦脊液，又可避免腦脊液漏出； 其中固定部分包括粘結(jié)塊和基板組成，其中粘結(jié)塊為組織膠遇組織液形成的凝固塊，主要起到固定PE軟管并使復(fù)合體直立于基板上面。
6.一種利用權(quán)利要求5所述的持續(xù)抽取腦脊液裝置抽取動物腦脊液的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)麻醉用適當藥物麻醉實驗動物，取其仰臥位固定，確定好小腦延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，用蒸餾水沖洗創(chuàng)面，無菌棉球擦凈； (2)固定及測試將圖釘式插管按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定，用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功； (3)定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液。
7.一種利用權(quán)利要求1、2或4所述的檢測系統(tǒng)測定藥物通過血腦屏障的方法，其特征在于，它主要包括如下步驟 (1)將實驗動物用合適藥物麻醉后，安裝經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥持續(xù)給藥裝置，給予待測藥物； (2)安裝經(jīng)頸靜脈持續(xù)給藥裝置后，能實現(xiàn)在有效時間跨度內(nèi)多次經(jīng)頸靜脈給予待測藥物； (3)給藥一定時間后，在實驗動物上安裝腦脊液持續(xù)抽取裝置，在清醒狀態(tài)下按一定頻次于實驗動物小腦延髓池抽取腦脊液； (4)將腦脊液冷凍離心除去大蛋白，利用高效液相色譜檢測腦脊液中藥物濃度。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)實驗動物麻醉用適當藥物麻醉實驗動物，取其仰臥位固定； (2)頸靜脈插管模型制作手術(shù)暴露實驗動物的頸靜脈，顯微止血夾夾住右頸靜脈近心端，待血管充盈時，遠心端結(jié)扎，顯微鑷提著頸靜脈遠心端，顯微剪在頸靜脈上方斜朝向心端開口，充滿肝素的插管插入頸靜脈至Epon處，在Epon的兩端分別結(jié)扎后互相結(jié)扎固定頸靜脈插管； (3)經(jīng)靜脈持續(xù)給藥系統(tǒng)固定、測試及給藥實驗動物頸部固定系統(tǒng)，緩慢推動與給藥端連接的注射器，判斷插管是否通暢，若通暢，進行頸部與頭部的縫合后即可給予待測藥物； (4)持續(xù)腦脊液抽取系統(tǒng)固定及測試確定好小腦延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，將圖釘式插管按壓在硬腦膜上，組織膠涂抹固定，用微量進樣器抽取少量腦脊液以檢測插管是否成功； (5)腦脊液抽取及處理定期用微量進樣槍緩慢抽取腦脊液，高速冷凍離心機離心除去大分子蛋白后待測； (6)腦脊液中藥物檢測利用高效液相色譜法確定腦脊液中待測藥物的有無及含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種一套實時檢測藥物透過血腦屏障的檢測系統(tǒng)，具體公開了一套在實驗動物清醒狀態(tài)下的持續(xù)給藥裝置和持續(xù)抽取腦脊液進行HPLC分析以實時檢測血腦屏障的藥物動力學(xué)系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)克服了現(xiàn)有監(jiān)測手段的不足，且操作簡單，靈敏度高，有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
文檔編號A61B10/00GK102784012SQ20121007212
公開日2012年11月21日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者余照亮, 徐曄, 鄧盛文, 邱佳和, 邱帥, 陳佛平, 顧懷宇 申請人:中山大學(xué)