專利名稱：一種制造用于治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大或腎功能疾病的類茄紅素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大或腎功能疾病的類茄紅素組合物。
背景技術(shù)：
西紅柿紅素(Lycopene),簡稱爺紅素,是類胡蘿卜素的一種。作為一種天然色素存在于自然界中，呈紅色，因最早發(fā)現(xiàn)于西紅柿中而得名。在西紅柿由綠轉(zhuǎn)紅時(shí)其含量增加，西紅柿愈紅，茄紅素的含量愈多。一般營養(yǎng)素易受熱而破壞，但是茄紅素在食物中相當(dāng)穩(wěn)定，不會(huì)因烹調(diào)而流失，反而是經(jīng)過加熱加工后，人體吸收率會(huì)更好，因?yàn)榍鸭t素屬于脂溶性，在和油脂一起烹調(diào)之下成份會(huì)溶入脂肪中，較易被人體所吸收而增加利用率。攝護(hù)腺又稱前列腺，影響攝護(hù)腺肥大的因素有很多，攝護(hù)腺會(huì)隨著年齡的增加而增大。前列腺過大會(huì)壓迫尿道，影響正常排尿并危及腎臟。腎臟將受壓迫力損害及被尿里的 細(xì)菌感染。當(dāng)腎臟充斥著這些細(xì)菌，很可能發(fā)生腎臟炎。前列腺炎也可能引起膀胱炎。攝護(hù)腺肥大是一種擾人的病變，40歲以上的男性幾乎都有這項(xiàng)困擾，80歲以上飽受攝護(hù)腺肥大之苦者，更高達(dá)九成以上，其癥狀包括有頻尿、排尿困難、尿流減弱和排尿不凈等。傳統(tǒng)治療攝護(hù)腺肥大的藥物，多是采用甲型交感神經(jīng)阻斷劑，不過易出現(xiàn)副作用，約有一至二成的患者，在服用后會(huì)出現(xiàn)血壓低、頭暈等癥狀，對于上了年紀(jì)的老人而言，一不小心還會(huì)導(dǎo)致跌倒等意外；因此，沒有副作用的茄紅素，可說是提供一個(gè)極佳的治療方式。盡管茄紅素對人體具有上述之效益，而目前由西紅柿中所取得的茄紅素的量及速度仍屬有限，如臺(tái)灣發(fā)明專利第100125866號申請專利案，其揭示一種突變可產(chǎn)生類茄紅素的菌種，有效的快速萃取出大量的類茄紅素，該類茄紅素產(chǎn)生抗發(fā)炎、抗氧化、美白、抑制膠原蛋白分解或促進(jìn)膠原蛋白增生之多種功效。因此，茄紅素可用于治療攝護(hù)腺肥大或腎功能具有相當(dāng)大的潛力，然而卻未有研究發(fā)現(xiàn)利用突變的菌種產(chǎn)生類茄紅素治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大或腎功能疾病，而市面上對于治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大或腎功能的類茄紅素產(chǎn)品，亦不多見。因此，本發(fā)明將有助于護(hù)腺肥大或腎功能相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的類茄紅素(Lycogen)組合物，所述組合物中的類茄紅素是由光合菌所萃取而來，所述光合菌為球型紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides),由野生或培養(yǎng)的原生光合菌經(jīng)紫外線照射使其變性而來，已保藏于布達(dá)佩斯條約的德國微生物與細(xì)胞搜集中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),地址位于德國不倫瑞克(DSMA GmbH, Inhoffen 街 7B, 38124 Braunschweig, Germany),保藏編號為WL-APD911，保藏日期2011年8月I日；同時(shí)也保藏于臺(tái)灣新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所，保藏編號為BCRC910406，光合菌的CrtC酵素DNA序列如SEQ ID NO : I所示，光合菌CrtC酵素氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。所述類茄紅素是利用有機(jī)溶劑萃取，所述有機(jī)溶劑可為甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯等。
本發(fā)明利用一種類茄紅素萃取物，其所含活性成分選自ζ-胡蘿卜素(ζ-carotene)、鏈抱紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)和 / 或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，所述活性成分萃取自突變的光合菌。在另一具體實(shí)施例中，所述突變的光合菌是保藏編號為WL-APD911的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)。在另一具體實(shí)施例中，所述突變的光合菌之CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)的 DNA 序列如 SEQ ID NO :1 所不；而野生型光合菌的 CrtC 酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)的 DNA 序列如 SEQ ID NO:
3所示。在另一具體實(shí)施例中，所述突變之光合菌的CrtC酵素(hydroxyneurosporenedehydrogenase)之氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；而野生型光合菌之CrtC酵素的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明提供一種用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。其中所述的類茄紅素組合物的有效劑量為25 150毫克/公斤。 根據(jù)本發(fā)明之具體實(shí)施例，所述的類茄紅素組合物所含活性成分選自ζ -胡蘿卜素(ζ -carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，所述活性成分萃取自突變的光合菌。在另一具體實(shí)施例中，所述突變的光合菌是保藏編號為WL-APD911的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)。在尚有另一具體實(shí)施例中，所述突變之光合菌的CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)的 DNA 序列如 SEQ ID NO :1 所不。本發(fā)明另提供一種用于制造治療或預(yù)防腎功能疾病的類茄紅素組合物，所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。其中所述的類茄紅素組合物的有效劑量為25 150毫克/公斤。根據(jù)本發(fā)明之具體實(shí)施例中，所述的類茄紅素組合物所含活性成分選自ζ -胡蘿卜素(ζ -carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基
鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，所述活性成分萃取自突變的光合菌。在另一具體實(shí)施例中，所述突變的光合菌是保藏編號為WL-APD911的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)。在另一具體實(shí)施例中，所述突變的光合菌的CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)的 DNA 序列如 SEQ ID NO :1 所不。根據(jù)本發(fā)明所述組合物的具體實(shí)施例，所述組合物可用作于食物增補(bǔ)劑、動(dòng)物飼料、人類食物產(chǎn)品或醫(yī)藥品或化妝品組合物。根據(jù)本發(fā)明所述組合物的另一具體實(shí)施例中，其可被制成適合用于非經(jīng)腸道、局部或口服投藥劑型。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可被制成溶液、乳劑、粉末、錠劑、膠囊或供用于口服投藥的其它形式。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述組合物可作為包括，但不限于膳食補(bǔ)充劑、食品、飲料、乳品或上述形式的組合；其中乳品可為流體乳品(如牛奶與濃縮牛奶)、發(fā)酵乳品(酸奶、酸乳、冷凍優(yōu)格、乳酸菌發(fā)酵飲料)、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆奶與發(fā)酵豆奶等。飲料可為蔬果汁、果汁及運(yùn)動(dòng)飲料等。食品可為甜點(diǎn)、糖果、嬰兒食品、動(dòng)物飼料等。以下列實(shí)施方式予以詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不意味本發(fā)明僅局限于此等實(shí)施方式所揭示的內(nèi)容。
關(guān)于本發(fā)明涉及的菌種說明球型紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides),由野生或培養(yǎng)的原生光合菌經(jīng)紫外線照射使其變性而來，已保藏于布達(dá)佩斯條約的德國微生物與細(xì)胞搜集中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures),地址位于德國不倫瑞克(DSMAGmbH, Inhoffen 街 7B, 38124 Braunschweig, Germany),保藏編號為 WL-APD911,保藏日期2011年8月I日。


圖I為根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，產(chǎn)生茄紅菌之流程圖。圖2為原生光合菌之代謝途徑。圖3(A_B)為根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明之茄紅菌與野生光合菌之CrtC酵素DNA序列比較圖。·
圖4為根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明之茄紅菌與野生光合菌之CrtC酵素氨基酸序列比較圖。圖5為根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例之高效液相層析法(HPLC)分析圖；(A)至(F)為以不同有機(jī)溶劑萃取本發(fā)明茄紅菌的萃取物；圖5(G)為茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品；圖5(H)為本發(fā)明茄紅菌的乙醇丙酮類茄紅素萃取物。圖6顯示㈧茄紅素；(B) ζ -胡蘿卜素；(C)鏈孢紅素；⑶球形烯醇及(E)甲氧基鏈孢紅素之分子結(jié)構(gòu)。圖7顯示㈧ζ -胡蘿卜素；⑶鏈孢紅素；(C)球形烯醇及⑶甲氧基鏈孢紅素的預(yù)測NMR光譜；該些經(jīng)標(biāo)記的波峰代表該些可與類茄紅素萃取物之COSY NMR光譜所示的波峰相對應(yīng)的波峰。圖8顯示類茄紅素萃取物之COSY NMR光譜；標(biāo)記為「a」的波峰代表可能的雜質(zhì)；標(biāo)記為「b」的波峰代表球形烯醇及甲氧基鏈孢紅素；標(biāo)記為「C」的波峰代表ζ -胡蘿卜素及鏈孢紅素；且標(biāo)記為「d」的波峰代表球形烯醇。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例的ζ -胡蘿卜素純化物(A)及鏈孢紅素純化物(B) IH NMR光譜；箭頭所指處表示ζ -胡蘿卜素純化物及鏈孢紅素純化物皆會(huì)在5. Ippm
處產(chǎn)生一波峰。圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例的類茄紅素萃取物IH NMR光譜(A)及其部分放大圖(B及C)。圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例的用于定量分析的類茄紅素萃取物IH NMR光譜。圖12為根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，進(jìn)行效用測試實(shí)驗(yàn)之實(shí)驗(yàn)流程圖。圖13為試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過本發(fā)明組合物處理的BPH老鼠的攝護(hù)腺指數(shù)。A :空白組；B :載體(南瓜子油)；C :類茄紅素。圖14為BPH老鼠經(jīng)由不同劑量的組合物處理后整體體重的改變。圖15為BPH老鼠的攝護(hù)腺指數(shù)經(jīng)由注射不同劑量的組合物的改變情形?；加蠦PH的實(shí)驗(yàn)老鼠經(jīng)由喂食不同劑量的組合物且持續(xù)28天。圖15(A)為攝護(hù)腺指數(shù)的結(jié)果，其計(jì)算方式為攝護(hù)腺的總重占整體體重的比率。每個(gè)數(shù)據(jù)接取自于來自同一組別的8只老鼠的結(jié)果平均加減標(biāo)準(zhǔn)偏差，且經(jīng)鄧肯多變域檢定發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)上的意義(P < O. 05)。I :空白對照組；2 =BPH對照組；3 50毫克/公斤(低濃度)；4 50毫克/公斤(中濃度)；5 :150毫克/公斤(高濃度)。圖15⑶為攝護(hù)腺抑制效果，將空白組的攝護(hù)腺指數(shù)設(shè)定為0%，ΒΡΗ對照組則為100%，而在觀察喂食不同劑量的組合物的老鼠其抑制攝護(hù)腺腫大的情形。A:50毫克/公斤(低濃度)；B :50毫克/公斤(中濃度)；C 150毫克/公斤(高濃度)。圖16為H&E染色法，其顯示喂食不同濃度Locogen (LyG)的老鼠攝護(hù)腺組織情況。圖17顯示隨著Lycogen的增加(50 150mg/kg)對腹側(cè)及背側(cè)的攝護(hù)腺肥大改善效果有遞增的趨勢。圖18為利用腹側(cè)前列腺與背側(cè)前列腺的平均值表示整體攝護(hù)腺肥大的改善效
果O 圖19為不同劑量的組合物對于血中尿素氮的結(jié)果。A :空白對照組；B :25毫克/公斤(低劑量)；C 100毫克/公斤(高劑量)。圖20為不同劑量的組合物對于血清肌酸酐的結(jié)果。A :空白對照組；B :25毫克/公斤(低劑量)；C 100毫克/公斤(高劑量)。圖21為不同劑量的組合物對于血中尿酸的結(jié)果。A :空白對照組；B :25毫克/公斤(低劑量)；c 100毫克/公斤(高劑量)。
具體實(shí)施例方式首先，請參閱圖I的流程圖，本發(fā)明提供一種生成類茄紅素的微生物，其主要是將野生或培養(yǎng)的原生光合菌，利用紫外線分別予以照射5、10、20、30、40秒后，使其產(chǎn)生變性，而當(dāng)光合菌經(jīng)由紫外線的照射而變成含有豐富茄紅素之突變光合菌(命名為茄紅菌)時(shí)，將該突變的光合菌(茄紅菌)篩選取出，并予以培養(yǎng)繁殖，再以有機(jī)溶劑予以萃取出茄紅素及類爺紅素。請參閱圖2，原生光合菌生成茄紅素的代謝途徑中，由甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate)起始，其經(jīng)由CrtB酵素作用轉(zhuǎn)變成八氫西紅柿紅菌(Phytoene),接著藉由CrtI酵素作用轉(zhuǎn)變成六氫西紅柿紅菌(Phytof Iuene),該六氫西紅柿紅菌則接著經(jīng)由CrtI酵素變化成ζ -胡蘿卜素(ζ -carotene)，而ζ -胡蘿卜素會(huì)再經(jīng)由CrtI酵素作用變化成鏈孢紅素(Neurosporene);接著,鏈孢紅素經(jīng)由CrtI酵素作用轉(zhuǎn)變成爺紅素(Lycopene)。該爺紅素生成后被CrtC酵素轉(zhuǎn)化成紫菌紅素(Rhodopin),該紫菌紅素經(jīng)由CrtD酵素作用轉(zhuǎn)化成3,4- 二脫氫紫菌紅素(3,4-didehydrorhodopin),該3,
4-二脫氫紫菌紅素會(huì)經(jīng)CrtF酵素變化成脫水紫菌紅醇(Anhydro-rhodovibrin),該脫水紫菌紅醇會(huì)經(jīng)CrtC酵素變化成紫菌紅醇(Rhodovibrin);接著該紫菌紅醇再經(jīng)由CrtD酵素變化成單脫甲基螺菌黃素(Monodemethyl-spiriIIoxanthin),該單脫甲基螺菌黃素最后由CrtF酵素變化成螺菌黃素(Spirilloxanthin)。 上述的代謝過程中，該鏈孢紅素(Neurosporene)還有可能會(huì)由CrtC酵素變化成輕基鏈孢紅素(hydroxyneurosporene),該輕基鏈孢紅素再經(jīng)由CrtF酵素轉(zhuǎn)變成甲氧基鏈孢紅素(Methoxyneurosporene),然后該甲氧基鏈孢紅素由CrtD酵素變化成球形烯(Spheroidene);其中，該球形烯可能由CrtC酵素作用生成輕基球形烯輕(Hydroxyspheroidene),或由 CrtA 酵素作用生成球形烯醇(Spheroidenone)。
其中，本發(fā)明的原生光合菌經(jīng)由紫外線之照射后，其顏色會(huì)產(chǎn)生變化，當(dāng)其變化成鮮紅色的突變光合菌(茄紅菌)時(shí)，將菌液篩選出至培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，經(jīng)由培養(yǎng)繁殖的茄紅菌的CrtC酵素的DNA序列如SEQ ID NO : I所示，CrtC酵素的氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示。比較該突變的光合菌(茄紅菌)的CrtC酵素的DNA序列與野生(原生)的光合菌的CrtC酵素的DNA序列時(shí)，如圖3所示，茄紅菌于第76、88、147、214、274、282、310、496、694、707、708及715個(gè)序列會(huì)產(chǎn)生變異；藉此，可確定于CrtC酵素DNA序列的第76、88、147、214、274、282、310、496、694、707、708及715個(gè)核苷酸具有變異的突變菌株即為茄紅菌。此夕卜，該茄紅菌的CrtC酵素胺基酸序列則如SEQ ID NO :2所示。該茄紅菌之CrtC酵素胺基酸序列與原生之光合菌比較時(shí)，如圖4所示，可于第45、46、47、190及239個(gè)氨基酸位置發(fā)現(xiàn)變異；藉此，可確定于CrtC酵素氨基酸序列第45、46、47、190及239個(gè)氨基酸位置具有變異的突變菌株即為茄紅菌。接著將該等茄紅菌篩選至培養(yǎng)皿中予以培養(yǎng)繁殖，再利用有機(jī)溶劑萃取培養(yǎng)所得之茄紅菌，而當(dāng)采用該有機(jī)溶劑時(shí)，可利用脂溶性有機(jī)溶劑。 本發(fā)明通過采用物理性的紫外線照射，將野生或培養(yǎng)的原生光合菌以不同時(shí)間照射處理，使該光合菌產(chǎn)生突變菌株，并篩選出顏色呈鮮紅色的茄紅菌，將該茄紅菌篩選至培養(yǎng)皿中予以培養(yǎng)繁殖，再以有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，藉此，無須由西紅柿中萃取，即可達(dá)到快速的產(chǎn)生大量茄紅素與類茄紅素之功效。類茄紅素之提取與分離I.甲醇和丙酮萃取物菌體以甲醇于室溫下震蕩后離心SOOOrpm，10分鐘，取上清液后過濾，重復(fù)此抽取步驟三次，合并三次濾液，并減壓濃縮得到甲醇萃取物(Rs-M)。經(jīng)甲醇萃取后的菌體殘余物再以丙酮萃取，重復(fù)以上步驟，減壓濃縮后得到丙酮萃取物(Rs-M/A)。2.乙醇和丙酮萃取物同上步驟1，分別得乙醇萃取物(Rs-E)和丙酮萃取物(Rs-E/A)。3.丙酮萃取物同上步驟I，得丙酮萃取物(Rs-A)4.萃取物的分離萃取物加入蒸餾水使之成懸浮液，再以正己烷萃取三次，萃取液合并減壓濃縮至干，得到正己烷層(Fr，Rs-H)，同上法再將水層依序增加極性以二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取之，分別得二氯甲烷層(Fr，Rs-C)，乙酸乙酯層(Fr，Rs_E)，正丁醇層(Fr，Rs-B)，余者為水層(Fr，Rs-W)。HPLC 分析法菌色素含量分析，取菌體萃取粉末以適量DMSO回溶，全程避光。HPLC條件如下采用C18管柱，波長470nm，移動(dòng)相為甲醇/異丙醇(95/5，v/v)，流速I毫升/分鐘，茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品滯留時(shí)間為50±2分鐘。甲醇萃取物(Rs-M)顏色為綠色，乙醇萃取物(Rs-E)顏色為茶褐色,丙酮萃取物(Rs-A)顏色為深紅色。以茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品為比較，經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，Rs-A的茄紅素含量最多(RT = 50分鐘)，Rs-E微量，而Rs-M則完全沒有茄紅素；推測使用甲醇和乙醇萃取的殘余菌體仍含有茄紅素，故將甲醇與乙醇處理后的菌體殘余物分別使用丙酮再進(jìn)行萃取，結(jié)果分別得到甲醇?xì)堄辔锏谋腿∥?Rs-M/A)和乙醇?xì)堄辔锏谋腿∥?Rs-E/A)，二者顏色均為紅色。Rs-E/A和Rs-M/A亦進(jìn)行HPLC分析，如圖5(A)至(F)所示，箭頭所指處為茄紅素吸收峰。菌體的乙醇丙酮萃取物溶于二甲亞砜(DMSO)后經(jīng)HPLC分析，并與茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品(L-9879，Sigma)比對其滯留時(shí)間(圖5 (G))，發(fā)現(xiàn)菌體萃取物之HPLC分析圖譜顯示位于標(biāo)準(zhǔn)品相同滯留時(shí)間(50分鐘)的波峰極小，最大的波峰出現(xiàn)在滯留時(shí)間約21分鐘左右(約21. 7 24. 19分鐘,稱為未知波峰)(圖5 (H))。表不菌體爺紅素在波長470nm下吸光的主要成分以21分鐘出現(xiàn)之物質(zhì)為主，可能是菌體本身合成茄紅素過程之中間代謝產(chǎn)物，因此稱之為「類茄紅素」。以波峰面積來計(jì)算的話，其中的茄紅素面積僅為類茄紅素的3. 3%左右。NMR 分析以下實(shí)驗(yàn)中所使用的樣本系利用乙醇丙酮萃取本發(fā)明的光合菌所得的類茄紅素萃取物。
A :樣本制備秤取約15mg樣本并將其溶解于D-三氯甲烷中。將溶解完成之樣品裝入常規(guī)液態(tài)NMR tube，裝入的體積大約在500uL左右。裝入后使用parafilm (石臘膜)將管口密封，并置于冰箱中保存( 4°C )，以防止溶劑的揮發(fā)與樣品的變質(zhì)。B:NMR 實(shí)驗(yàn)將配置好的樣品放入液態(tài)500NMR(Varian公司產(chǎn)品,磁場強(qiáng)度為11. 74T)。將樣品進(jìn)行20rps的轉(zhuǎn)動(dòng)(儀器內(nèi)建功能)，以消除磁場不均勻性，提升光譜分辨率。呼叫儀器內(nèi)部脈沖序列信息，分別進(jìn)行一維1H NMR^13C NMR, DEPT NMR、COSY NMR、NOESY NMR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)完成后，調(diào)整得到的光譜(基線調(diào)整、相位調(diào)整、施加窗函數(shù))。上述這些調(diào)整主要目的在于利于后續(xù)的分析。本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可知，這些調(diào)整不會(huì)對光譜產(chǎn)生嚴(yán)重性失真，因此被廣為應(yīng)用。C :光譜分析將NMR實(shí)驗(yàn)中得到的一維13C譜、DEPT譜、二維COSY譜(圖8)及二維NOESY譜進(jìn)行分析比較。一維13C譜展示所有13C信息。DEPT譜可以用來區(qū)分甲基、乙基及丙基碳。COSY和NOESY譜則可以用來鑒定分子結(jié)構(gòu)。將COSY譜與預(yù)測所得的光譜(圖7，由NMR預(yù)測器(nmrdb. org)產(chǎn)生)進(jìn)行比較以辨識(shí)樣本中所含的各種成分。為了進(jìn)行NMR光譜預(yù)測，自KEGG網(wǎng)站下載各化合物(請參照圖6)的分子表達(dá)譜(molecular profiles)，并以NMR預(yù)測器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及預(yù)測。利用上述光譜得到的各項(xiàng)信息，進(jìn)行樣品定性以及定量的判斷。接著請參照圖8，標(biāo)記為「a」的波峰代表可能的雜質(zhì)；標(biāo)記為「b」之波峰代表球形烯醇(spheriodenone)及甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene);標(biāo)記為「C」之波峰代表胡蘿卜素(ζ -carotene)及鏈孢紅素(neurosporene);且標(biāo)記為「d」之波峰代表球形烯醇(spheriodenone)。根據(jù)標(biāo)記為「C」之波峰的低強(qiáng)度，相較于在3-4ppm之間的兩個(gè)波峰(標(biāo)記為「b」)，可得知球形烯醇(spheriodenone)及甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)為樣本中的主要成分，且其比例約為一比一。所述球形烯醇含量多于樣本的30重量百分比，而甲氧基鏈孢紅素含量亦多于樣本的30重量百分比。ζ -胡蘿卜素純化物、鏈孢紅素純化物及類茄紅素萃取物的1H NMR光譜如圖9至11所示。以前述信息為基礎(chǔ)，藉由將圖10㈧中所示的光譜與圖9(A)及⑶中所示的光譜進(jìn)行比較，以進(jìn)一步辨識(shí)類茄紅素萃取物中的活性成分及其所占比例。圖10(A)光譜中各波峰所代表的化合物被標(biāo)示于圖10(B)及(C)中。圖10(C)虛線長方型區(qū)域內(nèi)的波峰均可與 -胡蘿卜素純化物(圖9(A))及鏈孢紅素純化物的1H NMR光譜中的波峰相對應(yīng)(圖9(B))。由圖9(A)及(B)可得知，ζ -胡蘿卜素純化物及鏈孢紅素純化物在進(jìn)行1H NMR時(shí)，均會(huì)產(chǎn)生一個(gè)在5. Ippm處的波峰(箭頭標(biāo)示)。由一化合物在NMR光譜中波峰的強(qiáng)度及/或波峰下的面積可推知該化合物的含量。圖9(A)及(B)中，箭頭所指波峰的強(qiáng)度比為I : I. 273，代表ζ-胡蘿卜素及鏈孢紅素之比例為I : 1.273。圖11中的波峰a代表ζ-胡蘿卜素及鏈孢紅素；波峰b代表球形烯醇；而波峰c代表甲氧基鏈孢紅素。上述波峰a、b及c的面積比為I : 1.553 1.604。根據(jù)上述所有實(shí)驗(yàn)資料，可計(jì)算得知本發(fā)明類茄紅素萃取物中所含的胡蘿卜素約為
10.58重量百分比，鏈孢紅素約為13. 47重量百分比，球形烯醇約為37. 37重量百分比，而甲氧基鏈孢紅素約為38. 58重量百分比。 惡性攝護(hù)腺肥大的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本發(fā)明購自六只正常和28只經(jīng)歷睪丸摘除手術(shù)之公鼠，其鼠齡均約為6-7個(gè)禮拜，體重介于180-220公克之間，購買后隔離飼養(yǎng)I個(gè)禮拜。飼養(yǎng)公鼠的環(huán)境設(shè)定為為攝氏23±1°C且為12小時(shí)日夜循環(huán)。該些公鼠皆能自行飲食及喝水；另一方面，亦準(zhǔn)備三種濃度的試劑(表一)。本實(shí)驗(yàn)步驟已提交動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)及生技發(fā)展中心審查且得到認(rèn)可。表一、測試實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
劑量劑量體積濃度
測試實(shí)驗(yàn)一士 M ^一士^載體一士一^ 儲(chǔ)存溫度
( 克/公斤) ( 克/公斤)( 克/ 升)
載體-5南瓜種子油-4°C
低濃度LyG505南瓜種子油100/104°C.
中濃度LyG1005南瓜種子油200/104°C.
高濃度LyG1505南瓜種子油300/104°C試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)將具有預(yù)防效果的類茄紅素組合物以10只經(jīng)睪丸切除的老鼠進(jìn)行前測(pretest)。睪丸切除的老鼠隨機(jī)分為兩組，I)載體組，2)加入LyG 50毫克/公斤。在睪丸摘除的老鼠的肌肉內(nèi)注射每公斤10毫克的睪酮環(huán)戊丙酸，每禮拜注射兩次且持續(xù)四個(gè)禮拜，使其患有攝護(hù)腺肥大(BPH)。其分組如表二。表2、試驗(yàn)研究分組
劑量 毫克/毫
組別處理 ， 路徑頻率數(shù)量___52____
1空白組(假手術(shù))N/AN/AN/A2
2BPH+載體N/A口服每天5
3BPH+LyG50毫克/公斤口服每天5本發(fā)明使用巴比妥(體重每一公斤使用60毫克)將老鼠安樂死，且從其股靜脈取血液樣本。在分析樣本前，將血液凝固后使用3000g離心10分鐘，以得到血清后在攝氏-20°C下保存。另外也從老鼠取下攝護(hù)腺，且將鄰近的血管及結(jié)締組織清除。經(jīng)過假手術(shù)的對照組也是經(jīng)由上述相同的方式取下其攝護(hù)腺。攝護(hù)腺指數(shù)的計(jì)算方式為攝護(hù)腺的總重占整體體重的比重,如式一
·
攝護(hù)腺指數(shù)=(攝護(hù)腺總重/整體體重)X100%(式一)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析數(shù)據(jù)結(jié)果是使用平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式呈現(xiàn)。而統(tǒng)計(jì)分析則使用單因子變量分析，其根據(jù)鄧肯多變域檢定(SPSS軟件包)。P值小于O. 05是有統(tǒng)計(jì)上的意義。效用測試實(shí)驗(yàn)A.誘導(dǎo)階段做為空白組的實(shí)驗(yàn)生物為睪丸并未被摘除的假手術(shù)。而睪丸被摘除的老鼠則隨機(jī)分配至四組，分別為(a)BPH對照組；(b)低濃度-注射每公斤50毫克的LyG ；(c)中濃度-注射每公斤100毫克的LyG ； (d)高濃度-注射每公斤150毫克的LyG，與先前所述的試驗(yàn)性研究的研究條件相同。B.測試階段所有的實(shí)驗(yàn)組及對照組皆使用灌食的方式喂食且持續(xù)28天，其實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)于圖12及表三。表三、實(shí)驗(yàn)分組
劑量
組別處理一+—夂路徑頻率數(shù)量
(暈克/暈升)
1空白組(假手術(shù)) N/AN/AN/A6
2BPHN/AN/AN/A4
0BPH+低濃度一士每天一次，。
350暈克/公斤口服8 LyG 持續(xù)28天
4BPH+中濃 100毫克/公斤口服每天一次，8
；_ LyG _J___
權(quán)利要求
1.一種用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。
2.如權(quán)利要求I所述的用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素萃取物所含活性成分選自Z-胡蘿卜素(z-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)和/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。
3.如權(quán)利要求I所述的用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素萃取物是萃取自突變的光合菌。
4.如權(quán)利要求3所述的用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，其特征在于所述的突變的光合菌是保藏于布達(dá)佩斯條約的德國微生物與細(xì)胞搜集中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures),保藏編號為WL-APD911 的球形紅桿菌 iRhodobacter ■spAaeroiofes ),保藏日期 2011 年8 月 I 日。
5.如權(quán)利要求I所述的用于制造治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，其特征在于所述類茄紅素組合物用作食物增補(bǔ)劑、動(dòng)物飼料、人類食物產(chǎn)品或醫(yī)藥品或化妝品組合物。
6.一種用于制造治療或預(yù)防腎功能疾病的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。
7.如權(quán)利要求6所述的用于制造治療或預(yù)防腎功能的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素萃取物所含活性成分選自Z-胡蘿卜素(z-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)和/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。
8.如權(quán)利要求6所述的用于制造治療或預(yù)防腎功能的類茄紅素組合物，其特征在于所述的類茄紅素萃取物是萃取自突變的光合菌。
9.如權(quán)利要求8所述的用于制造治療或預(yù)防腎功能的類茄紅素組合物，其特征在于所述的突變的光合菌保藏于布達(dá)佩斯條約的德國微生物與細(xì)胞搜集中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures),保藏編號為WL-APD911 的球形紅桿菌 iRhodobacter ■spAaeroiofes ),保藏日期 2011 年8 月 I 日。
10.如權(quán)利要求6所述的用于制造治療或預(yù)防腎功能的類茄紅素組合物，其特征在于所述類茄紅素組合物用作食物增補(bǔ)劑、動(dòng)物飼料、人類食物產(chǎn)品或醫(yī)藥品或化妝品組合物。
11.一種光合菌，保藏于布達(dá)佩斯條約的德國微生物與細(xì)胞搜集中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures),保藏編號為 WL-APD911,保藏日期2011年8月I日。
12.如權(quán)利要求11所述的光合菌在生產(chǎn)茄紅素或類茄紅素方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防攝護(hù)腺肥大的類茄紅素組合物，所述類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。本發(fā)明也涉及一種用于治療或預(yù)防腎功能疾病的類茄紅素組合物，所述類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。
文檔編號A61K8/99GK102885315SQ20121007225
公開日2013年1月23日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者劉文生, 張富信, 蔡雅雯 申請人:亞比多生技發(fā)展有限公司