專利名稱:Ggpps拮抗劑在制備治療ii型糖尿病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及GGPPS在II型糖尿病藥物治療中的應(yīng)用,尤其涉及GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病藥物中的用途。
背景技術(shù):
II型糖尿病又稱非胰島素依賴糖尿病、成年型糖尿病,是一種多病因的代謝疾病。 其發(fā)病因素很多,除內(nèi)在的遺傳因素外,還與人們生活環(huán)境、生活方式及行為有很大的關(guān)系,尤其是過(guò)度肥胖引起的一些代謝紊亂易導(dǎo)致II型糖尿病。另外,90%患者于在35 40歲之后發(fā)病。II型糖尿病主要表現(xiàn)為患者肌肉和脂肪組織能夠?qū)σ葝u素產(chǎn)生抗性,而作為補(bǔ)償,胰島β細(xì)胞則分泌更多的胰島素,但依舊不能把血糖維持在正常范圍內(nèi)。而過(guò)量的胰島素分泌使胰島β細(xì)胞功能受到損傷,導(dǎo)致胰島素分泌不足。II型糖尿病在世界各地均有很高的發(fā)病率,尤其在過(guò)去的50年中II型糖尿病發(fā)病率伴隨肥胖率顯著增長(zhǎng),直至2010年全球患者數(shù)已超過(guò)II億8千萬(wàn)。而在我國(guó),II型糖尿病已經(jīng)成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的疾病。最新資料表明,我國(guó)糖尿病患者已超過(guò)6000萬(wàn),約占全球糖尿病患者的五分之一。預(yù)計(jì)截止到2025年我國(guó)糖尿病患者總數(shù)將接近1億。胰島素抵抗是指機(jī)體靶組織對(duì)胰島素的反應(yīng)性低于正常的一種病理生理狀態(tài),經(jīng)常與肥胖,II型糖尿病早期階段等臨床疾病相伴隨,是這些疾病的一個(gè)重要的特征,也是導(dǎo)致這些疾病發(fā)生的重要因素。但是造成胰島素抵抗以及由此導(dǎo)致的肥胖,II型糖尿病等相關(guān)疾病的分子機(jī)制并不是很清楚。這就導(dǎo)致了其防治的困難。胰島素抵抗細(xì)胞模型的構(gòu)建主要分為兩個(gè)部分將3T3-L1前脂細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞以及將后者誘導(dǎo)為胰島素抵抗脂肪細(xì)胞。構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型是進(jìn)行頂相關(guān)疾病(如II型糖尿病)的病理機(jī)制探索及藥物研發(fā)的重要途徑。根據(jù)英國(guó)前瞻性糖尿病研究(UKPDS) II型糖尿病患者的胰島β細(xì)胞由于出現(xiàn)功能的漸進(jìn)惡化,隨著II型糖尿病病程的進(jìn)展,多數(shù)II型糖尿病患者最終都需要胰島素治療以達(dá)到良好的血糖控制。 ggpps基因即香葉基香葉基二磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase l,ggppsl)基因。在蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾過(guò)程中起到關(guān)鍵作用, ggpps的底物GGPP是小G蛋白發(fā)生香葉基化的重要前體。香葉基化是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾之一,一般發(fā)生在蛋白質(zhì)C末端保守的半胱氨酸。發(fā)生香葉基化的蛋白質(zhì)包括Ras和 Ras相關(guān)的小G蛋白如I h0,Rab,Rac,以及三聚體G蛋白的γ亞基,這些受調(diào)控的蛋白質(zhì)都是信號(hào)傳遞通路中重要的分子開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)蛋白。有研究報(bào)道,以GGPPS為藥物靶點(diǎn)對(duì)于成骨細(xì)胞分化與骨骼構(gòu)建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011),也有研究闡述了 GGPPS可作為香煙煙霧引發(fā)的肺部疾病的治療靶點(diǎn)(Shen,G0ng et al. 2011),但就GGPPS用于治療 II型糖尿病之間的靶點(diǎn)藥物并沒(méi)有任何報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
3
有鑒于此,本發(fā)明的目的在于通過(guò)考察GGPPS基因在II型糖尿病模型中表達(dá)與功能活性,確認(rèn)GGPPS能否作為II型糖尿病治療的藥物靶點(diǎn)以及增效藥物,從而提高II型糖尿病患者的治療效果及生命質(zhì)量。為達(dá)上述目的,發(fā)明人考察了 GGPPS在胰島素抵抗細(xì)胞模型與胰島素長(zhǎng)期刺激胰島素抵抗細(xì)胞模型以及II型糖尿病患者組織檢測(cè)表達(dá)變化,同時(shí)進(jìn)行了干擾GGPPS對(duì)胰島素抵抗的緩解,糖耐量實(shí)驗(yàn)以及胰島素信號(hào)通路IRS檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)胰島素的刺激在胰島素抵抗細(xì)胞模型中GGPPS顯著增長(zhǎng);降低了胰島素信號(hào)通路敏感性同樣在II型糖尿病患者的脂肪組織中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GGPPS蛋白與mRNA水平均高于對(duì)照組;根據(jù)糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GGPPS+雄性小鼠對(duì)于葡萄糖耐受量較GGPPS+/-雄性小鼠更高且對(duì)胰島素敏感性更強(qiáng); 胰島素通路IRS檢測(cè)結(jié)果顯示GGPPS+小鼠的^S ser612磷酸化程度顯著降低使胰島素敏感性得到恢復(fù),胰島素抵抗癥狀得到緩解。本發(fā)明治療II型糖尿病的藥物施用方式可以是口服、特定組織器官施用、全身施用(例如,透過(guò)皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如,肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物,可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。本發(fā)明中,所述小干擾RNA為對(duì)應(yīng)標(biāo)靶序列為序列表中SEQ ID NO: 1或2的DNA 序列的小干擾RNA。根據(jù)本發(fā)明的記載和本領(lǐng)域的公知常識(shí),抑制GGPPS對(duì)于治療II型糖尿病有增敏作用。GGPPS基因重組表達(dá)載體例如本申請(qǐng)中構(gòu)建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒可以單獨(dú)或與其他有功能活性基因重組表達(dá)載體聯(lián)合,再輔以藥學(xué)上可接受的載體,用以制備治療II型糖尿病的增敏藥物。進(jìn)一步,根據(jù)本發(fā)明的記載和本領(lǐng)域的公知常識(shí)可知,任何在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平上抑制GGPPS基因的拮抗劑均可單獨(dú)或與其他具有功能活性的多肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白等聯(lián)合,再輔以藥學(xué)上可接受的載體,用于制備治療II型糖尿病的增敏藥物。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次公開(kāi)了 GGPPS基因和蛋白的拮抗劑可以用于制備治療II型糖尿病的增敏藥物,有助于提高胰島素把組織對(duì)于胰島素的敏感性,增強(qiáng)胰島素的療效,提高II型糖尿病患者的生命質(zhì)量,在II型糖尿病治療領(lǐng)域具有潛在、良好的應(yīng)用前景。
圖1為胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立。在用TNF-α細(xì)胞因子誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞3天后, 采用免疫印跡的方法檢測(cè)胰島素信號(hào)通路中IRS的酪氨酸磷酸化水平的變化。胰島素抵抗細(xì)胞在胰島素刺激后葡萄糖攝取的程度顯著下降。圖2顯示了 GGPPS在胰島素抵抗細(xì)胞模型中的變化。圖3顯示干擾GGPPS恢復(fù)胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。圖4顯示GGPPS在II型糖尿病人中呈特異性高表達(dá)。**表示兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖5顯示敲除GGPPS提高小鼠糖耐量。
圖6顯示敲除GGPPS提高小鼠的胰島素敏感性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件
一般材料和方法 1材料
3T3-L1細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞所,胰島素(諾和靈R),地塞米松購(gòu)自鼓樓醫(yī)院, [3H]-D-Glucose購(gòu)自中國(guó)同位素總公司,IBMX購(gòu)自Sigma公司,anti-p-IRS (Tyr)抗體,anti-IRS抗體,胎牛血清購(gòu)自PAA公司,Anti-p-ERK抗體,anti-ERK抗體購(gòu)自 (上??党巧锛夹g(shù)公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Traverse-Ace以及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自 TOYOBO公司。TNF-α細(xì)胞因子購(gòu)自Sigma公司,油紅染料購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司。 anti-p-IRS(Ser308),anti-p-IRS(Ser612)均購(gòu)自 Cell signaling 公司,野生型及db/db 小鼠(Bks)購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,羅氏血糖儀,glucose購(gòu)自Sigma公司。II型糖尿病病人組織標(biāo)本由江蘇省中醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)
前脂細(xì)胞(3T3-L1)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,于37° C、5% C02濃度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。脂肪細(xì)胞以及胰島素抵抗細(xì)胞的誘導(dǎo)
前脂細(xì)胞(3T3-L1)接種并長(zhǎng)滿后培養(yǎng)基換為含有10%胎牛血清,150nmol/L胰島素, 250nmol/L 地塞米松以及 0. 5mmol/L 3-isobutyl-l-methylxanthine 的刺激液 1,培養(yǎng) 2天后,換為含有10%胎牛血清和150nmol/L胰島素的培養(yǎng)基,再培養(yǎng)2天后,細(xì)胞換回正常的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,6天后即出現(xiàn)大量含有脂滴的脂肪細(xì)胞。3T3-L1 前脂細(xì)胞在誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞后,用含有終濃度為5ng/ml的TNF-α細(xì)胞因子的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)3天,每24小時(shí)換液,3天后即為胰島素抵抗脂肪細(xì)胞。油紅染色
將誘導(dǎo)好的脂肪細(xì)胞用PBS洗3遍,加入油紅染料,吸干,10倍顯微鏡鏡檢。葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)
每個(gè)細(xì)胞樣本加入[3H]-D-Gluc0se使終濃度為200uCi/mmol/L,同時(shí)加入終濃度為 IOnm的胰島素,3小時(shí)后,用冰預(yù)冷的PBS洗3遍,加入IOM KOH裂解細(xì)胞,用等體積無(wú)水乙醇沉淀葡萄糖過(guò)夜,IOOOOg離心10分鐘,用無(wú)菌水200ul重懸沉淀,用閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)。免疫印跡分析
細(xì)胞培養(yǎng)至可以進(jìn)行蛋白抽提時(shí),吸去培養(yǎng)基,用冰預(yù)冷的PBS洗兩遍,加入300ul 裂解緩沖液(50.0 mmol/L Tris, 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 1.0 mmol/L Na3VO4, 2. 0 mmol/L NaF, 100. 0 μ g/ml PMSF, 1. 0 μ g/ml Ieup印tin, and 1.0 μ g/ml aprotinin ),冰浴30 min,期間每隔5分鐘混勻一次,刮取細(xì)胞,12 000 g離心10分鐘,收集上清。(或取自動(dòng)物組織,提取蛋白)采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 取50 μ g的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳分離,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,一抗4°C孵育過(guò)夜,anti-p-IRS (Tyr) (1 500),anti-IRS (1 500),用 AP標(biāo)記的二抗與NBT 和 BCIP顯色或者采用 BM chemiluminescence Western Blotting Kit(購(gòu)自 Roche 公司)檢測(cè)結(jié)果。提取組織標(biāo)本RNA
取Img組織標(biāo)本,懸浮于Iml Trizol Gnvitrogen),用組織勻漿器勻漿3-5分鐘, 加1/5體積酚氯仿抽提蛋白,12000rpm,離心10分鐘,抽取上清,加等體積的異丙醇,-20 度,20分鐘沉淀RNA,12000rpm,離心10分鐘,棄上清,沉淀溶于20ul DEPC(焦碳酸二乙脂)溶液,測(cè)定濃度。反轉(zhuǎn)錄PCR
通過(guò)Tranverse-Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Τ0Υ0Β0),采用oligo-dT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取800ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA,流程如下800ng總RNA,加入Iul mol/L Oligo dT引物 lul,補(bǔ)DEPC水至10ul。65° C,反應(yīng)5 min后,迅速置于冰上,再加入反應(yīng)緩沖液如1, IOmmol/L dNTP 2ul,20 U/ul 的 RNA酶抑制劑 lul。在 37° C 反應(yīng)5 min 后,加入 Iul 10 U/ul逆轉(zhuǎn)錄酶,42° C反應(yīng)1 h后在90° C處理10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Τ0Υ0Β0),具體體系如下
20 μ 1 體系,STOR(2*) :10μ 1,引物(上游)(10*) :2 μ 1,引物(下游)(10*) :2μ 1, cDNA模板2μ 1,加雙蒸水至20 μ 1。ggpps實(shí)時(shí)定量PCR引物序列
ggpsl(鼠)正向5,- TTTTGCATACACTCGACACACT-3’ (SEQ ID N0:3) ggpsl (鼠)反向5,- GGCCTCAATTTGTTTGTAGGCTT-3,(SEQ ID N0:4) ggpsl (人)正向5,-CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3,(SEQ ID N0:5) ggpsl (人)反向5,-CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ (SEQ ID N0:6) 擴(kuò)增條件
95°C預(yù)變性5分鐘,95°C變性15秒,60°C退火15秒,72°C延伸,收集熒光信號(hào)45 秒,共40個(gè)循環(huán),數(shù)據(jù)分析。構(gòu)建
根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的一般原則設(shè)計(jì)選取靶序列。本實(shí)驗(yàn)選取的靶序列是5’-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3,(PI, GGPPS 小干擾 RNA 靴向序列)(SEQ ID N0:1)/ 5'-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3,(P2 有義鏈,GGPPS 小干擾 RNA 靶向序列)(SEQ ID N0:2) 將上述序列交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。寡核苷酸退火將合成的寡核苷酸溶解在ddH20中,終濃度為lyg/ Ul。依次按以下步驟操作寡核苷酸Pl,P2各取1. 5 μ 1加入47 μ 1的退火緩沖液(100 mmol/L乙酸鉀,30 mmol/L HEPES-K0H pH 7.4,2mmol/L 乙酸鎂),94°C 孵育 4 min, 70°C 孵育 10 min,緩慢冷卻至4°C。寡核苷酸磷酸化取Iul退火的寡核苷酸,加1 μ 1 Τ4 PNK緩沖液、1 ul 1 mmol/L AT P (儲(chǔ)存液 IOmM)、lul T4 ΡΝΚ、6 μ IH2O,在 37°C 孵育 30 min,70°C孵育 10 min(滅活 PNK)。
質(zhì)粒酶切、去磷酸化與純化
按如下體系以Bgl II和Hind III雙酶切穿梭質(zhì)粒,37 0C孵育4 h。85°C,加熱15 min以終止反應(yīng)。直接向反應(yīng)體系中加入0. 1 μ 1的小牛腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化反應(yīng)1 h。用1%的瓊脂糖凝膠電泳。在長(zhǎng)波紫外燈照射下,割取目的片段,用DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收。Bgl II和Hind III雙酶切穿梭質(zhì)粒反應(yīng)體系 IOXbuffer1.0 μ 1
穿梭質(zhì)粒8. 0 μ 1 ( 2. 0μ g)
Bgl II0. 2 μ KlOU/ μ 1)
Hind III0. 2 μ 1 (IOU/ μ 1)
H2O0. 6 μ 1
連接與轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)體系
IOXLigase buffer1. 0 μ 1
Τ4 DNA Ligase0. 5 μ 1
酶切過(guò)的載體5.0μ1
P10. 5 μ 1
P20. 5 μ 1
H2O2· 5 μ 1
將5.0 μι的酶切過(guò)的載體轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中,加Ρ1、Ρ2各0.5 μι,加水至 8.5 μ ,于45° C加溫5 min以使重新退火的粘端解鏈,將混合物冷卻至0°C,再分別加入連接酶緩沖液1.0 μ 1, Τ4 DNA連接酶0.5 μ ,混勻,于16°C孵育過(guò)夜。次日取5.0 μ 1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒的鑒定
挑克隆,小量提取質(zhì)粒,以EcoR I酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。預(yù)期陽(yáng)性克隆酶切產(chǎn)物會(huì)釋放一個(gè)300 bp的條帶,而陰性對(duì)照相應(yīng)條帶只有MO bp。為了進(jìn)一步從序列的準(zhǔn)確性上得到驗(yàn)證,選取EcoR I酶切后電泳出現(xiàn)300bp條帶的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至上海生工有限公司測(cè)序。重組穿梭質(zhì)?;虺聊蕶z測(cè)
在重組包裝病毒之前,我們用磷酸鈣沉淀法將重組穿梭質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)其基因沉默效率進(jìn)行了檢測(cè)。重組腺病毒的構(gòu)建
重組質(zhì)粒pATC-GGPPS/siRNA經(jīng)Riie I酶切線性化后,用電穿孔法將其與質(zhì)粒 pAdEasy-Ι共同轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BJ5183 (條件電脈沖25 μ F,電壓2.5 kV,電阻200 Ω ), 進(jìn)行同源重組。用he I酶切鑒定同源重組的質(zhì)粒,以電穿孔法將重組子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DHlOa內(nèi),大量制備重組腺病毒質(zhì)粒DNA備用轉(zhuǎn)染。重組腺病毒的包裝和收獲將重組質(zhì)粒用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后 7-10天,出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effects, CPE),表現(xiàn)為貼壁細(xì)胞變圓、核濃縮、 脫落,出現(xiàn)病毒空斑。收集細(xì)胞,反復(fù)凍融3次,離心,收集上清于-70 0C保存?zhèn)溆谩?br>
病毒顆粒濃度的測(cè)定在對(duì)孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)的4孔四3細(xì)胞生長(zhǎng)至90% 匯合時(shí),吸去培養(yǎng)液,加入0.5 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,分別滴加入5、10、30及40 ul的病毒稀釋液(稀釋約500倍),小心混勻,置于含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Ih后,小心加入0.5 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,混勻、培養(yǎng),觀察CPE ;3 d后,待加入5ul病毒稀釋液的孔完全出現(xiàn)CPE現(xiàn)象時(shí),計(jì)數(shù)細(xì)胞并計(jì)算病毒顆粒的濃度。病毒顆粒的濃度=(細(xì)胞數(shù)X 20/病毒稀釋液的體積)X病毒稀釋倍數(shù)。免疫沉淀
取含相同蛋白量(150 μδ)的細(xì)胞裂解液,加入相關(guān)抗體2 μδ,4 ° C輕搖1小時(shí)后,再加入Protein G-agrose珠子30 μ ,在4 ° C,孵育過(guò)夜。離心,棄上清,用洗滌緩沖液(50. 0 mmol/L Tris, 150. 0 0. 1% SDS, 1. 0% NP-40, 1. 0 mmol/L Na3V04, 2.0 mmol/L NaF, 100.0 μ g/ml PMSF, 1.0 μ g/ml Ieup印tin,and 1.0 μ g/ ml aprotinin )洗滌沉淀1次,提高至NaCl濃度至400 mmol/L洗滌第二次,第三次采用原緩沖液洗滌,棄上清。加入等體積2XSDS樣品緩沖液,95° C加熱樣品5 min,通過(guò) SDS-PAGE膠電泳分離,進(jìn)行免疫印跡分析。小鼠禁食12小時(shí)后,腹腔注射葡萄糖(1. 8mg/g),分別在不同時(shí)間點(diǎn)尾部取血,用血糖儀檢測(cè)小鼠血液中葡萄糖含量。小鼠禁食12小時(shí)后,再喂食12小時(shí),尾部取血,檢測(cè)小鼠血液中葡萄糖含量。 實(shí)施例1
胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立
根據(jù)前面“一般材料與方法”一節(jié)的方法,我們誘導(dǎo)建立了胰島素抵抗細(xì)胞模型。在用 TNF-α細(xì)胞因子誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞3天后,采用免疫印跡的方法檢測(cè)胰島素信號(hào)通路中IRS 的酪氨酸磷酸化水平的變化。如圖IA所示。TNF-α細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,IRS的酪氨酸磷酸化水平顯著下降。我們檢測(cè)了胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取的程度。如圖IB所示,胰島素抵抗細(xì)胞在胰島素刺激后葡萄糖攝取的程度顯著下降。上述結(jié)果都表明胰島素抵抗細(xì)胞模型得以成功建立。實(shí)施例2
GGPPS在胰島素抵抗模型中的變化
我們通過(guò)免疫沉淀法檢測(cè)了通過(guò)胰島素刺激后,胰島素抵抗細(xì)胞模型中GGPPS的水平變化。如圖2所示,通過(guò)胰島素的刺激在胰島素抵抗細(xì)胞模型中GGPPS顯著增長(zhǎng)。實(shí)施例3
干擾GGPPS恢復(fù)胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
我們使用上節(jié)“一般材料和方法”中構(gòu)建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒干擾胰島素抵抗細(xì)胞中GGPPS的表達(dá)。在胰島素刺激后的不同時(shí)間點(diǎn),我們檢測(cè)了 p-Erkl/2的水平。 如圖3所示,與對(duì)照相比,在干擾了 GGPPS表達(dá)的胰島素抵抗細(xì)胞中的p-ErklA水平顯著降低。這表明干擾GGPPS恢復(fù)了胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。實(shí)施例4
GGPPS在II型糖尿病人中呈特異性高表達(dá)
我們分別在蛋白質(zhì)水平(圖4A)和mRNA水平(圖4B)上檢測(cè)了 II型糖尿病患者脂肪組織中GGPPS的表達(dá)。如圖4所示,II型糖尿病人中GGPPS的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照。實(shí)施例5
敲除GGPPS提高了小鼠糖耐量
我們按照上節(jié)“一般材料與方法”中的GTT法及ITT法檢測(cè)了 GGPPS-/-雄性小鼠和 GGPPS-/-雄性小鼠的耐糖量。如圖5所示,根據(jù)糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GGPPS-/-雄性小鼠對(duì)于葡萄糖耐受量較GGPPS+/-雄性小鼠更高且對(duì)胰島素敏感性更強(qiáng)。實(shí)施例6
敲除GGPPS提高了小鼠的胰島素敏感性
我們進(jìn)一步檢測(cè)了 GGPPS-/-雄性小鼠和GGPPS-/-雄性小鼠中胰島素通路IRS的磷酸化水平。如圖6所示,檢測(cè)結(jié)果顯示GGPPS-/-小鼠的^S ser612磷酸化程度顯著降低使胰島素敏感性得到恢復(fù),胰島素抵抗癥狀得到緩解。
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權(quán)利要求
1.GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途,其中所述GGPPS拮抗劑增加胰島素敏感性。
3.GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病的增敏藥物中用途。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的用途,其中所述的GGPPS拮抗劑抑制GGPPS基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
5.權(quán)利要求4的用途,其中所述GGPPS拮抗劑包括針對(duì)GGPPS的小干擾RNA。
6.權(quán)利要求5的用途,其中所述小干擾RNA靶向以下序列5’-G⑶⑶CCCAUC腳CAUUA-3,(SEQ ID N0:1)或 5,-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3,(SEQ ID NO:2)。
7.權(quán)利要求6的用途,其中所述小干擾RNA的編碼序列為 5,-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3,(SEQ ID N0:1)。
8.權(quán)利要求7的用途,其中所述GGPPS拮抗劑為表達(dá)所述小干擾RNA的真核表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求8的用途,其中所述真核表達(dá)載體是Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了GGPPS在II型糖尿病藥物治療中的應(yīng)用,尤其提供了GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病藥物中的用途。本發(fā)明首次公開(kāi)了GGPPS基因和蛋白的拮抗劑可以用于制備治療Ⅱ型糖尿病的增敏藥物,有助于提高胰島素把組織對(duì)于胰島素的敏感性,增強(qiáng)胰島素的療效,提高Ⅱ型糖尿病患者的生命質(zhì)量,在Ⅱ型糖尿病治療領(lǐng)域具有潛在、良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102526763SQ20121007910
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者李朝軍, 沈?qū)? 薛斌, 郁曉, 陸克 申請(qǐng)人:南京大學(xué)