專利名稱：肺炎鏈球菌3型多糖的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的改進方法，所述方法涉及加熱或PH調(diào)節(jié)步驟。
背景技術(shù)：
在制備用于預防由有機體的肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)造成的侵入性疾病的多價肺炎球菌結(jié)合疫苗中，使選定肺炎鏈球菌血清型生長以供應制備疫苗所需的多糖。細胞是在大發(fā)酵罐中生長，同時在發(fā)酵結(jié)束時通過添加脫氧膽酸鈉(DOC)或替代溶胞劑來引發(fā)溶胞。然后收集溶胞產(chǎn)物培養(yǎng)液用于下游純化并回收圍繞著細菌細胞的莢膜多糖。與載體蛋白結(jié)合后，多糖包含在最終疫苗產(chǎn)物中并賦予疫苗的目標種群對選定肺炎鏈球菌血清型的免疫性。盡管以此エ藝產(chǎn)生的細胞溶胞產(chǎn)物包含目標多糖，但其還包含大量細胞碎片，其包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)和殘余培養(yǎng)基組份。傳統(tǒng)的處理涉及通過添加こ酸來使溶胞產(chǎn)物的最低限度PH值降低到6. 6以幫助溶胞劑和ー些雜質(zhì)沉淀出。將此物質(zhì)進行離心，隨后過濾以去除標稱尺寸大于O. 45 μ m的大部分固體。然而，所述傳統(tǒng)的處理方法展示最低程度的雜質(zhì)去除，同時隨后難以去除可溶蛋白以符合純化多糖規(guī)定。在針對某些血清型的試驗中，高含量的污染可溶蛋白尤其成問題。ー些血清型、尤其肺炎鏈球菌3型產(chǎn)生大且粘的多糖鏈(例如，對于3型而言，2-3百萬道爾頓(Dalton)的葡萄糖/葡萄糖醛酸的鏈)，當細胞溶胞時這些多糖鏈釋放于生長培養(yǎng)基中。其粘性使其在離心后難以過濾，且在所述情況中，通過純化工藝已不足以去除蛋白質(zhì)且導致試驗失敗。因此，需要用于自復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物、尤其含肺炎鏈球菌3型多糖的溶胞產(chǎn)物去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
提供減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的改進方法。在ー種方法中，將含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物在一定溫度下加熱一定時間以足以使溶胞產(chǎn)物中存在的蛋白質(zhì)變性并使其聚集和沉淀。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)將溶胞產(chǎn)物加熱到至少60°C并保持至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀 '及2)從溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物。在特定實施例中，將溶胞產(chǎn)物加熱到約60°C至約70°C并保持約30分鐘至約50分鐘。在另ー特定實施例中，將溶胞產(chǎn)物加熱到約65°C并保持約40分鐘。在其它實施例中，分離步驟包含使用膜過濾器、尤其O. 45 μ m孔徑膜過濾器 過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー實施例中，分離步驟包含使用深度過濾器來過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー特定實施例中，從溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀物的步驟包含使溶胞產(chǎn)物離心以去除沉淀物。在本發(fā)明另一實施例中，提供一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含涉及溶胞產(chǎn)物或分離物的pH調(diào)節(jié)的步驟。在此實施例中，PH調(diào)節(jié)步驟提高過濾性。在特定實施例中，使溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值在過濾之前增加到至少8. O、特定而言在過濾之前增加到約8. O至約8. 4之間、且更具體地在過濾之前増加到約8. 2。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、尤其O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物或分離物。在另ー實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物或分離物。在本發(fā)明另一實施例中，提供減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含將溶胞產(chǎn)物加熱步驟與涉溶胞產(chǎn)物或通過溶胞產(chǎn)物離心所產(chǎn)生的分離物的PH調(diào)節(jié)的步驟組合。在此實施例中，pH調(diào)節(jié)步驟提高過濾性。因此，在一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)將溶胞產(chǎn)物加熱到至少60°C并保持至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；2)使溶胞產(chǎn)物離心并從溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8. O ;并4)過濾分離物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約60°C至約70°C并保持約30分鐘至約50分鐘、更具體地加熱到約60°C并保持約40分鐘。在另ー實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到介于約8. O至約8. 4之間、具體地約8. 2。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具體地O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在本發(fā)明另一實施例中，提供減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含PH調(diào)節(jié)步驟以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀。在此實施例中，所述方法包含以下步驟1)使所述溶胞產(chǎn)物的PH值降低到約3. O至約5. O以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；2)使所述溶胞產(chǎn)物離心并從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8. O '及4)過濾分離物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前使溶胞產(chǎn)物的pH值降低到約
3.O。在另ー特定實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到介于約8. O至約8. 4之間、更具體地約8. 2。在其它實施例中，pH調(diào)節(jié)步驟以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀進一歩包含將溶胞產(chǎn)物加熱到至少60°C并保持至少30分鐘，更具體地加熱到約60°C至約70°C并保持約30分鐘至約50分鐘，且甚至更具體地加熱到約60°C并保持約40分鐘。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具體地O. 45um孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。


圖I展示來自血清3型溶胞產(chǎn)物在各種加熱條件和保持時間的實驗室研究的多糖產(chǎn)率。數(shù)據(jù)展示為未加熱處理樣品值的百分數(shù)以展示經(jīng)處理樣品的蛋白質(zhì)損失相對百分比(100%相當于無損失)。 圖2展示對于血清3型溶胞產(chǎn)物在各種加熱條件和保持時間下的實驗室研究的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。數(shù)據(jù)展示為未加熱處理樣品值的百分數(shù)以展示經(jīng)處理樣品的蛋白質(zhì)損失相對百分比(100%相當于無損失)。圖3展示時間(左邊)和溫度(右邊)對血清3型溶胞產(chǎn)物中蛋白質(zhì)(頂部)和多糖(PS，底部)濃度的作用的經(jīng)調(diào)節(jié)響應曲線圖?！敖?jīng)調(diào)節(jié)PS%”和“經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)值分別代表多糖和蛋白質(zhì)濃度在不同時間點和溫度點下相對于時間=O分鐘和室溫(其代表蛋白質(zhì)和多糖濃度的100%值)的百分數(shù)。圖4展示由溫度和時間條件繪制的來自血清3型溶胞產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)百分比的等高線圖。剰余可溶蛋白的百分數(shù)展示于曲線圖上的彎曲線條中。在60°C _70°C下保持30-50分鐘的范圍由方框突出顯示。
圖5展示SDS-PAGE凝膠，其展示可溶蛋白自經(jīng)熱處理細胞的溶胞產(chǎn)物的去除。未經(jīng)熱處理的泳道在左邊(IPPPN3-007)且經(jīng)熱處理的泳道在右邊(IPPPN3-011)。圖6展示經(jīng)過相同的沉淀物沉降時間之后比較經(jīng)熱處理(右邊)和未經(jīng)熱處理(左邊)血清3型溶胞產(chǎn)物的照片。圖7展示血清3型分離物的多糖(PS)濃度、蛋白質(zhì)濃度、和相對過濾性隨分離物pH值變化的曲線圖。展示對應于5次試驗的5組條形圖。多糖濃度(mg/mL)和蛋白質(zhì)濃度(g/10L)提供于左邊y軸上。相對過濾性值提供于右邊y軸上，其對應于使約3mL的血清3型分離物通過O. 45 μ m針頭過濾器所需的相對力,其等級為I到5(1 =容易，5 =困難)。圖8展示依據(jù)分離物pH值比較血清3型分離物樣品通過深度過濾器隨時間的流率的曲線圖。流率(y軸)是通過計算每分鐘的過濾比率來測量，其中將時間(以分鐘表示)除以在這一分鐘內(nèi)通過過濾器的分離物的總重量(以克表示)(比率越低，流率越高)。將分離物樣品調(diào)節(jié)至不同PH值(5. O至8. 5)并使其在不同恒定壓力條件(5-20磅/平方英寸(psi))下通過過濾器。
具體實施例方式本發(fā)明提供用于減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的改進方法，所述方法涉及與溶胞后加熱或PH調(diào)節(jié)有關(guān)的步驟。在某些方法中，將溶胞產(chǎn)物在一定溫度下加熱一定時間以足以使溶胞產(chǎn)物中存在的蛋白質(zhì)變性并使其聚集和沉淀。在其它方法中，對溶胞產(chǎn)物、或通過使所述溶胞產(chǎn)物離心所產(chǎn)生的分離物進行PH調(diào)節(jié)以提高過濾性或使蛋白質(zhì)聚集和沉淀。在其它方法中，將加熱和pH調(diào)節(jié)步驟合并以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀以及提高溶胞產(chǎn)物或分離物的過濾性。所述方法允許產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物或分離物。本文所用術(shù)語“實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物”或“實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物”是指已去除蛋白質(zhì)而使得與去除蛋白質(zhì)之前溶胞產(chǎn)物或分離物的蛋白質(zhì)濃度相比溶胞產(chǎn)物或分離物的相對蛋白質(zhì)濃度小于約40 %、約35 %、約30 %、約25 %、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%蛋白質(zhì)的細胞肺炎鏈球菌血清3型溶胞產(chǎn)物或分離物。用于量化細胞溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)濃度的方法已為此項技術(shù)習知且包括(例如)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析、色譜和電泳(參見，例如道池(Deutscher,M. P.)(編輯)的蛋白質(zhì)純化手冊' (Guide to Protein Purification),圣地亞哥(San Diego):美國學術(shù)出版社(Academic Press, Inc. ) (1990))。
在一個實施例中，本發(fā)明提供包含加熱步驟用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法。通過暴露于熱破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)且使其變性而不會影響多糖。隨后，變性蛋白聚集并沉淀，此改良溶胞產(chǎn)物的分離且能夠通過離心或過濾容易地去除固體。此加熱步驟將有效用于自含大量可溶蛋白質(zhì)雜質(zhì)的生物混合物回收或純化任何熱穩(wěn)定多糖且因此可用于其中可溶蛋白含量尚成問題的任何液相(例如，含DNA、RNA、多糖、寡糖、糖、脂肪酸和脂質(zhì)的生物混合物)。因此，在一個實施例中，本發(fā)明提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含以下步驟1)將所述溶胞產(chǎn)物加熱到至少50°C、至少55で、或至少60°C并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；及2)從溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物。在特定實施例中，將溶胞產(chǎn)物加熱到約50°C至約80°C并保持約15-約60分鐘。在另ー特定實施例中，將溶胞產(chǎn)物加熱到約60°C至約70°C之間并保持約30分鐘至約50分鐘。在另ー特定實施例中，將溶胞產(chǎn)物加熱到約65°C并保持約40分鐘。如下文在試驗章節(jié)中更詳細的闡述，對于熱穩(wěn)定血清3型多糖，通過在65°C下加熱40分鐘去除了超過80%的蛋白質(zhì)，同時多糖的損失最少。在其它實施例中，分離步驟包含離心或過濾以去除或減少溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)。特別地，在一個實施例中，分離步驟包含使用膜過濾器、尤其O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー實施例中，分離步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。通常用于高體積過濾エ藝(例如血清3型多糖的純化)的過濾器包括膜(或表面)過濾器和深度過濾器。膜過濾器主要通過尺寸排除起作用，其中欲過濾溶液中大于膜過濾器設(shè)定孔徑的所有雜質(zhì)將截留在過濾器表面上。相反，深度過濾器包含具有使欲過濾溶液通過的隨意多孔結(jié)構(gòu)的纖維或粒狀基質(zhì)，且主要通過在整個基質(zhì)深度上對雜質(zhì)的隨意吸附和機械夾帶起作用。在本發(fā)明方法中，膜過濾器和深度過濾器二者可組合使用，其中深度過濾器收集較大雜質(zhì)而表面過濾器捕獲較小雜質(zhì)。在本發(fā)明另一實施例中，還提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或通過使所述溶胞產(chǎn)物離心所產(chǎn)生的分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含涉及溶胞產(chǎn)物或分離物的PH調(diào)節(jié)的步驟。在此實施例中，pH調(diào)節(jié)步驟提高過濾性。如本文所用，含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物的“過濾性”是指溶胞產(chǎn)物或分離物通過過濾器(例如膜過濾器或深度過濾器)的能力。因此，溶胞產(chǎn)物或分離物的經(jīng)改良過濾性與(例如)以下有關(guān)溶胞產(chǎn)物或分離物通過過濾器的流率増加，使溶胞產(chǎn)物或分離物對過濾器的堵塞減少，或使給定體積的溶胞產(chǎn)物或分離物通過過濾器所需的壓力降低。從含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中去除雜質(zhì)的傳統(tǒng)方法涉及通過添加こ酸使溶胞產(chǎn)物的最低PH值降低到6. 6，隨后連續(xù)離心并濾除大于O. 45 μ m的物質(zhì)。此處理方法展示了最低程度的雜質(zhì)去除，并且隨后在將產(chǎn)物送至純化處理之前很難通過膜過濾器或深度過濾器去除可溶蛋白。然而，本發(fā)明方法涉及以下發(fā)現(xiàn)此高分子量多糖的過濾性可直接隨PH值的改變而改變，且增加溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值可提高過濾 性而多糖血清3型的分子量大小或功能性無明顯損失。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或通過使溶胞產(chǎn)物離心所產(chǎn)生的分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含在過濾之前使分離物或溶胞產(chǎn)物的pH值增加到至少8. O的步驟。在另ー實施例中，使分離物或溶胞產(chǎn)物的PH值在過濾之前增加到約8. O至約8. 4、更具體地約8. 2。溶胞產(chǎn)物或分離物的PH調(diào)節(jié)之后的過濾可涉及使用膜過濾器、尤其O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物或分離物。在另ー實施例中，過濾溶胞產(chǎn)物或分離物可涉及使用深度過濾器。在其它實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含將溶胞產(chǎn)物加熱步驟與涉及溶胞產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)的步驟組合。在一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)將溶胞產(chǎn)物加熱到至少50°C、至少55°C、或至少60°C并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；2)使所述溶胞產(chǎn)物離心并從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8. O ;和4)過濾分離物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約50°C至約80°C并保持約15-約60分鐘。在另ー特定實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約60°C至約70°C并保持約30分鐘至約50分鐘。在其它實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約65°C并保持約40分鐘。在另ー特定實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到約8. O至約8. 4、更具體地約8. 2。在其它實施例中，過濾步驟涉及使用膜過濾器、尤其O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾分離物。在另ー實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在其它實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法，所述方法包含PH調(diào)節(jié)步驟以使蛋白質(zhì)聚集并沉淀。在一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)使所述溶胞產(chǎn)物的PH值降低到小于約5. 0,4. 5、
4.0、3. 5、或3. O、或降低到約3. O至約5. O以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；2)使所述溶胞產(chǎn)物離心并從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8. O ;和4)過濾分離物；其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前使溶胞產(chǎn)物的pH值降低到約3. O。在另ー特定實施例中，在過濾之前使分離物的PH值增加到約8. O至約8. 4之間、更具體地約8. 2。在特定實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具體地O. 45 μ m孔徑膜過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在另ー實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產(chǎn)物以去除沉淀物。在其它實施例中，用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的方法包含PH調(diào)節(jié)步驟以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀，其進ー步包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到至少50°C、至少55°C或至少60°C并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集并沉淀。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約50°C至約80°C并保持約15-約60分鐘。在另ー特定實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約60°C至約70°C并保持約30分鐘至約50分鐘。在其它實施例中，在離心之前將溶胞產(chǎn)物加熱到約65°C并保持約40分鐘。提供以下實例以舉例說明而非加以限制。試驗肺炎鏈球菌3型產(chǎn)生極大且粘的多糖，當細胞溶胞時所述多糖釋放于生長培養(yǎng)基 中。此溶胞目前是在發(fā)酵結(jié)束時利用脫氧膽酸鈉(DOC)來誘導。3型多糖看起來在寬溫度和PH值范圍內(nèi)極其穩(wěn)定；然而，其粘性使其在離心后難以過濾，此導致無細胞培養(yǎng)液(CFB)的回收率低。以下實例闡述關(guān)于溶胞后加熱以使蛋白質(zhì)變性并沉淀出以及PH調(diào)節(jié)以提高溶胞產(chǎn)物過濾性的研究。實例I.加熱步驟實施用于肺炎鏈球菌血清3型回收的加熱步驟是受需要在純化步驟之前降低蛋白質(zhì)負載的驅(qū)使。經(jīng)純化多糖的批料易于因殘余蛋白質(zhì)含量高于5% w/w蛋白質(zhì)/多糖的設(shè)定規(guī)定含量而使得批料不合格。因此實施以下試驗研究以表征在肺炎鏈球菌血清3型的純化和回收中使用加熱步驟 的有效性和范圍。包括此加熱步驟的目的是使蛋白質(zhì)含量減少同時維持高多糖含量。在實驗室中，將從中試設(shè)備試驗獲得的發(fā)酵細胞溶胞產(chǎn)物物質(zhì)按等份加入獵鷹(Falcon) 試管(碧迪生物科學公司(BD Biosciences)，貝德福德(Bedford)，麻薩諸塞州(MA))中并在水浴中加熱到不同溫度。所研究的溫度從50°C至80°C，同時保持時間從15分鐘至240分鐘。將對照樣品置于周圍室溫(約21°C)下。然后使所有樣品在周圍條件下過夜，之后將樣品離心并使其通過O. 45 μ m針頭過濾器(HTTuffryn 膜25mm針頭過濾器，低蛋白質(zhì)結(jié)合，頗爾生命科學(Pall Life Sciences), Anne Arbor, MI)以提供用于多糖和蛋白質(zhì)分析的物質(zhì)。實驗數(shù)據(jù)是由統(tǒng)計軟件包(Cornerstone ,來自應用系統(tǒng)科技公司(AppliedSystems Technologies, Inc. ), Dunnellon, FL)來分析以確定溫度和時間對多糖和蛋白質(zhì)含量的影響。多糖和蛋白質(zhì)分析多糖分析是通過HPLC-SEC(高效液相色譜-尺寸排除柱)使用此項技術(shù)中已知的標準方法來實施(參見例如，艾吉拉(Aquilar，Μ.) “肽和蛋白質(zhì)的HPLC :方法和方茱(HPLC of Peptides and Proteins Methods and Protocols)，，，Totowa, NJ HumanaPress (2004) )0圖I展示來自不同加熱時間的實驗室研究的多糖產(chǎn)率。所報告的數(shù)據(jù)是對照多糖含量的百分數(shù)，其中100%表示無損失。如圖I中所示，多糖產(chǎn)率相對于加熱時間和溫度而言穩(wěn)定。還收集了中試規(guī)模數(shù)據(jù)且在圖I中以“IPP”縮寫標明的數(shù)據(jù)點展示。所列出的時間反映了加熱時期、在所標明狀態(tài)下的加熱保持時期、和冷卻時期。與在實驗室中進行加熱相反，這些樣品是在實際發(fā)酵罐中熱處理之后獲得。在以中試規(guī)模測試的溫度和時間范圍內(nèi)(30-50分鐘和60°C至70°C )，多糖損失在0-18%范圍內(nèi)，其中大多數(shù)測試的損失為10%或更少。這在此物質(zhì)下游處理的可接受范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)分析是通過使用此項技術(shù)中已知的標準SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法來實施(參見例如，沃可(Walker，J. Μ.) “蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(TheProtein Protocols Handbook) ”Totowa, NJ :Humana Press (2002))。凝膠的分析是借助凝膠成像系統(tǒng)(具有Labworks V. 3軟件的UVP成像儀，UVP公司，厄普蘭德，加利福尼亞州(Upland, CA))以針對蛋白質(zhì)標準物解釋總帶(泳道)密度。如圖2中所示，以實驗室規(guī)模和中試規(guī)模(以“IPP”縮寫標明的數(shù)據(jù)點)研究從50°C至80°C的溫度。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)展示為未經(jīng)加熱處理樣品的對照值的百分數(shù)以展示經(jīng)處理樣品的蛋白質(zhì)損失相對百分比。通過在60°C的溫度下進行熱沉淀，15分鐘的加熱時間足以去除60%的可溶蛋白(參見圖2)。盡管在50°C和55°C下出現(xiàn)明顯蛋白質(zhì)減少，但由于在60°C下蛋白質(zhì)去除量較高故將此溫度設(shè)定為中試設(shè)備作業(yè)的最低溫度。
圖3展示由時間和溫度繪制的蛋白質(zhì)和多糖濃度的經(jīng)調(diào)節(jié)響應曲線圖。所展示的數(shù)據(jù)代表蛋白質(zhì)和多糖濃度在不同時間點和溫度點下相對于時間=O分鐘和室溫(其代表蛋白質(zhì)和多糖的100%值)的百分數(shù)。如圖3中所示，保持溫度對可溶蛋白去除具有重要影響，而保持超過15分鐘的持續(xù)時間并不重要。對于多糖(PS)產(chǎn)率而言，時間和溫度二者皆對PS損失展示有限的影響(く 20%損失，這是下游處理可接受的)。圖4展示由溫度和時間條件繪制的來自血清3型溶胞產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)百分比的等高線圖。剰余可溶蛋白的百分數(shù)展示于曲線圖上的彎曲線條中。60°C-7(TC下保持30-50分鐘的范圍由方框突出顯示且代表經(jīng)選定用于實施本文所述的加熱步驟的優(yōu)選范圍。然而，如上文所述，還分析了更寬的范圍且所述范圍也展示有效。圖5展示以中試規(guī)模測試加熱步驟之后可溶蛋白的SDS-PAGE凝膠。左邊的凝膠展示來自無加熱步驟的中試規(guī)模發(fā)酵批料(IPPPN3-007)的結(jié)果且展示整個回收過程的完整蛋白質(zhì)含量(pH調(diào)節(jié)前、pH調(diào)節(jié)后、離心后、和pH調(diào)節(jié)后的罐)。“pH調(diào)節(jié)后的罐”是指在過濾之前調(diào)節(jié)至給定PH值之后從分離物貯存罐中取出的樣品。使用100千道爾頓(KD)切向流純化超濾(UF)處理去除小于100KD的溶質(zhì)，其是通過使用連續(xù)循環(huán)和過濾而逐漸用緩沖溶液代替初始懸浮介質(zhì)并隨后濃縮溶液來實施。此UF處理步驟之后，據(jù)報告批料IPPPN3-007的蛋白質(zhì)含量為31%蛋白質(zhì)/多糖(以w/w計)。整個純化處理之后的最終蛋白質(zhì)含量為9. 9% (相對于多糖的w/w)，這使得所述批料不符合最終批料濃縮物(FBC)中的蛋白質(zhì)< 5%的規(guī)定。對于批料IPPPN3-011，在溶胞產(chǎn)物保持之后且在下游處理之前包括60°C下保持30分鐘的加熱步驟。100K UF過濾之后的蛋白質(zhì)含量為6.7%，且FBC蛋白質(zhì)含量為2. 5%，其符合FBC藥物中間體規(guī)定。如圖5中右邊的凝膠圖像所示，在回收作業(yè)期間的加熱步驟使得蛋白質(zhì)含量顯著降低。關(guān)于此加熱步驟的中試規(guī)模數(shù)據(jù)的匯總還展示在表I中。試驗-001、-004、-005、-007和-013未使用加熱步驟。在這些試驗中，僅-001和-004符合≤5% w/w的目標蛋白質(zhì)規(guī)定，此表明純化處理依舊難以除去UF處理步驟后的20%至35%的蛋白質(zhì)負載。如表I中試驗-011、-012、-014、-015和-017所示納入加熱保持步驟，UF處通步驟之后蛋白質(zhì)負載降低到3. I %至6. 7%,其中純化多糖中的最終蛋白質(zhì)含量為O. 6%至 2. 5%。表I.在各種加熱條件和保持時間下超濾之后和最終批料濃縮物(FBC)中的蛋白質(zhì)百分比
權(quán)利要求
1.一種制備多價肺炎球菌結(jié)合疫苗的方法包括用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的步驟,所述步驟包含 a)將所述溶胞產(chǎn)物加熱到50°C至80°C并保持15至60分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀；及 b)從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀物； 其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到60°C至70°C。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱30分鐘至50分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到65°C并保持40分鐘。
5.如權(quán)利要求I至4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)包含過濾所述溶胞產(chǎn)物以自所述溶胞產(chǎn)物中去除沉淀物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溶胞產(chǎn)物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45 y m孔徑膜過濾器。
8.如權(quán)利要求I至4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)包含使所述溶胞產(chǎn)物離心以自所述溶胞產(chǎn)物中去除沉淀物。
9.一種制備多價肺炎球菌結(jié)合疫苗的方法包括用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的步驟，所述步驟包含 a)使所述溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值增加到8.0至8. 4 ;及 b)過濾所述溶胞產(chǎn)物或分離物； 其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物或分離物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中在過濾之前使所述溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值增加到 8. 2。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述溶胞產(chǎn)物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45 y m孔徑膜過濾器。
13.一種制備多價肺炎球菌結(jié)合疫苗的方法包括用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的步驟，所述步驟包含 a)將所述溶胞產(chǎn)物加熱到50°C至80°C并保持15至60分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀； b)使所述溶胞產(chǎn)物離心并從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物； c)使所述分離物的pH值增加到8.0至8. 4 ;及 d)過濾所述分離物； 其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到60°C至70°C。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱30分鐘至50分鐘。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到60°C并保持40分鐘。
17.如權(quán)利要求13至16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到8. 2。
18.如權(quán)利要求13至16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟d)包含使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾所述分離物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45孔徑膜過濾器。
20.一種制備多價肺炎球菌結(jié)合疫苗的方法包括用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的步驟，所述步驟包含 a)使所述溶胞產(chǎn)物的pH值降低到3.0至5. 0以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀； b)使所述溶胞產(chǎn)物離心并從所述溶胞產(chǎn)物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生分離物； c)使所述分離物的pH值增加到8.0至8. 4 ;及 d)過濾所述分離物； 其中產(chǎn)生實質(zhì)上純的含血清3型多糖的分離物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中步驟a)包含使所述溶胞產(chǎn)物的pH值降低到3.0以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到8.2。
23.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述分離物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45 y m孔徑膜過濾器。
25.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到50°C至80°C并保持15至60分鐘。
26.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到60。。至 70。。。
27.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱30分鐘至50分鐘。
28.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產(chǎn)物加熱到60°C并保持40分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)溶胞產(chǎn)物或分離物中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的改進方法，所述方法涉及與溶胞后加熱或pH調(diào)節(jié)有關(guān)的步驟。在某些方法中，將所述溶胞產(chǎn)物在一定溫度下加熱一定時間，所述溫度和時間足以使所述溶胞產(chǎn)物中存在的蛋白質(zhì)變性并使其聚集和沉淀。在一個實施例中，將所述溶胞產(chǎn)物加熱到至少60℃并保持至少30分鐘以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀，更具體地加熱到約60℃至約70℃并保持約30分鐘至約50分鐘，且甚至更具體地加熱到約65℃并保持約40分鐘。在其它方法中，使所述溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值增加到至少8.0、更具體地約8.0至8.4且甚至更具體地約8.2以提高過濾性。在其它方法中，將加熱和pH調(diào)節(jié)步驟組合以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀，以及提高溶胞產(chǎn)物或分離物的過濾性。在其它方法中，使所述溶胞產(chǎn)物或分離物的pH值降低到約3.0至約5.0以使蛋白質(zhì)聚集和沉淀。所述方法允許制造實質(zhì)上純的含血清3型多糖的溶胞產(chǎn)物或分離物。
文檔編號A61K39/116GK102648979SQ201210083999
公開日2012年8月29日 申請日期2007年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日
發(fā)明者埃里克·赫勒·休斯, 布賴恩·道格拉斯·巴勒爾, 李初順 申請人:惠氏公司