專利名稱：一種水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁共振造影劑的制備方法，具體為一種水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法，以及這種造影劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)是繼CT之后醫(yī)學(xué)影像診斷技術(shù)的又一大發(fā)展。利用核磁共振原理，依據(jù)所釋放的能量在物質(zhì)內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)環(huán)境中不同的衰減，通過外加梯度磁場檢測所發(fā)射出的電磁波，即可得知構(gòu)成這一物體原子核的位置和種類,據(jù)此可以繪制成物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像。磁共振成像具有組織分辨率高、成像參數(shù)多、使用安全等突出優(yōu)點(diǎn)，可對人體各部位多角度、多平面成像，其分辨力高，能更客觀更具體地顯示人體內(nèi)的解剖組織及相鄰關(guān)系，對病灶能更好地進(jìn)行定位定性，對全身各系統(tǒng)疾病 的診斷，尤其是早期腫瘤的診斷和基礎(chǔ)研究方面有著巨大的價值和應(yīng)用潛力。雖然MRI有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)過大量臨床病例顯示，在良、惡腫瘤組織與正常組織之間，往往信號強(qiáng)度相差不大，達(dá)不到診斷的目的。為了改變病變局部的信號強(qiáng)度，提高M(jìn)RI診斷的敏感性和特異性，醫(yī)學(xué)檢測中通常應(yīng)用MRI造影劑來實(shí)現(xiàn)。因此，研制高靈敏度和良好生物相容性的MRI造影劑具有重要意義。磁共振造影劑可用來縮短質(zhì)子的弛豫時間，間接地改變質(zhì)子所產(chǎn)生的信號強(qiáng)度、提高成像對比度和清晰度，更好的對器官的病變進(jìn)行診斷。按照造影劑中以縮短Tl弛豫時間為主(使磁共振信號增加)或以縮短T2弛豫時間為主(使磁共振信號下降)，可將磁共振造影劑分為Tl弛豫增強(qiáng)造影或T2弛豫增強(qiáng)造影。一般作為藥物應(yīng)用于人體的MRI造影劑除了要滿足藥物的一些基本要求，具有生物相容性，水溶性好和自身有好的穩(wěn)定性外，還要有高的弛豫率，毒副作用低和在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)拇媪魰r間。由于Mn2+有5個未成對電子，自旋磁矩比較大，電場對稱，弛豫效率高等特點(diǎn)，錳材料引起了科學(xué)研究者的廣泛關(guān)注。而氧化錳納米粒子就是近年來發(fā)展起來的一種新型的Tl弛豫增強(qiáng)造影劑。它具有很強(qiáng)的弛豫增強(qiáng)時間，只需要很小的劑量就可以在正常的肝臟，腎臟和病變間產(chǎn)生明顯的變化。絕大多數(shù)氧化錳是球形的納米粒子，粒徑較小。由于其粒徑小，分散均一等特點(diǎn)，這種造影劑經(jīng)靜脈給藥后易于直接進(jìn)入細(xì)胞，不會直接被體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞吞噬，在較大程度上維持了造影劑的效果。而應(yīng)用于人體的造影劑要求生物相容性，水溶性好，而且自身穩(wěn)定性要好，基于以上要求，制備一種具有高弛豫效率、生物相容性，水溶性好，自身穩(wěn)定的造影劑是很必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種方法簡單，快速、成本低的水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供這種磁共振造影劑的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法，具體步驟為I)油酸錳的制備將7. 5-8g的氯化錳和24. 0-24. 5g的油酸鈉加入到由140mL乙醇、水和正己醇組成的混合液中，在70°C條件下攪拌過夜；得到的溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用去離子水洗幾次，得到上層暗紅色有機(jī)物，將有機(jī)物轉(zhuǎn)移到燒瓶中，蒸餾除去正己醇，得到深紅色油酸錳固體；
2)油性氧化錳的制備稱量1-1. 5g油酸錳固體置于三頸燒瓶中，向三頸燒瓶中加入IOg的十八烯溶液，使得油酸錳完全溶解在十八烯中，在70°C條件下抽Ih真空除去水和空氣；然后將混合物攪拌加熱至300°C，在此溫度下反應(yīng)l_2h，將反應(yīng)物冷卻至室溫，加入正己烷分散反應(yīng)物，然后再加入丙酮溶液，得到沉淀物，通過離心，充分洗滌后，得到棕褐色的油性氧化錳；3)水溶性氧化錳的制備稱取O. 5-1. Omg的氧化錳，加入ImL的氯仿，分散均勻于離心管中。在渦旋條件下，將O. 2g/mL的十六烷基三甲基溴化銨溶液逐滴加入離心管中，得到渾濁的棕色溶液，除去氯仿，得到澄清的棕色氧化錳溶液；按體積比I : I將PSS逐滴加入氧化錳溶液中，攪拌反應(yīng)4h，離心處理，重新分散在去離子水中；再按體積比I : I將PVP溶液加入到的氧化錳溶液中，攪拌過夜；最后離心處理，收集氧化錳粒子，分散在磷酸緩沖液中備用。本發(fā)明設(shè)計了一種經(jīng)聚合物功修飾的超順磁性水溶性氧化錳磁共振造影劑。即首先將油酸錳和十八烯混合均勻通過高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽淞顺槾判杂托匝趸i納米粒子，然后油-水轉(zhuǎn)相將油溶性的氧化錳轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘难趸i，最后通過表面聚合物包裹，制成水溶性氧化錳納米粒子。水溶性氧化錳納米粒子作為一種新型的核磁共振造影劑轉(zhuǎn)染于體外培養(yǎng)的K652癌細(xì)胞，顯示了其增強(qiáng)MRI成像效果。通過小鼠尾靜脈注射，對其進(jìn)行MRI成像效果分析，顯示了很好的MRI增強(qiáng)效果。這種水溶性的氧化錳納米粒子具有很好的弛豫效率，可以明顯縮短組織的Tl弛豫時間，提高成像的對比度。本發(fā)明通過I、將油酸錳與十八烯混合均勻，通過高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽溆腿苄缘难趸i納米粒子，制備的納米粒子粒徑小，大小均一，分散均勻，而且有很高的產(chǎn)率。2、利用表面活性劑通過油-水轉(zhuǎn)相將油溶性的氧化錳納米粒子轉(zhuǎn)換成水溶性的納米粒子，轉(zhuǎn)換之后，粒子的大小保持不變，分散均一。為了降低氧化錳納米粒子的毒性，增加其生物相容性，在其表面進(jìn)行聚合物的進(jìn)一步修飾。通過靜電吸附層層組裝技術(shù)將聚合物組裝到粒子表面，然后通過聚合物自身成膜作用在納米粒子表面形成一層穩(wěn)定的薄膜，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，水溶性和生物相容性。制備氧化錳納米粒子在去離子水，磷酸緩沖液，生理鹽水，細(xì)胞培養(yǎng)液，乙醇中均能很好分散且穩(wěn)定存在。3、將制備的氧化錳納米粒子溶液加入到對數(shù)生長期的K562細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)6h后，與未加入納米粒子的空白的K562細(xì)胞相比較，用醫(yī)用磁共振儀進(jìn)行掃描檢測到明顯的T1信號增強(qiáng)。4、將制備的水溶性氧化錳納米粒子通過尾靜脈注射注射到小鼠體內(nèi)，觀察小鼠的肝臟，腎臟，腦部等器官的Tl變化，發(fā)現(xiàn)各器官在不同時間有不同的Tl信號增強(qiáng)。本發(fā)明的造影劑制備方法簡單，快速、成本低。上述水溶性氧化錳納米粒子具有毒性小、水溶性好、生物相容性、弛豫效率高等特點(diǎn)。針對不同的生物體系以水溶性氧化錳納米粒子作為造影劑為腫瘤及疾病的診斷嘗試了一種新途徑。


圖I為本發(fā)明不同階段的TEM ;其中圖IA為油性氧化錳；圖IB為CTAB修飾的氧化錳；圖IC為水溶性氧化錳；圖2為水溶性氧化錳納米粒子在不同溶液中穩(wěn)定性；其中圖2A為乙醇；圖2B為去離子水；圖2C為磷酸緩沖液；圖2D為O. 9%的生理鹽水；圖2E為1640細(xì)胞培養(yǎng)液；圖3為MTT法測試水溶性氧化錳納米粒子的生物相容性。圖4為不同物質(zhì)的MRI圖像；其中，圖4a為去離子水；圖仙為K562細(xì)胞；圖4(為 與氧化錳納米粒子孵育的K562細(xì)胞；圖4d為氧化錳納米粒子；圖5為小鼠腎臟和腦部不同時間的MRI圖像；其中圖5A為小鼠腎臟不同時間的MRI圖像；圖5B為小鼠腦部不同時間的MRI圖像。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。一、實(shí)驗(yàn)藥品油酸鈉、油酸、十八烯、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯仿、聚苯磺酸鈉(PSS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)二、油酸錳的制備將7. 5-8g的氯化錳和24. 0-24. 5g的油酸鈉加入到由140mL乙醇、水和正己醇組成的混合液中，在70°C條件下攪拌過夜。得到的溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用去離子水洗幾次，得到上層暗紅色有機(jī)物，將有機(jī)物轉(zhuǎn)移到燒瓶中，蒸餾除去正己醇，得到深紅色油酸錳固體。三、油性氧化錳的制備稱量1-1. 5g油酸錳固體置于三頸燒瓶中，向三頸燒瓶中加入IOg的十八烯溶液，使得油酸錳完全溶解在十八烯中，在70°C條件下抽Ih真空除去水和空氣；然后將混合物攪拌加熱至300°C，在此溫度下反應(yīng)l_2h，將反應(yīng)物冷卻至室溫，加入正己烷分散反應(yīng)物，然后再加入丙酮溶液，得到沉淀物，通過離心，充分洗滌后，得到棕褐色的油性氧化錳。四、水溶性氧化錳的制備稱取O. 5-1. Omg的氧化錳，加入ImL的氯仿，分散均勻于離心管中。在渦旋條件下，將O. 2g/mL的十六烷基三甲基溴化銨溶液逐滴加入離心管中，得到渾濁的棕色溶液，除去氯仿，得到澄清的棕色氧化錳溶液；按體積比I : I將PSS逐滴加入氧化錳溶液中，攪拌反應(yīng)4h，離心處理，重新分散在去離子水中；再按體積比I : I將PVP溶液加入到的氧化錳溶液中，攪拌過夜；最后離心處理，收集氧化錳粒子，分散在磷酸緩沖液中備用。由圖2可以看出經(jīng)過數(shù)天后還能均勻分散，保持穩(wěn)定。五、K562細(xì)胞的培養(yǎng)K562細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。K562細(xì)胞在含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。
六、水溶性氧化錳納米粒子細(xì)胞毒性測試取對數(shù)生長期的k562細(xì)胞，計數(shù)，均勻接種細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液200 μ L (含5000 6000個細(xì)胞)，每個濃度組設(shè)六個復(fù)孔，加入不同濃度梯度(0，5，10，25，50，100，150mg/L)的水溶性氧化錳納米粒子，置于37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)24h后，每孔加入20 μ LMTT溶液繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μ LDMSO,震蕩lOmin，使MTT藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于495nm處檢測各孔的吸光值(OD值)，并以未接種細(xì)胞只加培養(yǎng)基孔的吸光值為空白對照調(diào)零，取六孔平均值，得到細(xì)胞存活率與樣品濃度的關(guān)系(如圖3)。從圖3中可以看出水溶性氧化錳納米粒子具有良好的生物相容 性,適用于生物體系中。七、水溶性氧化錳納米粒子造影劑作用于K562細(xì)胞后Tl信號增強(qiáng)的測定將一定濃度的水溶性氧化錳納米粒子加入對數(shù)期生長的K562細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)6h，離心收集，用PBS緩沖液洗三次，用O. 5%瓊脂糖均勻分散。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，作為陰性對照。將相同濃度的氧化錳納米粒子用O. 5%瓊脂糖均勻分散，作為對照。臨床磁共振診斷儀在3. OT下分別檢測其Tl信號增強(qiáng)強(qiáng)度。從圖4可以看出，與未經(jīng)任何處理的K562細(xì)胞相比，加入氧化錳納米粒子培養(yǎng)的K562細(xì)胞具有明顯的Tl信號增強(qiáng)。由此說明水溶性氧化錳納米粒子可以作為一種很好磁共振造影劑，用于病變組織的磁共振成像診斷。八、水溶性氧化錳納米粒子作用于體內(nèi)后Tl信號增強(qiáng)檢測取平行試驗(yàn)組小鼠6只，麻醉，臨床磁共振診斷儀在3. OT下檢測其Tl信號，然后通過尾靜脈注射一定量的氧化錳納米粒子溶液，觀察30min，lh，2h，4h，16h，27h的Tl信號變化(如圖5)。通過觀察，注入納米粒子之后，小鼠的腎臟，腦部隨著時間的變化其Tl信號值也在不斷的變化，說明水溶性氧化錳納米粒子可以作為一種很好的磁共振造影劑應(yīng)用于成像診斷。由圖5A可以看出隨著時間的增長，腎臟的Tl信號逐漸增；由圖5B可以看出在4h的時候Tl信號達(dá)到最大值。
權(quán)利要求
1.水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法，具體步驟為 1)油酸錳的制備 將7. 5-8g的氯化錳和24. 0-24. 5g的油酸鈉加入到由140mL乙醇、水和正己醇組成的混合液中，在70°C條件下攪拌過夜；得到的溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用去離子水洗幾次，得到上層暗紅色有機(jī)物，將有機(jī)物轉(zhuǎn)移到燒瓶中，蒸餾除去正己醇，得到深紅色油酸錳固體； 2)油性氧化錳的制備 稱量1-1. 5g油酸錳固體置于三頸燒瓶中，向三頸燒瓶中加入IOg的十八烯溶液，使得油酸錳完全溶解在十八烯中，在70°C條件下抽Ih真空除去水和空氣；然后將混合物攪拌加熱至300°C，在此溫度下反應(yīng)l_2h，將反應(yīng)物冷卻至室溫，加入正己烷分散反應(yīng)物，然后再加入丙酮溶液，得到沉淀物，通過離心，充分洗滌后，得到棕褐色的油性氧化錳； 3)水溶性氧化錳的制備 稱取O. 5-1. Omg的氧化錳，加入ImL的氯仿，分散均勻于離心管中。在渦旋條件下，將O.2g/mL的十六烷基三甲基溴化銨溶液逐滴加入離心管中，得到渾濁的棕色溶液，除去氯仿，得到澄清的棕色氧化錳溶液；按體積比I : I將PSS逐滴加入氧化錳溶液中，攪拌反應(yīng)4h，離心處理，重新分散在去離子水中；再按體積比I : I將PVP溶液加入到的氧化錳溶液中，攪拌過夜；最后離心處理，收集氧化錳粒子，分散在磷酸緩沖液中備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法得到的水溶性氧化錳磁共振造影劑，其特征在于應(yīng)用于制備腫瘤及疾病的診斷過程中的造影劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水溶性氧化錳磁共振造影劑的制備方法及其應(yīng)用，它經(jīng)聚合物功修飾的超順磁性水溶性氧化錳磁共振造影劑。即首先將油酸錳和十八烯混合均勻通過高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽淞顺槾判杂托匝趸i納米粒子，然后油-水轉(zhuǎn)相將油溶性的氧化錳轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘难趸i，最后通過表面聚合物包裹，制成水溶性氧化錳納米粒子。水溶性氧化錳納米粒子作為一種新型的核磁共振造影劑轉(zhuǎn)染于體外培養(yǎng)的K652癌細(xì)胞，顯示了其增強(qiáng)MRI成像效果。通過小鼠尾靜脈注射，對其進(jìn)行MRI成像效果分析，顯示了很好的MRI增強(qiáng)效果。這種水溶性的氧化錳納米粒子具有很好的弛豫效率，可以明顯縮短組織的T1弛豫時間，提高成像的對比度。
文檔編號A61K49/18GK102614533SQ201210086840
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者季玉玄, 賈能勤 申請人:上海師范大學(xué)