專利名稱：蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，即人體免疫系統(tǒng)攻擊自身的組織。全球約有5 8%的人口受到約40多種自身免疫性疾病的威脅，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞病、自身免疫性甲狀腺病和I型糖尿病等。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中免疫系統(tǒng)攻擊病患的關(guān)節(jié)部位，多發(fā)性硬化癥是神經(jīng)細(xì)胞的神精髓鞘(myelin sheaths)受到攻擊。這些疾病涉及全身一種或多種組織和器官，嚴(yán)重影響人體健康及生命。針對自身免疫性疾病，目前無有效療法，且病情反復(fù)發(fā)作。目前常用對抗自體免疫性疾病的方法，一是利用類固醇來減緩因免疫系統(tǒng)攻擊組織所造成的炎癥反應(yīng)，二是使用免疫抑制藥物，抑制免 疫系統(tǒng)的作用，但這兩種方法都會造成嚴(yán)重的副作用，而且都只能減緩病情的發(fā)展速度，不能根治疾病。為了改變自身免疫性疾病藥物治療的落后現(xiàn)狀，急需探索新的疾病預(yù)防和治療方法。原始(naive ) T細(xì)胞被特異性的抗原物質(zhì)激活后，進(jìn)行增殖和分化，一般形成在功能上各異的兩類細(xì)胞，即效應(yīng)型記憶T細(xì)胞(effector memory, TEM)和中央型記憶T細(xì)胞(central memory, TCM)。研究表明，多種自身免疫性疾病與TEM細(xì)胞的激活密切相關(guān)。在人體T細(xì)胞膜上存在兩種鉀通道，一種是電壓門控鉀通道Kvl. 3，另一種是中等電導(dǎo)鈣激活鉀通道IKCal。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鉀通道Kvl. 3在不同類型T細(xì)胞上具有顯著的時空表達(dá)差異性，當(dāng)T細(xì)胞被激活后，只有發(fā)揮自身免疫功能的TEM細(xì)胞可顯著地表達(dá)1500 2000個Kvl. 3鉀通道。這種鉀通道Kvl. 3高表達(dá)情況相繼在患不同自身免疫性疾病的病人的TEM細(xì)胞中得到證實(shí)。因此，T細(xì)胞膜上鉀通道Kvl. 3給治療自身免疫性疾病帶來新的希望[J. Clin. Invest.，2003，111 :1703 ；Immunity,2008，29 :602]。有機(jī)小分子藥物首先受到更多的關(guān)注。如Merck公司、澳大利亞Walter and ElizaHall藥物研發(fā)中心、美國加利福尼亞大學(xué)等機(jī)構(gòu)篩選、分離、合成、改造和鑒定了大量的有機(jī)小分子藥物候選物[Mol. Pharmacol, 2004,65 :1364 ;Journal of Medicinal Chemistry,2006,49 (4) :1433 ；MoI. Pharmacol, 2005,68 :1254]。但有機(jī)小分子候選藥物幾乎均作用鉀通道Kvl. 3和其它相似鉀通道，因而極可能造成作用較強(qiáng)的毒副反應(yīng)，如有機(jī)小分子藥物作用同源Kvl. UKvl. 2,Kvl. 4,Kvl. 5等活性比Kvl. 3通道低2 70倍。篩選設(shè)計(jì)多肽成為新的趨勢。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥常用“以毒攻毒”的策略治療人類的疑難雜癥，有毒動物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首選?，F(xiàn)代研究已表明這些有毒動物的毒液中富含動物活性多肽，這些多肽可特異性作用細(xì)胞膜上離子通道。當(dāng)今，這些動物活性多肽已成為全球競爭研發(fā)的重要藥物資源[Nat. Rev. Drug. Discov. 2003 2 :63]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供穩(wěn)定的治療自身免疫性疾病的蝎活性多肽。本發(fā)明通過篩選我國蝎活性多肽基因庫，得到了許多具有重要藥用前景的多肽基因，通過已建立的計(jì)算機(jī)輔助篩選與設(shè)計(jì)技術(shù)[Biophysical Journal, 2004,87 :105 ；Proteins, 2008, 70 :744 ;Journal ofProteome Research, 2010,9 :3118],虛擬篩選至Ij 3 個可能特異性作用鉀通道Kvl. 3的蝎活性肽新基因。通過基因工程技術(shù)，獲得了三種蝎活性多肽，這三種蝎活性多肽分子內(nèi)均含有3對二硫鍵，在體外穩(wěn)定性強(qiáng)，易于長期保存。根據(jù)蝎活性多肽在分類學(xué)上的結(jié)構(gòu)特征，三者屬于同一亞型的a-KTX家族，且都作用于鉀通道Kvl. 3。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :I所示氨基酸序列的蝎活性肽，命名為ADC-I。本發(fā)明還提供了具有通過在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加 一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明也提供了編碼蝎活性多肽ADC-I的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定多肽的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。同時本發(fā)明提供了具有編碼ADC-I的DNA分子的載體。其中，作為優(yōu)選，所述載體為具有可以編碼ADC-I的DNA分子的pGEX-6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQIDNO 2所示核苷酸序列的pGEX-6p-l。本發(fā)明也提供了所述蝎活性多肽ADC-I的制備方法，包括步驟I :獲取具有可以編碼SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列的DNA分子；步驟2 :將步驟I所獲得的DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；步驟3 :誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，分離純化表達(dá)的融合蛋白。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶切具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的載體或以具有編碼所述蝎活性多肽的DNA分子的cDNA為模板PCR擴(kuò)增。在一個實(shí)施方案中，制備方法步驟I具體為以具有編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述表達(dá)載體包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和PMAL系列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體為pGEX系列中的pGEX-6p-l。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌表達(dá)菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為Rosetta(DE3)菌株。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述蝎活性多肽ADC-I可特異性作用于鉀通道Kvl. 3，并可在大鼠動物水平有效地治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。因此本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，所述鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病包括自身免疫性疾病，具體為多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。


圖I示重組蝎活性多肽ADC-I及其GST融合表達(dá)蛋白的電泳檢測圖，其中，泳道I為蛋白質(zhì)分子量Marker ；2泳道為ADC-I未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞蛋白；泳道3為ADC-I經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞蛋白；泳道4為親和層析后的融合蛋白GST-ADC-I ;泳道5為超濾脫鹽濃縮后的融合蛋白GST-ADC-I ;泳道6為融合蛋白GST-ADC-I經(jīng)EK酶切后的產(chǎn)物；泳道7為經(jīng)HPLC分離純化的ADC-I多肽；圖2示重組蝎活性多肽ADC-I與GST蛋白質(zhì)的色譜分離純化圖；圖3示重組蝎活性多肽ADC-I質(zhì)譜分析圖；圖4示InM蝎活性多肽ADC-1對鉀通道Kvl. 3電流的抑制示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過篩選我國蝎活性多肽基因庫，利用基因工程技術(shù)，獲得了三種新型蝎活性多肽，分子內(nèi)均具有3對二硫鍵，在體外穩(wěn)定性強(qiáng)，易于長期保存。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :I所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名為ADC-I。本發(fā)明還提供了具有通過在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定多肽的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。同時本發(fā)明提供了具有編碼多肽ADC-I的DNA分子的載體。在一個實(shí)施方案中，所述載體為具有可以編碼所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子的pGEX-6p-l。更優(yōu)選地是，所述載體為具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。為了制備本發(fā)明所述蝎活性多肽，本發(fā)明也提供了所述蝎活性多肽的制備方法，包括步驟I :獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子；步驟2 :將步驟I所獲得的DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
步驟3 :誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，分離純化表達(dá)的融合蛋白。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶切具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的載體或以具有編碼所述蝎活性多肽DNA分子的cDNA為模板PCR擴(kuò)增。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以具有編碼所述蝎活性多肽ADC-I的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADC-1DNA。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述將步驟I所獲得的DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞具體為步驟I所得DNA分子通過凝膠電泳回收和雙酶切插入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
其中，本發(fā)明所述表達(dá)載體包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體為PGEX系列中的pGEX-6p-l。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞為大腸桿菌表達(dá)菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為Rosetta(DE3)菌株。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時候，真核基因中的一些密碼子對于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。Rosetta (DE3)是攜帶PRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，可以補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA’CCC, GGA及CGG)對應(yīng)的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。本發(fā)明所述制備方法所述步驟3具體為IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，收集菌體超聲波破碎，取上清親和層析得到融合蛋白，再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶酶切和色譜分離，獲取色譜純的蝎活性多肽。其中，所述親和層析的層析介質(zhì)為根據(jù)表達(dá)載體的選擇性標(biāo)簽選擇的與之相匹配的層析介質(zhì)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體為pGEX-6p-l，親和層析的層析介質(zhì)為GST親和層析膠。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制備方法具體為以具有編碼所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子的cDNA為模板，用根據(jù)編碼成熟肽部分的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物，獲取具有編碼所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子，凝膠電泳回收和雙酶切獲取的DNA分子及表達(dá)載體pGEX-6p-l,連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)獲得重組菌。然后IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，收集菌體超聲波破碎，取上清GST親和層析得到融合蛋白，再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶酶切和色譜分離，獲取色譜純的蝎活性多肽ADC-1。本發(fā)明通過膜片鉗技術(shù)鑒定了所述蝎活性多肽ADC-I對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活性。結(jié)果顯示，所述蝎活性多肽ADC-I可特異性抑制鉀通道Kvl. 3電流，抑制電流半數(shù)的多肽濃度(IC50值)為0. 49 ±0. 45nM，表明蝎活性多肽ADC-I可特異性作用自身免疫疾病的靶標(biāo)鉀通道Kvl. 3。本發(fā)明通過在大鼠動物水平上模擬治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎檢測蝎活性多肽ADC-I藥物治療效果。結(jié)果顯示，蝎活性多肽ADC-I治療后，大鼠多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀得到顯著改善，表明蝎活性多肽ADC-I能有效地治療多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明通過對蝎活性多肽ADC-I的毒性作用研究，發(fā)現(xiàn)蝎活性多肽ADC-I在超過自身免疫疾病動物模型治療劑量50倍的劑量下對小鼠無明顯毒性，表明蝎活性多肽ADC-I毒副作用小。因此本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，所述鉀通道Kvl. 3相關(guān)疾病包括自身免疫性疾病，具體為多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明所述蝎活性多肽ADC-I分子內(nèi)具有3對二硫鍵，在體外穩(wěn)定性好，易于長期保存。膜片鉗技術(shù)鑒定顯示可特異性作用鉀通道Kvl. 3，特異性強(qiáng)，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強(qiáng)的多肽。動物實(shí)驗(yàn)表明，重組多肽ADC-I可以有效治療大鼠的多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，藥物效果顯著，并且對實(shí)驗(yàn)動物毒副作用小。本發(fā)明所述蝎活性多肽的制備方法簡單易行，操作方便，易于生產(chǎn)和制備高純度的ADC-I蝎活性多肽。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I :蝎活性多肽ADC-I基因的獲取取40 只三脊豚蝎(Chaerilus tricostatus)蝎尾腺，用 Trizol 試劑(Invitrogen)提取總RNA,提取方法參照Trizol試劑盒說明書。用Poly A Tract mRNAIsolation System(Promega)試劑盒純化mRNA,并米用 Superscript Plasmid System cDNAlibrary construction kit (Gibco/BRL)試劑盒構(gòu)建 cDNA 文庫。將 cDNA 克隆到 pSPORTl載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，隨機(jī)挑選cDNA克隆進(jìn)行測序。對測序的結(jié)果進(jìn)行序列分析，共獲得可能與鉀離子通道相互作用的178個蝎活性肽新基因。通過建立的計(jì)算機(jī)輔助篩選與設(shè)計(jì)技術(shù)[Biophysical Journal, 2004,87 :105 ；Proteins, 2008, 70 :744 ；Journalof Proteome Research, 2010,9 :3118]，分別預(yù)測84個蝎活性肽基因編碼多肽的空間結(jié)構(gòu)，然后通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選它們與鉀通道Kvl. 3的相互作用，獲得了具有編碼蝎活性多肽ADC-IDNA分子的cDNA基因，所編碼的成熟肽具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADC-I。實(shí)施例2 :擴(kuò)增編碼蝎活性多肽ADC-I的DNA分子I、引物設(shè)計(jì)以蝎活性多肽ADC-I的cDNA基因序列中編碼成熟肽部分的核苷酸序列作為PCR反應(yīng)的模板序列設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)的引物為ADC-I上游引物為SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；ADC-I下游引物為SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；2、擴(kuò)增DNA分子以蝎毒cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為
IOxtaq buffer(with 1.5mM Mg2+)5|il
dNTP(5mM)4|il
上游引物(lOOng/ul)l|il
下游引物(lOOng/ul)l|il 模板(5-50ng/|il)l|il
Taq 酶(2U/|il)0.5|il加入滅菌蒸懼水補(bǔ)足體系總量50 ii I。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性300s94°C 變性 45s55°C退火 45s 32個循72°C 延伸 45s
72。。延伸200s3、重組表達(dá)載體構(gòu)建將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳回收，用EcoRI和XhoI雙酶切，將酶切后的片段插入經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切的表達(dá)載體pGEX-6p-l (購自Pharmacia公司)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。從含氨芐青霉素的LB平板中挑取單菌落，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)5小時，然后用PCR擴(kuò)增的方法對這些培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增模板用培養(yǎng)獲得的菌液，擴(kuò)增的引物、反應(yīng)條件和反應(yīng)過程同DNA 分子擴(kuò)增過程。選取PCR鑒定正確的菌種進(jìn)行測序，獲得序列正確的含重組表達(dá)載體的菌種，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。實(shí)施例3 :蝎活性多肽ADC-I的表達(dá)和純化提取測序序列正確的含重組表達(dá)載體的pGEX-6p-l-ADC_l菌種的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)。IPTG (華美生物工程公司)誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，收集菌體，懸浮于緩沖液(50mM Tris-Cl, I. OmM EDTA,pH8. 0)中，超聲波破碎菌體，離心收集上清。所得上清通過GST親和層析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液脫鹽濃縮、小腸激酶(EK)酶切，獲得蝎活性多肽ADC-I。利用高效液相色譜對ADC-I多肽進(jìn)一步分離，去除GST蛋白質(zhì)，得到色譜純ADC-I多肽。ADC-I多肽理論分子量為4443. IDa，經(jīng)質(zhì)譜分析顯示它的分子量為4439. 7Da，與根據(jù)氨基酸序列推斷的分子量一致。其中，對不同階段得到的ADC-I多肽及其與GST融合蛋白進(jìn)行了 PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖1，高效液相色譜分離純化和質(zhì)譜分析結(jié)果見圖2和圖3。實(shí)施例4 :蝎活性多肽ADC-I對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活性分析將HEK-293T細(xì)胞在含10 %的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37 °C、5 % CO2條件下培養(yǎng)，將鉀通道Kvl. 3重組質(zhì)粒分別用Sofast 的轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在0. 8mg/mLGeneticin培養(yǎng)基上選擇性培養(yǎng)。利用全細(xì)胞膜片鉗用儀器(EPC-10雙通道膜片鉗放大器HEKA, Elektronik, Lambrecht, Germany),對重組蝎活性多肽ADC-1的藥理學(xué)活性進(jìn)行測定和分析。實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置、數(shù)據(jù)的采集和刺激的施加均通過Pulse軟件(Elektixmik，Lambrecht, Germany)來控制。儀器的濾波器設(shè)置為IOkHz(Bessel),電極阻抗為2-5MQ,在電極與細(xì)胞膜之間形成高阻(1-5GQ)封接后，進(jìn)行快電容自動補(bǔ)償(c-fast)，稍加負(fù)壓破膜后，進(jìn)行慢電容自動補(bǔ)償(C-Slow),在-70mV的鉗制電位下,從_60mV起給予IOmV步幅遞增、80ms步寬的去極化脈沖刺激至+50mV，觀察電流情況，將多肽ADC-I通過MPS-2 (INBI0Inc, Wuhan, China)灌注系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精確灌注。將3種蝎活性多肽溶解后，經(jīng)DAD給藥系統(tǒng)(ALA)噴射給藥，給藥管尖端距記錄細(xì)胞IOOiim左右，結(jié)果見圖4。由圖4可知ADC-I對鉀通道Kvl. 3的藥理學(xué)活性為0. 49±0. 45nM，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強(qiáng)的多肽。實(shí)施例5 :蝎活性多肽ADC-I治療多發(fā)性硬化癥的藥效實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)動物選取近交系雌性Wistar大鼠(6_8周齡，體重150土 IOg)，豚鼠(300-400g購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。主要試劑福氏完全佐劑(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠 MBP (Sigma)。全脊髓勻漿-福氏完全佐劑混合乳劑(GPSCH-CFA)的配制將豚鼠處死后，迅速取出脊髓，用超聲破碎儀(Sonics & Materials Inc, America)制成50%的PBS勻衆(zhòng),與等量的福氏完全佐劑(卡介苗10mg/ml)混合,用注射器抽打至油包水乳劑。EAE的誘導(dǎo)Wistar大鼠EAE模型Wistar大鼠雙后腿足墊皮內(nèi)注射0. 4mlGPSCH-CFA乳劑，或同時皮內(nèi)注射約I X 101°百日咳疫苗。每日稱重，觀察神經(jīng)癥狀。飼養(yǎng)2周即出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。將實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠隨機(jī)分為分為三組正常對照組(陰性 對照組)、模型對照組(模型鼠+生理鹽水)、給藥組(模型鼠+ADC-I多肽)，每組10只。給藥組將多肽ADC-I按100 y g -kg-1劑量皮下注射，每天上午I次，正常對照組和模型對照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)給藥。給藥14天后，觀察大鼠患實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎狀況，根據(jù)大鼠狀況評分，記錄每只動物最高臨床評分，取它們的均值為平均臨床評分，結(jié)果見表I。評分標(biāo)準(zhǔn)為無任何臨床癥狀，0分；尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙，I分；雙后肢無力，被動翻身后可以恢復(fù)，2分；雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復(fù)，3分；四肢癱瘓伴尿、便失禁，4分；瀕死狀態(tài)或死亡，5分。表I EAE模型中各實(shí)驗(yàn)組大鼠的評分(i±s)
~平均臨床評分
分組n
IOdI2d14d
正常對照組 10 0.00±0.000.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
模型對照組 10 0.45±0.161.49±0.38 3.15±0.432.82±0.47~
多肽給藥組 10 0.41±0.210.85±0.32 0.93±0.291.23±0.35~實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在沒有藥物治療情況下，模型對照組得分最高(2. 82±0. 47);蝎活性多肽ADC-I治療后，大鼠的癥狀得到顯著改善，平均臨床評分為I. 23±0. 35。由此可見，蝎活性多肽ADC-I能有效地治療多發(fā)性硬化癥。實(shí)施例6 :蝎活性多肽ADC-I治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效實(shí)驗(yàn)選取無特定病原體(SPF)級近交系Wistar大鼠(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)40只，早，體重150±10g，在清潔級環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)I周后，以0. 2ml/只劑量的降植烷(pristane)在實(shí)驗(yàn)組大鼠尾根部皮內(nèi)注射。飼養(yǎng)2周即出現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。將關(guān)節(jié)炎大鼠隨機(jī)分為正常對照組(陰性對照組)、模型陰性對照組(模型鼠+生理鹽水)、模型陽性對照組(模型鼠+氨甲喋呤)、給藥組(模型鼠+Wistar多肽)，每組10只。給藥組按IOOil g .kg—1劑量皮下注射，每天上午I次，連續(xù)給藥；正常對照組和模型陰性對照組皮下注射等量生理鹽水；模型陽性對照組按I. 75mg kg-1劑量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天I次，連續(xù)給藥。給藥21天后，觀察大鼠患關(guān)節(jié)炎狀況。觀察大鼠患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎狀況，根據(jù)大鼠狀況評分，記錄每只動物最高臨床評分，取它們的均值為平均臨床評分，結(jié)果見表2。評分標(biāo)準(zhǔn)為大鼠一個關(guān)節(jié)紅腫，I分；大鼠二個關(guān)節(jié)紅腫，2分；大鼠各個關(guān)節(jié)紅腫，3分；大鼠整個肢體嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，4分。表2各實(shí)驗(yàn)組大鼠的關(guān)節(jié)炎評分(i±s)
權(quán)利要求
1.一種蝎活性多肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
2.—種蝎活性多肽，其特征在于，具有通過在SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求I或2所述蝎活性多肽的DNA分子。
4.編碼權(quán)利要求I所述蝎活性多肽的DNA分子，其特征在于，具有如SEQID NO: 2所示的核苷酸序列。
5.具有權(quán)利要求3所述DNA分子的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述載體，其特征在于，所述載體為pGEX-6p-l。
7.權(quán)利要求I所述蝎活性多肽的制備方法，包括如下步驟 步驟I :獲取具有可以編碼SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的DNA分子； 步驟2 :將步驟I所獲得的DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； 步驟3 :誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，分離純化表達(dá)的融合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，所述步驟I具體為以具有編碼SEQIDN0:1所示氨基酸序列的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具 有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增。
9.權(quán)利要求I所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kvl.3相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述鉀通道Kvl.3相關(guān)疾病為自身免疫性疾病。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述應(yīng)用，其特征在于，所述自身免疫性疾病為多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種蝎活性多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)的蝎活性多肽具有如SEQIDNO:1所示氨基酸序列。本發(fā)明所述制備方法為獲取具有編碼蝎活性多肽的DNA分子與表達(dá)載體融合構(gòu)建重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，分離純化表達(dá)的融合蛋白。本發(fā)明還提供了所述蝎活性多肽在制備治療或預(yù)防鉀通道Kv1.3相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P37/02GK102617723SQ20121010341
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者吳英亮, 曹志賤, 李文鑫, 韓松 申請人:武漢大學(xué)