專利名稱：巖黃連生物堿提取物及制備方法、脫氫卡維丁的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別地，涉及巖黃連生物堿提取物及制備方法、脫氫卡維丁的提取方法。
背景技術：
巖黃連(Corydalis saxicola Bunting), S粟科紫堇屬植物,多年生草本。具有顯著的鎮(zhèn)痛安定、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、利膽、免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床上可用于急性黃疸型肝炎、病毒性肝炎、慢性肝炎、高膽紅素血癥、肝硬化、肝癌等疾病的治療。其有效成分是以脫氫卡維丁(巖黃連堿，dehydrocavidine)為主的多種生物堿,生物堿含量高低直接影響藥材的質(zhì)量和療效。巖黃連植物分布局限于石灰?guī)r山區(qū)，屬石山特有種?，F(xiàn)在資源極少，野生狀態(tài)下只生長在桂西北的鳳山等縣及貴州、云南南部的石灰?guī)r地區(qū)陰濕的巖洞口。由于生境條件惡劣，其自然繁殖率很低，種群發(fā)展困難，資源蘊藏量十分有限。近年來，經(jīng)過科技人員的研究，從巖洞人工栽培入手，根據(jù)巖黃連獨特的特征，模仿自然環(huán)境，進行人工栽培，取得了成功，使得巖黃連藥物的生產(chǎn)有了穩(wěn)定的原料來源。目前已制成巖黃連總生物堿的注射液和片劑，用于臨床，成為當前主治肝炎特別是乙型肝炎、肝硬化、肝癌等的特效藥品。傳統(tǒng)的巖黃連生物堿提取工藝為將巖黃連洗凈曬干，粉碎成粗粉，用5倍量90% 乙醇，浸潰24小時，回流提取4次，每次I小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮到相對密度為O. 92 I. 02 (600C )的清膏，放冷，濾過，濾液濃縮至相對密度為I. 16 I. 20 (60°C ) 的稠膏。于稠膏中加入適量蒸餾水，用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值2 3，攪拌充分，濾過，用 10%鹽酸溶液洗4 5次，合并酸水液，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值9 10，析出棕褐色沉淀，濾過， 濾渣用5倍氯仿提取5 6次，合并氯仿液，加無水硫酸鈉脫水，濾過，回收氯仿至近干，再加少量酒精，減壓回收溶劑，干燥，即得。該工藝存在得率低、勞動強度大、易造成環(huán)境污染等缺點，而且工藝中使用了氯仿，嚴重危害生產(chǎn)人員的身體健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供巖黃連生物堿提取物的制備方法，該制備方法提聞了有效成分的溶出率，從而大大提聞了提取物中總生物喊的含量。本發(fā)明所要解決的技術問題還在于提供上述方法制備得到的巖黃連生物堿提取物，該巖黃連生物堿提取物中的總生物堿含量為95%以上，使用的溶劑只有乙醇。本發(fā)明所要解決的技術問題還在于提供脫氫卡維丁的提取方法，該提取方法得到的脫氫卡維丁單體，純度大于99%。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案是巖黃連生物堿提取物的制備方法，包括步驟I)，將巖黃連粉碎成粗粉，投入萃取容器中，加入20倍重量的緩沖液后升溫， 加入復合酶得到預處理混合物，所述緩沖液的pH為2. 5 6. 0，所述復合酶的用量為2 5%，使所述預處理混合物在溫度35 65°C、保溫I 16小時，然后用稀鹽酸將所述預處理混合物PH值調(diào)節(jié)至2 3，在溫度35 65°C、保溫I 10小時，接著4000r/min離心，收集上清液作為提取液；所述復合酶為包括纖維素酶和果膠酶的組合物；步驟2)，使所述步驟I)得到的提取液通過大孔吸附樹脂，用濃度為20% 80%的乙醇溶液作為洗脫液進行解析，收集解吸后的溶液，干燥后得到粗總生物堿。上述技術方案中，所述萃取容器可以選擇萃取罐或其他適合萃取的容器。所述復合酶的用量2 5%是指所述復合酶重量相對于巖黃連與緩沖液的重量和的比例，即復合酶的重量/(巖黃連的重量+緩沖液的重量)=2 5%。所述復合酶為包括纖維素酶和果膠酶的組合物，其中所述纖維素酶和果膠酶的比例優(yōu)選纖維素酶果膠酶=I :0.5
4.5。在此比例范圍內(nèi)，有效成分的溶出率顯著提高，從而大大提高了提取物中總生物堿的含量。所述緩沖液選自磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中的一種或其組合。所述大孔吸附樹脂的型號選自HZ-806、AB-8、DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、 HPD-500中的任一種。本發(fā)明巖黃連生物堿提取物的制備方法，還包括步驟3)，將所述步驟2)得到的粗總生物堿用緩沖液溶解，在S印hadex LH-20分離柱上進行精制，得到精制后的總生物堿； 所述緩沖液選自磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、 檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中的一種或其組合。所述精制的具體步驟是粗總生物堿用緩沖液溶解后上柱，然后用洗脫液洗脫，在檢測器的監(jiān)控下收集生物堿的洗脫峰。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案還在于，巖黃連生物堿提取物，采用上述方法制備得到。所述巖黃連生物堿提取物中的生物堿含量為95%以上。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案還在于，脫氫卡維丁的提取方法，將上述方法所制備得到的精制后的總生物堿經(jīng)高速逆流色譜進行分離，得到脫氫卡維丁單體，純度達99%以上；所述高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)選自正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正己烷-乙腈-水、正丁醇-甲醇-水、正丁醇-乙酸-水、乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水中的任一種。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點(I)、在原材料的預處理中，用纖維素酶配合果膠酶對藥材進行酶水解，破壞了植物組織中的纖維素成分和果膠成分，提高了有效成分的溶出率，從而大大提高了提取物中總生物堿的含量。(2)、精制純化后得到的總生物堿，含量達95%以上，使用的溶劑只有乙醇。(3)、采用高速逆流色譜技術從總生物堿中提取出脫氫卡維丁單體，純度大于 99%。


圖I是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例I巖黃連的粗總生物堿的制備將潔凈、干燥的巖黃連用粉碎機初步粉碎后，投入萃取罐，加入20倍重量的磷酸鈉緩沖液(pH4. 0,0. 2mol/L)、將溫度升至45°C，加入復合酶(纖維素酶果膠酶=1:1)， 用量為2 %，緩慢攪拌，在溫度45°C保持8小時后，停止反應，用稀鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至2. 0， 保溫8小時，4000r/min離心，收集提取液。提取液過AB-8大孔吸附樹脂柱吸附總生物堿， 解吸洗脫液為55%乙醇水溶液。解吸后的溶液經(jīng)回收乙醇、干燥后得到粗總生物堿。此粗總生物堿中的總生物堿含量為65.8%。其中，總生物堿的含量=總生物堿量/從樹脂上洗脫下來的粗總生物堿質(zhì)量*100%其中，所述AB-8 大孔吸附樹脂柱可以用 HZ-806、DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、 HPD-500中的任一種型號所替代。所述磷酸鈉緩沖液也可以被磷酸鉀緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中的一種或其組合所替代。實施例2巖黃連的粗總生物堿的制備將潔凈、干燥的巖黃連用粉碎機初步粉碎后，投入萃取罐，加入25倍重量的乙酸鈉-乙酸緩沖液(PH4. 5,0. 2mol/L)、將溫度升至45°C，加入復合酶(纖維素酶果膠酶=
I 1)，用量為3%，緩慢攪拌，在溫度45°C保持8小時，停止反應，用稀鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至
2.0，保溫8小時，4000r/min離心，收集提取液。提取液過DA-201大孔吸附樹脂柱吸附總生物堿，解吸洗脫液為50%乙醇水溶液。解吸后的溶液經(jīng)回收乙醇、干燥后得到粗總生物堿。 此粗總生物堿中的總生物堿含量為66. 2%。實施例3精制得到總生物堿實施例I或?qū)嵤├?得到的粗總生物堿用10倍量的甘氨酸-鹽酸緩沖液溶解 (pH3. 0,0. lmol/L),在Sephadex LH-20分離柱上進行精制,在檢測器的監(jiān)控下收集生物堿的洗脫峰，經(jīng)脫鹽、干燥后得到精制純化后的生物堿，含量為96. 8%。實施例4脫氫卡維丁單體的提取方法以實施例3得到的精制后的總生物堿為樣品，在高速逆流色譜儀上進一步分離脫氫卡維丁，采用的溶劑系統(tǒng)為正己燒-甲醇-/K，轉速800r/min,流速2. OmL/min,溫度 35°C，分離液經(jīng)回收溶劑、干燥后得到脫氫卡維丁單體，經(jīng)HPLC檢測，單體純度為99. 3%。實施例5脫氫卡維丁單體的提取方法以總生物堿為樣品，在高速逆流色譜儀上進一步分離脫氫卡維丁，采用的溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙腈-水，轉速850r/min，流速2. OmL/min，溫度35°C，分離液經(jīng)回收溶劑、干燥后得到脫氫卡維丁單體，經(jīng)HPLC檢測，單體純度為99. 6%。實施例6復合酶中纖維素酶和果膠酶的比例對總生物堿含量的影響將潔凈、干燥的巖黃連用粉碎機初步粉碎后，投入萃取罐，加入20倍重量的磷酸鈉緩沖液(PH4. 0,0. 2mol/L)、將溫度升至45°C，加入復合酶(纖維素酶和果膠酶的比例見表I)，用量為4%，緩慢攪拌，在溫度55°C保持10小時后，停止反應，用稀鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至2. 0，保溫10小時，4000r/min離心，收集提取液。提取液過AB-8大孔吸附樹脂柱吸附總生物堿，解吸洗脫液為55%乙醇水溶液。解吸后的溶液經(jīng)回收乙醇、干燥后得到粗總生物堿。
權利要求
1.巖黃連生物堿提取物的制備方法，其特征在于，包括步驟I)，將巖黃連粉碎成粗粉，投入萃取容器中，加入20倍重量的緩沖液后升溫，加入復合酶得到預處理混合物，所述緩沖液的pH為2. 5 6. O,所述復合酶的用量為2 5%, 使所述預處理混合物在溫度35 65°C、保溫I 16小時，然后用稀鹽酸將所述預處理混合物PH值調(diào)節(jié)至2 3，在溫度35 65°C、保溫I 10小時，接著4000r/min離心，收集上清液作為提取液；所述復合酶為包括纖維素酶和果膠酶的組合物；步驟2)，使所述步驟I)得到的提取液通過大孔吸附樹脂，用濃度為20 % 80 %的乙醇溶液作為洗脫液進行解析，收集解吸后的溶液，干燥后得到粗總生物堿。
2.根據(jù)權利要求I所述的巖黃連生物堿提取物的制備方法，其特征在于，所述緩沖液選自磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中的一種或其組合。
3.根據(jù)權利要求2所述的巖黃連生物堿提取物的制備方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂的型號選自 HZ-806、AB-8、DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、HPD_500 中的任一種。
4.根據(jù)權利要求3所述的巖黃連生物堿提取物的制備方法，其特征在于，還包括步驟 3)，將所述步驟2)得到的粗總生物堿用緩沖液溶解，在S^hadex LH-20分離柱上進行精制，得到精制后的總生物堿；所述緩沖液選自磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中的一種或其組合。
5.巖黃連生物堿提取物，其特征在于，采用上述權利要求1-4任一項方法制備得到。
6.根據(jù)權利要求5所述的巖黃連生物堿提取物，其特征在于，所述巖黃連生物堿提取物中的總生物堿含量為95%以上。
7.脫氫卡維丁的提取方法，其特征在于，將上述權利要求4所制備得到的總生物堿經(jīng)高速逆流色譜進行分離，得到脫氫卡維丁單體，純度達99%以上；所述高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)選自正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正己烷-乙腈-水、正丁醇-甲醇-水、正丁醇-乙酸-水、乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了巖黃連生物堿提取物及其制備方法、以及在此基礎上的脫氫卡維丁的提取方法。本發(fā)明方法在原材料的預處理中，用纖維素酶配合果膠酶對藥材進行酶水解，破壞了植物組織中的纖維素成分和果膠成分，提高了有效成分的溶出率，從而大大提高了提取物中總生物堿的含量。本發(fā)明用兩次層析法提取出總生物堿，含量達95％以上，使用的溶劑只有乙醇。本發(fā)明采用高速逆流色譜技術從總生物堿中提取出脫氫卡維丁單體，純度大于99％。
文檔編號A61P31/20GK102600247SQ20121010420
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權日2012年4月11日
發(fā)明者胡瑋 申請人:寧波德沃生物科技有限公司