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抗血管性血友病因子a3區(qū)雙功能性單克隆抗體的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):912879閱讀:385來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱:抗血管性血友病因子a3區(qū)雙功能性單克隆抗體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體的說(shuō)是涉及抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用
背景技術(shù)
血栓(thrombi),是指在人體血管內(nèi)形成的血塊,血栓形成(thrombosis)是指血管內(nèi)形成血凝塊的過(guò)程,血栓形成是人體重要的保護(hù)機(jī)制,避免個(gè)體在遭遇創(chuàng)傷時(shí)過(guò)量的血液溢出。人體同時(shí)存在抑制血栓形成的因素,防止血栓無(wú)限制擴(kuò)大和異常的血栓形成,即抗凝系統(tǒng)。當(dāng)血栓完成了止血后,體內(nèi)還存在清除血栓的纖溶機(jī)制,纖溶激活物/纖溶抑制物調(diào)解體內(nèi)的纖溶活性。這樣,止血與抗凝,纖溶與抗纖溶兩個(gè)系統(tǒng)的相互作用,相互平衡,保證了人體內(nèi)的血液在正常生理情況下能夠在血管內(nèi)正常流動(dòng),既不形成血栓,也不出血,在創(chuàng)傷時(shí)形成血栓止血,止血后血栓又能夠被清除。但如果上述機(jī)制失衡,血栓形成過(guò)多堵塞官腔則成為血栓性疾病,血管內(nèi)所形成的血栓隨著血液流動(dòng)的方向飄落,當(dāng)遇到直徑小于血栓的血管時(shí)引起血管堵塞即栓塞(embolism)。由于這兩個(gè)過(guò)程是相互關(guān)聯(lián)的,故臨床上將其一并稱作血栓栓塞性疾病。流行病學(xué)研究顯示,隨著生活條件的改善及人口的老齡化,血栓栓塞性疾病的發(fā)病率逐年增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球每年有1500萬(wàn)人死于血栓栓塞性疾病,我國(guó)每年血栓栓塞性疾病的發(fā)病人數(shù)近1000萬(wàn),其中病死人數(shù)高達(dá)100萬(wàn),致殘率也很高。此外,血栓栓塞性疾病容易引發(fā)心肌梗死、卒中、外周動(dòng)脈疾病、肺栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。因此深入研究血栓形成機(jī)制以及開(kāi)發(fā)抗血栓新靶點(diǎn)的創(chuàng)新藥物是目前醫(yī)藥領(lǐng)域急待解決的問(wèn)題。近年來(lái),對(duì)血小板在血栓形成過(guò)程中分子機(jī)制研究促進(jìn)了分子靶向藥物的發(fā)展,其中以針對(duì)血小板糖蛋白(GP) Ilb/IIIa的單克隆抗體阿昔單抗(abciximab, Reopro)為代表,臨床應(yīng)用已取得了良好的抗血栓治療效果。然而,由于阿昔單抗也存在引起嚴(yán)重出血的潛在危險(xiǎn),特別是在亞洲人群中出血副作用更嚴(yán)重,還未在亞洲推廣應(yīng)用,所以在一定程度上阻礙了這類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用。為了克服抗血栓藥物的缺陷,近來(lái)抗血小板粘附作為新的抗血栓治療手段正在興起,人們?cè)噲D通過(guò)抑制膠原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPIb軸來(lái)阻斷血小板與膠原的起始粘附,即在血栓形成早期階段阻止血小板的黏附和活化,以達(dá)到既能對(duì)抗血栓形成,又能減少出血的危險(xiǎn)性的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體的新應(yīng)用,即抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-125在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。血栓形成是由血小板在血管受損部位的粘附開(kāi)始的。血小板粘附是血小板表面膜受體與暴露的血管內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如VWF,膠原蛋白,纖維連接蛋白,玻璃連接蛋白和層連接蛋白等結(jié)合完成的。血小板粘附后形成單層血小板,隨后,血小板被激動(dòng)劑如腎上腺素,ADP,膠原蛋白或凝血酶等激活。激活的血小板在膜表面暴露出GPIIb a /IIIa受體,纖維蛋白原與之結(jié)合后介導(dǎo)血小板聚集。GPIIb a/IIIa與其他黏附蛋白如VWF等結(jié)合后也可引起血小板交叉結(jié)合和聚集。由此可見(jiàn),VWF分子與膠原的結(jié)合所引起的血小板粘附是血栓形成的初始途徑。因此VWF成了治療性藥物受人矚目的祀點(diǎn)。 本申請(qǐng)發(fā)明人制備了針對(duì)膠原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPIb軸新靶點(diǎn)的雙功能單克隆抗體SZ-123和SZ-125,已在申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910027568. I的中國(guó)專(zhuān)利中公開(kāi)。體外試驗(yàn)研究表明,雙功能單克隆抗體SZ-123和SZ-125不僅抑制膠原與血管性血友病因子(VWF)的相互作用,也抑制血管性血友病因子(VWF)與血小板GPIb的相互作用,進(jìn)一步的研究顯示在高剪切狀態(tài)下,SZ-123和SZ-125在體外抑制血小板在膠原表面上的粘附作用,體外試驗(yàn)顯示了巨大抗血小板粘附的潛力。然而體外實(shí)驗(yàn)只是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),影響因素簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能作為初期篩查,無(wú)法推用到復(fù)雜的動(dòng)物及人類(lèi)。為了進(jìn)一步研究抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-123和SZ-125在體內(nèi)的抗血栓作用藥用價(jià)值,本發(fā)明采用我們選取更接近人類(lèi)的動(dòng)物-獼猴作為研究對(duì)象,運(yùn)用動(dòng)脈血栓Folts模型,靜脈注射給藥不同劑量的單克隆抗體SZ-125,將單克隆抗體SZ-125靜脈給藥,然后觀察給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血栓的效果,用超聲血流儀監(jiān)測(cè)動(dòng)物血管損傷部位給藥前后周期性血流減少CFR值,統(tǒng)計(jì)給藥前后各I小時(shí)內(nèi)CFRs次數(shù)的改變,其中,所述單克隆抗體SZ-125為保藏編號(hào)為CGMCC NO. 2501的雜交瘤細(xì)胞株SZ-125分泌的單克隆抗體。結(jié)果顯示獼猴每公斤體重分別靜脈注射給藥抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-1250. lmg、0. 3mg和0. 6mg后,與陰性對(duì)照組靜脈注射生理鹽水(Omg/Kg)比較,給藥后三組試驗(yàn)動(dòng)物均能顯著抑制周期性血流減少(CFR)值(P<0.01)??寡苄匝巡∫蜃覣3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-125在獼猴體內(nèi)分別給藥0. lmg、0. 3mg和0. 6mg/Kg后與生理鹽水組比較,具有顯著地抑制CFRs作用(P < 0. 01),并且單克隆抗體SZ-125對(duì)獼猴的CFRs抑制作用在獼猴體內(nèi)是劑量依賴性地,而且當(dāng)給藥劑量達(dá)到0. 6mg/Kg時(shí)幾乎能完全抑制CFRs值。采用相同方法,將單克隆抗體SZ-123靜脈給藥,觀察給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血栓的效果,結(jié)果與靜脈給藥單克隆抗體SZ-125結(jié)果相似。因此本發(fā)明提供了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備周期性血流減少抑制劑中的應(yīng)用。 在一個(gè)具體實(shí)施方式
中本發(fā)明觀察了單克隆抗體SZ-125對(duì)獼猴體內(nèi)血漿VWF與膠原的結(jié)合的影響,結(jié)果顯示在0. lmg/Kg劑量組中,在給藥15分鐘到I小時(shí)內(nèi),SZ-125抑制其血漿VWF與膠原結(jié)合分到達(dá)50%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg劑量組,給藥5分鐘其抑制率就接近100% (到達(dá)最高值是85%和94% ),在2小時(shí)以內(nèi)其抑制率分別保持在80%和92%以上。而在0. 6mg/Kg劑量組中,給藥24小時(shí)還有44%抑制率。結(jié)果表明本發(fā)明所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-125在動(dòng)物體內(nèi)具有明顯的抑制血漿VffF與膠原的結(jié)合的作用。采用相同方法,觀察單克隆抗體SZ-123對(duì)獼猴體內(nèi)血漿VWF與膠原的結(jié)合的影響,結(jié)果與靜單克隆抗體SZ-125結(jié)果相似。因此,本發(fā)明提供了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備周期性血流減少抑制劑中的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中,本發(fā)明通過(guò)觀察單克隆抗體SZ-125對(duì)獼猴體內(nèi)血小板聚集功能的影響,檢測(cè)抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體對(duì)瑞斯脫霉素(Ristocetin)誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用。結(jié)果顯示在給藥單克隆抗體SZ-1250. Img/Kg、0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg的不同劑量后,與給藥前比較,給藥15分鐘和30分鐘就到達(dá)血小板聚集最大抑制率,給藥I小時(shí)后,血小板聚集抑制率開(kāi)始下降,在2小時(shí)以內(nèi)其最大血小板聚集率分別降至20%以下。表明本發(fā)明抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-125在動(dòng)物體內(nèi)具有抑制瑞斯脫霉素(Ristocetin)誘導(dǎo)的人血小板聚集的作用。采用相同方法,觀察單克隆抗體SZ-123對(duì)獼猴體內(nèi)血小板聚集功能的影響,結(jié)果與靜單克隆抗體SZ-125結(jié)果相似。因此,本發(fā)明提供了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備血小板聚集的抑制劑中的應(yīng)用另外,本發(fā)明將獼猴分別給予不同劑量的單克隆抗體SZ-125,在給藥0min、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h時(shí)間點(diǎn)采血(血樣以終濃度0. 38%的枸櫞酸鈉和0.2%EDTANa2分別抗凝)后,觀察各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物體內(nèi)的SZ-125水平、VWF抗原水平和SZ-125與VffF結(jié)合的占有率。結(jié)果顯示,與給藥前比較,SZ-125在給藥5分鐘到4小時(shí)內(nèi)保持較高的水平,在24小時(shí)后下降到最高水平的10%左右。而各時(shí)間點(diǎn)血漿VWF水平?jīng)]有顯著變化。SZ-125在給藥5分鐘到4小時(shí)內(nèi)保持較高的在VWF的占位百分率,在0. 6mg/Kg組中,在給藥5分鐘到4小時(shí)內(nèi)其VWF的占位百分率是92%到100%,在給藥24小時(shí)時(shí),還有80%以上的VWF占位百分率;在0. 3mg/Kg組中,在給藥5分鐘到2小時(shí)內(nèi)其VWF的占位百分率在85%以上,在給藥24小時(shí)時(shí),還有56. 3% VffF的占位百分率。結(jié)果表明單克隆抗體SZ-125與VWF有很高的親和力,在獼猴體內(nèi)抗血栓藥效作用保持較寬的時(shí)間窗。此外,本發(fā)明還將獼猴分別給予不同劑量的單克隆抗體SZ-125,在給藥Omin、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h時(shí)間點(diǎn)采血(血樣以終濃度0. 38%的枸櫞酸鈉和0. 2% EDTANa2分別抗凝)后,觀察各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物體內(nèi)的血小板數(shù)和出血時(shí)間,同時(shí)觀察給藥前后血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(Fg)等凝血指標(biāo),檢測(cè)單克隆抗體SZ-125-在動(dòng)物體內(nèi)抗動(dòng)脈血栓效果和出血影響。結(jié)果顯示,與給藥前比較,每組動(dòng)物給藥后各時(shí)間點(diǎn)的血小板數(shù)沒(méi)有顯著下降,出血時(shí)間不延長(zhǎng),對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(TT)均不顯著延長(zhǎng)、血漿纖維蛋白原(Fg)水平不下降。結(jié)果表明,單克隆抗體SZ-125對(duì)獼猴體內(nèi)血小板數(shù)沒(méi)有顯著下降,出血時(shí)間不延長(zhǎng),凝血功能不影響,作為抗血栓藥物沒(méi)有出血副作用,降低出血的風(fēng)險(xiǎn)。采用相同方法觀察,單克隆抗體SZ-123與VWF同樣有很高的親和力,在獼猴體內(nèi)抗血栓藥效作用保持較寬的時(shí)間窗,而且靜脈注射單克隆抗體SZ-123后,結(jié)果與靜單克隆抗體SZ-125結(jié)果相似,不同時(shí)間點(diǎn)血小板數(shù)也沒(méi)有顯著下降,出血時(shí)間不延長(zhǎng),凝血功能不影響。綜上所述,抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體SZ-125和SZ-123在動(dòng)物體內(nèi)具有顯著地抑制周期性血流減少(CFRs)作用,而且不但抑制血漿VWF與膠原的結(jié)合,而且也抑制瑞斯脫霉素(Ristocetin)誘導(dǎo)的人血小板聚集,具有雙功能抑制血栓形成的作用。由此可見(jiàn),抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體是從動(dòng)脈血栓形成的源頭,即是針對(duì)血小板粘附的新靶點(diǎn)(膠原-VWF-血小板)從早期預(yù)防血栓的形成。此外,抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體與VWF有很高的親和力,在獼猴體內(nèi)抗血栓藥效作用保持較寬的時(shí)間窗,而且對(duì)獼猴體內(nèi)血小板數(shù)、出血時(shí)間不延長(zhǎng)以及凝血功能不影響,作為抗血栓藥物沒(méi)有出血副作用。因此本發(fā)明提供了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用 。本發(fā)明所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體為申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910027568. I的中國(guó)專(zhuān)利中的篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞株SZ-125和SZ-123所產(chǎn)生的單克隆抗體。其中,所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體優(yōu)選為保藏編號(hào)為CGMCC NO. 2501的雜交瘤細(xì)胞株SZ-125分泌的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種抗血栓的藥物制劑,由有效量的抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的輔料組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體直接或間接加入制備不同劑型時(shí)所需的藥學(xué)上可接受的各種常用輔料,以常規(guī)藥物制劑方法,制成常用劑型如注射劑、粉針劑等劑型。所述制劑可以通過(guò)以下方式中的適合方式給藥局部給藥、靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)或顱內(nèi)注射或輸入,或借助一種外植的儲(chǔ)器用藥,其中優(yōu)選肌注、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)用藥方式。本發(fā)明所述抗血栓藥物制劑的使用劑量和使用方法取決于諸多因素,包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況、化合物的活性強(qiáng)度、給藥時(shí)間、代謝速率、病程嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述因素可以容易地決定使用劑量和使用方法。


圖I示實(shí)施例2給藥前后獼猴周期性血流減低(CFRs)變化代表性記錄圖,獼猴給藥前記錄I小時(shí)內(nèi)CFRs (-60分鐘到0分鐘),然后靜脈注射給藥單克隆抗體SZ-125(0mg/Kg、0. Img/Kg、0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg)后再記錄I小時(shí)CFRs (0分鐘到60分鐘),箭頭為給藥時(shí)間點(diǎn)和給藥劑量;圖2示實(shí)施例2SZ-125不同給藥劑量對(duì)獼猴的CFRs抑制作用,靜脈推注不同劑量的單克隆抗體SZ-125 (0. Img/Kg、0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和陰性對(duì)照組Omg/Kg),給藥前后分別記錄各I小時(shí)的CFRs,橫坐標(biāo)為單克隆抗體SZ-125的濃度,縱坐標(biāo)為單克隆抗體SZ-125對(duì)CFRs的抑制率,每組動(dòng)物n = 6,數(shù)據(jù)代表每組動(dòng)物的平均數(shù),“#”= P < 0. 01,“*”= P< 0. 05 ;圖3示實(shí)施例3SZ-125體內(nèi)不同給藥劑量對(duì)獼猴的血漿VWF與膠原結(jié)合抑制作用的檢測(cè)圖,靜脈推注不同劑量的單克隆抗體SZ-125(0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和陰性對(duì)照組Omg/Kg),分別采血測(cè)定給藥0min、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h后,單克隆抗體SZ-125對(duì)血漿VWF與膠原的結(jié)合的抑制作用,橫坐標(biāo)為單克隆抗體SZ-125給藥時(shí)間,縱坐標(biāo)為SZ-125對(duì)血漿VWF與膠原結(jié)合的抑制率(% ),每組動(dòng)物n = 6,數(shù)據(jù)代表每組動(dòng)物的平均數(shù);圖4示實(shí)施例4SZ-125體內(nèi)不同給藥劑量對(duì)獼猴的血小板聚集的抑制作用的檢測(cè)圖,靜脈推注不同劑量的單克隆抗體SZ-125(0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和陰性對(duì)照組Omg/Kg),分別米血測(cè)定Omin、15min、30min、lh、2h、4h和24h后,單抗SZ-125對(duì)瑞斯托霉素(終濃度2. 5mg/mL)誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用,橫坐標(biāo)為單克隆抗體SZ-125給藥時(shí)間,縱坐標(biāo)為SZ-125對(duì)血小板凝集的抑制率(% ),每組動(dòng)物n = 6,數(shù)據(jù)代表每組動(dòng)物的平均數(shù)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合,來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明,下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I :動(dòng)物分組和設(shè)計(jì)給藥方案;(I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物云南獼猴(蘇州西山中科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK (蘇)2007-0005 ;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK :(蘇)2006-0003。2-3. 5歲齡,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體重4. 0-5. 5Kg,24只,雌雄各半。(2)給藥方案將獼猴為陰性對(duì)照組(n = 6)和給藥組試驗(yàn)(n = 18),給藥組又分成高劑量組(n=6)、中劑量組(n = 6)和低劑量組(n = 6)三組,來(lái)研究SZ-125在稱猴體內(nèi)抗動(dòng)脈血栓藥物效果。給藥組高、中和低劑量分成三組動(dòng)物,每組獼猴給藥劑量每公斤體重分別為0. 6mg/Kg、0. 3mg/Kg和0. lmg/Kg。給藥途徑為無(wú)菌靜脈推注,每個(gè)動(dòng)物藥物以目前臨床應(yīng)用的生理鹽水稀釋至5mL后靜脈推注,陰性對(duì)照組分別靜脈推注5mL無(wú)菌生理鹽水。(3)采血方案每組動(dòng)物分別在用藥0min、5min、15min、30min、lh、4h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)采血,
全血血小板計(jì)數(shù)用2% EDTA-2Na(l/9)抗凝當(dāng)天測(cè)定,其他所有血樣以終濃度0. 38%的枸櫞酸鈉抗凝,血小板聚集試驗(yàn)全血立即分離富含血小板血漿2小時(shí)內(nèi)測(cè)定完畢,剩余的0. 38%的枸櫞酸鈉抗凝全血分離血漿后凍-80°C冰箱測(cè)定其他觀察指標(biāo)。實(shí)施例2 SZ-125獼猴周期性血流減低(CFRs)變化的影響獼猴以3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈注射麻醉后,加熱操作臺(tái)維持動(dòng)物體溫于370C。手術(shù)仔細(xì)分離股動(dòng)脈長(zhǎng)約5cm,將直徑0. 5cm的軟硅膠C型外周血管超聲探頭包繞在近心端血管外。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)記錄股動(dòng)脈平均流速。獼猴穩(wěn)定30min后,使用3個(gè)具有彈簧裝置的動(dòng)脈夾完全阻斷血流20s,每個(gè)動(dòng)脈夾間隔2mm,損傷血管壁。在損傷血管中段放置直徑大小合適的硬質(zhì)自制C型環(huán),在C形環(huán)和動(dòng)脈間隙插入直徑3. Omm的球囊導(dǎo)管(美國(guó)Cordis公司,3. OmmX IOmm)用長(zhǎng)3cm,寬0. 8cm的輸液皮條封閉C形環(huán)缺口,球囊導(dǎo)管充氣并保持壓力使血管狹窄65% -80%??捎^察到由于血小板黏附和聚集所造成的血流逐步減低,當(dāng)血流逐步下降為0時(shí),解除狹窄,通過(guò)機(jī)械作用沖走血栓,恢復(fù)血流。這一血流減低,隨后通過(guò)機(jī)械作用沖走血栓,恢復(fù)血流的重復(fù)過(guò)程,稱為周期性血流減低(CFR)。如果需要,可再次損傷血管內(nèi)皮和進(jìn)一步使血管狹窄。穩(wěn)定描記2個(gè)CFR后正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn),記錄I小時(shí)內(nèi)CFR發(fā)生次數(shù),描記I小時(shí)后,按實(shí)施例I給藥方案分別靜脈注射給藥不同劑量的單克隆抗體SZ-125,總體積(包括沖洗靜脈通 路的生理鹽水)共5mL,Imin內(nèi)注射完畢,給藥后繼續(xù)描記CFRl小時(shí)。用超聲血流儀監(jiān)測(cè)動(dòng)物血管損傷部位給藥前后周期性血流減少CFR值,結(jié)果見(jiàn)圖1,統(tǒng)計(jì)給藥前后各I小時(shí)內(nèi)CFR次數(shù)計(jì)算SZ-125不同給藥劑量對(duì)獼猴的CFRs的抑制率,結(jié)果見(jiàn)圖。由圖I結(jié)果可見(jiàn)三組稱猴每公斤體重分別靜脈注射給藥0. lmg、0. 3mg和0. 6mg后,與陰性對(duì)照組靜脈注射生理鹽水(Omg/Kg)比較,給藥后三組試驗(yàn)動(dòng)物均能顯著抑制周期性血流減少(CFR)值。由圖2結(jié)果可見(jiàn)單克隆抗體SZ-125在獼猴體內(nèi)分別給藥0. Img,
0.3mg和0. 6mg/Kg后與生理鹽水組比較,具有顯著地抗血栓作用(P < 0. 01),并且單克隆抗體SZ-125對(duì)獼猴的CFRs抑制作用在獼猴體內(nèi)是劑量依賴性地,而且當(dāng)給藥劑量達(dá)到
0.6mg/Kg時(shí)幾乎能完全抑制CFRs值。實(shí)施例3 SZ-125體內(nèi)抑制獼猴血漿VWF與膠原結(jié)合包板將人胎盤(pán)III型膠原(Sigma公司產(chǎn)品)溶于包被緩沖液,以20 y g/mL包被于多孔ELISA板,100 u L/孔,4°C濕盒過(guò)夜;次日,用PBS-0. 05% Tween洗滌3次后,用封閉液200 u L/孔封閉,4°C濕盒過(guò)夜;次日PBS-0. 05% Tween洗滌3次后備用或_20°C凍存。檢測(cè)將實(shí)施例I獲得的各時(shí)間點(diǎn)的待測(cè)的獼猴血漿給藥前、后各時(shí)間點(diǎn)0. 38%的枸櫞酸鈉抗凝血漿加入上述包被III型膠原酶標(biāo)板各孔中,空白對(duì)照孔加入2% BSA-PBS溶液,37°C溫育2h ;PBS-0. 05% Tween洗滌3次后加入I : 4000稀釋的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的兔抗人vWF多抗(DakoCytomation公司),37°C溫育Ih ;PBS-0. 05% Tween洗漆6次后以TMB顯色,4M H2SO4終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處各孔OD值。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血漿內(nèi)VWF與膠原的結(jié)合率與VWF與膠原結(jié)合的抑制率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3。其中,給藥后各時(shí)間點(diǎn)血漿內(nèi)VWF與膠原的結(jié)合率=給藥后各時(shí)間點(diǎn)血漿內(nèi)測(cè)定的對(duì)應(yīng)OD值/給藥前(Omin)血漿內(nèi)測(cè)定的對(duì)應(yīng)OD值,SZ-125在體內(nèi)抑制VWF與膠原的結(jié)合的抑制率=(I-結(jié)合率)X 100%。由圖3結(jié)果可見(jiàn),抗VWF A3區(qū)單克隆抗體SZ-125在0. lmg/Kg組中,在給藥15分鐘到I小時(shí)內(nèi),SZ-125抑制其血漿VWF與膠原結(jié)合分到達(dá)50%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg劑量組,給藥5分鐘其抑制率就接近100% (到達(dá)最高值是85%和94% ),在2小時(shí)以內(nèi)其抑制率分別保持在80%和92%以上。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的單克隆抗體SZ-125在動(dòng)物體內(nèi)具有抗血栓的作用。實(shí)施例4 SZ-125體內(nèi)抑制獼猴血小板聚集率按實(shí)施例I所述方法分組給藥,每組動(dòng)物分別在用藥0min、5min、15min、30min、lh、4h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)采血采集獼猴全血5mL(3. 8%檸檬酸鈉1/9抗凝),IOOXg離心lOmin,取上層富含血小板血漿(PRP),然后在血小板聚焦儀上分別用2. 5mg/mL瑞斯托霉素(Ristocetin, Sigma公司產(chǎn)品)誘導(dǎo)血小板聚集,記錄最大血小板聚集率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4結(jié)果可見(jiàn),抗VWF A3區(qū)單克隆抗體SZ-125在0. lmg/Kg組中,在給藥15分鐘到30分鐘內(nèi),最大血小板聚集率僅為35%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg劑量組,給藥15分鐘到30分鐘內(nèi),最大血小板聚集率最高值是50%和70%,給藥I小時(shí)后,血小板聚集抑制率開(kāi)始下降,在2小時(shí)以內(nèi)其最大血小板聚集率分別降至20%以下。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的單克隆抗體SZ-125在動(dòng)物體內(nèi)具有抑制瑞斯脫霉素(Ristocetin)誘導(dǎo)的人血小板聚集的作用。實(shí)施例5 SZ-125在獼猴體內(nèi)對(duì)SZ-125水平和VWF抗原(VWF Ag)水平的影響I、獼猴體內(nèi)SZ-125水平測(cè)定包板將羊抗鼠IgG(Beckman_Coult,USA)以包被緩沖液(0. 1M,pH9. 6碳酸鹽緩沖液)稀釋到5g/mL包被于多孔ELISA板,IOOii L/孔,4°C濕盒過(guò)夜;次日,用PBS-0. 05%Tween洗滌3次后,用封閉液200 u L/孔封閉,4°C濕盒過(guò)夜;次日PBS-0. 05% Tween洗滌3次后備用或_20°C凍存。
檢測(cè)倍比(I 2)稀釋的獼猴血漿樣品和SZ-125標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)加入酶標(biāo)板中37°C反應(yīng)Ih后,用PBS-0. 05% Tween洗滌3次后,結(jié)合的SZ-125與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37°C反應(yīng)Ih,然后用PBS-0. 05% Tween洗滌6次后以TMB顯色,3M H2SO4終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處各孔OD值,以SZ-125標(biāo)準(zhǔn)品橫坐標(biāo),相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo),作直線回歸方程后計(jì)算獼猴血漿中SZ-125含量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表I。2、獼猴體內(nèi)VWF抗原(VWF Ag)水平測(cè)定包板將抗VWF單克隆抗體SZ_29(本室研制)溶于包被緩沖液(0. 1M,pH9. 6碳酸鹽緩沖液),以g/mL包被于多孔ELISA板,100 iil/孔,4°C濕盒過(guò)夜;次日,用PBS-0. 05% Tween洗滌3次后,用封閉液200 yl/孔封閉,4°C濕盒過(guò)夜;次日PBS-0. 05%Tween洗滌3次后備用或_20°C凍存。檢測(cè)正常人混合血漿以I : 20、1 50,1 100,1 200,1 500,1 1000 六
個(gè)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,100 Ii L/孔,將實(shí)施例I獲得的各時(shí)間點(diǎn)的0. 38%的枸櫞酸鈉抗凝全血分離的待測(cè)獼猴血漿作I : 50稀釋?zhuān)?.2%BSA-PBS為稀釋液,空白對(duì)照孔加入
0.2% BSA-PBS溶液,37°C溫育2h ;PBS-0. 05% Tween洗滌3次后,加入I 1000稀釋的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的抗VWF單克隆抗體SZ-34,IOOii L/孔,37°C溫育2h ;PBS-0. 05% Tween洗滌6次后以TMB顯色,3M H2SOj*止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處各孔OD值。以正常人混合血漿的6個(gè)稀釋度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo),作直線回歸方程后計(jì)算含量,以正常人混合血漿的VWF =Ag定為10ug/mL,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表I。表I體內(nèi)給藥SZ-125各時(shí)間點(diǎn)血漿的SZ-125水平和VWF抗原水平(ug/mL)
給藥劑量 05 min 15 min 30 min Ih 2 h4 h 24 h
SZ-125 Q.6mg/Kg 0 5.0 士 1.3 6.7 士 1.3 6.6 土 1.5 4.1 士 1.3 2.9 士 0.8 2.0 士 1.0 0.6 土 0.2水平 0.3mg/Kg ~ 0 1.3士0.6 3.4士0.9 3.7±0~ 2.8士0.8 . 2.1 士 1.0 1.4士0.7 0.4土0.5
__0. lmg/Kg 0 0.3 士 0.1 0.4 士 0.2 0.4 士 0.1 0.3 士 0.1 0.2 士 0.1 0.15 士 0.1 0.1 士 0.1
VWF Q.6mg/Kg ' 10.7士 1.9 _9.8士2.4 1(15±1.4 9.2±1~8~ 9.4士3.3 . 9.7士1.6 _10.5士3.5 ~9^8±2.5抗原水 0.3mg/Kg 11.6±1.6 10.4±0.9 10.1±1.6 9.1±1.5 9.0 士 3.3 10.4±0.5 11.1±1.4 10.5 士 3.5^ 0. lmg/Kg 9.4 士 2.3 10.7±1.2 8.9士1.7 10.1 士 2.1 8.3 士 3.1 12.0±5.3 9.8 士 3.1 10.1 士 2.8由表I結(jié)果可見(jiàn),抗VWF A3區(qū)單克隆抗體SZ-125在三組獼猴體內(nèi)分別靜脈注射給藥0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg后,每組動(dòng)物分別與給藥前比較,SZ-125在給藥5分鐘到4小時(shí)內(nèi)保持較高的水平,在24小時(shí)后下降到最高水平的10%左右,而給藥后各時(shí)間點(diǎn)獼猴體內(nèi)血漿VWF抗原(VWF=Ag)水平?jīng)]有顯著改變。實(shí)施例6 SZ-125在獼猴體內(nèi)對(duì)VWF占有率的影響包板將抗VWF多克隆抗體(DakoCytomation公司)I : 1000溶于包被緩沖液(0. 1M,pH9. 6碳酸鹽緩沖液),包被于多孔ELISA板,IOOiU/孔,4°C濕盒過(guò)夜;次日,用PBS-0. 05% Tween洗滌3次后,用封閉液200 yl/孔封閉,4°C濕盒過(guò)夜;次日PBS-0. 05%Tween洗滌3次后備用或_20°C凍存。檢測(cè)將實(shí)施例I獲得的各時(shí)間點(diǎn)的0. 38 %的枸櫞酸鈉抗凝全血分離的待測(cè)的獼猴血漿分別倍比稀釋?zhuān)?7°C預(yù)保溫5min后,分別加入上述酶標(biāo)板孔中37°C保溫2小時(shí),每一個(gè)對(duì)應(yīng)的獼猴血漿要分別做100%的VWF占有率(每一個(gè)對(duì)應(yīng)稀釋的樣品要加入飽和量的SZ-125,終濃度為6ug/mL)。結(jié)合的SZ-125與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗鼠1gG(Beckman-Coulter 公司產(chǎn)品),37°C保溫 I 小時(shí),PBS-0. 05% Tween 洗滌 6 次后以 TMB顯色,3M H2SO4終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處各孔OD值。計(jì)算VWF占有率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。其中,每一個(gè)獼猴血漿內(nèi)VWF占有率% =(每個(gè)樣品0D450nm/對(duì)應(yīng)每個(gè)樣品含有飽和量的 SZ-125 的 0D450nm) X 100%。表2體內(nèi)給藥SZ-125不同劑量后各時(shí)間點(diǎn)VWF占有率)
權(quán)利要求
1.抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。
2.抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備周期性血流減少抑制劑中的應(yīng)用。
3.抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備血漿VWF與膠原的結(jié)合的抑制劑中的應(yīng)用。
4.抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備血小板聚集的抑制劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4任意一項(xiàng)所述應(yīng)用,其特征在于,所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體為保藏編號(hào)為CGMCC NO. 2501的雜交瘤細(xì)胞株SZ-125分泌的單克隆抗體。
6.一種抗血栓藥物制劑,其特征在于,由有效量的抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的輔料組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述藥物制劑,其特征在于,所述藥物制劑為注射劑或粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,公開(kāi)了抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體在動(dòng)物體內(nèi)具有顯著地抑制周期性血流減少(CFRs)作用,不但抑制血漿VWF與膠原的結(jié)合,也抑制瑞斯脫霉素誘導(dǎo)的人血小板聚集。此外抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體與VWF有很高的親和力,在獼猴體內(nèi)抗血栓藥效作用保持較寬的時(shí)間窗,而且對(duì)獼猴體內(nèi)血小板數(shù)、出血時(shí)間不延長(zhǎng)以及凝血功能不影響,作為抗血栓藥物沒(méi)有出血副作用。其中,所述抗血管性血友病因子A3區(qū)雙功能性單克隆抗體為保藏編號(hào)為CGMCC NO.2501的雜交瘤細(xì)胞株SZ-125分泌的單克隆抗體。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102614513SQ201210106259
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者季順東, 江淼, 趙益明, 阮長(zhǎng)耿 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
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