專利名稱：一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物組織和器官的人工制造技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用合成高分子材料、細胞基質(zhì)材料制備組織器官前體的工藝方法，屬于生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人數(shù)逾千萬。然而，活體供體器官有限，現(xiàn)有的機械裝置不具備 器官的所有功能，不能防止患者的病情進一步惡化。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為宗旨的組織工程(Tissue Engineering)技術(shù)應(yīng)運而生。組織工程學(xué)是由美國國家科學(xué)基金委員會于1987年正式提出和確定的，是應(yīng)用細胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的科學(xué)。組織工程是一門由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科交叉產(chǎn)生的高新技術(shù)學(xué)科。其含義是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護、促進人體各種組織器官損傷后恢復(fù)的生物替代物。Wolter在1984年正式提出“組織工程”一詞，1987年美國國家科學(xué)基金委員會正式確定組織工程學(xué)成為一門新學(xué)科。多年來科學(xué)家們運用組織工程技術(shù)，利用人體殘余器官的少量正常細胞進行體外繁殖，希望獲得患者所需的、具有相同功能的器官，并不存在排斥反應(yīng)，取得了可喜的成果。但現(xiàn)存的組織工程技術(shù)面臨許多困難和限制，組織工程應(yīng)用研究所取得的成功均是在那些結(jié)構(gòu)與生理功能較為簡單的組織器官如骨骼、軟骨、皮膚。傳統(tǒng)組織工程方法一般先制備結(jié)構(gòu)支架，在進行細胞培養(yǎng)過程中由于上層細胞消耗大部分的氧氣和營養(yǎng)，限制了這些組分向底層擴散，從而限制了細胞向支架深層的遷移等，達不到及時治療臨床病人的要求。傳統(tǒng)的單一組織支架制備技術(shù)很難形成具有營養(yǎng)供應(yīng)通道和分支血管網(wǎng)絡(luò)并含有分層組織可誘導(dǎo)分化的組織器官前體。同時傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)不能滿足將不同的細胞在空間準確定位與定點放置，構(gòu)建復(fù)雜組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求。由于人體中主要血管的結(jié)構(gòu)是內(nèi)部內(nèi)皮層、中部平滑肌層和外部的成纖維細胞層，微血管單由內(nèi)皮細胞層組成。本發(fā)明中分支模具枝干部分直徑為毫米級別，分支末端部分直徑為微米級別，利用多層可剝離分支模具并伴隨分層細胞基質(zhì)成形方法即可滿足分化為復(fù)雜血管的要求。據(jù)統(tǒng)計中國已成為器官移植第二大國，每年接受器官移植的患者在一萬例左右，但我國每年約有一百五十萬例患者需要進行器官移植，急需新型科技手段出現(xiàn)用以大量快速有效的培育出自體器官。一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法恰好可以滿足這一巨大市場的前期關(guān)鍵需求，并為隨后的完整組織器官生長提供了必要的準備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，旨在前人工作的基礎(chǔ)上，利用組合模具分步灌注，實現(xiàn)多種細胞和支架材料在空間的準確定位，成形多層高分子材料外殼包裹下內(nèi)含分支血管網(wǎng)絡(luò)的多種細胞多種生長因子的復(fù)合組織器官前體；利用模具組合、高分子凝固成形等原理實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，本發(fā)明可成形含不同細胞基質(zhì)材料、分支血管通道與多層合成高分子外殼的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，克服了組織工程存在的三維支架表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單、與真實器官相似度低、細胞種類單一且分布不均勻、密閉細胞不易成活、無通道分化血管困難、支架外形局限性強等缺點。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行 I)將不同合成高分子材料分別溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 50%的合成高分子溶液；2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動物細胞懸浮液分別按I 99 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；動物體細胞懸浮液中細胞濃度為I X IO4個/mL I X IO7個/mL ；3)預(yù)先設(shè)計好帶凹槽的底模具、分支模具和至少兩層殼模具，相鄰層殼模具緊密貼合，分支模具固定在最外層殼模具上；所述殼模具與底模具凹槽配合，并與分支模具形成組合模具；將一種或多種細胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)；4)將分支模具和殼模具一并向上移除，然后取出最內(nèi)層殼模具并將剩余殼模具扣回到底模具上，將一種合成高分子溶液罐注到所述最內(nèi)層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成一層合成高分子材料外殼；5)然后再取一層殼模具，將另一種合成高分子溶液罐注到該層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成另一層合成高分子材料外殼；6)重復(fù)步驟5)，直至將殼模具取完為止，形成多層合成高分子材料外殼；7)去除底模具得到成型結(jié)構(gòu)，將兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆與最外層高分子材料外殼相同的合成高分子溶液，制成帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的殼模具和底模具由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述分支模具為樹枝狀雙層結(jié)構(gòu)，外層可剝離，分支模具采用合成高分子材料或柔性材料；所述合成高分子材料為聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚酯、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯，所述柔性材料為塑料、橡膠、纖維、硅膠或尼龍。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的殼模具截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于用于灌注的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物；所述動物體細胞采用干細胞或成體細胞，所述干細胞為脂肪干細胞、血液干細胞或骨髓干細胞，所述成體細胞為肝細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、腎小球細胞、胰島細胞或神經(jīng)細胞。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為1% 30%的凍存保護劑和體積百分比為O. 001% O. 1%細胞生長因子；所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或幾種材料的混合物，所述生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子、人血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β I、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子中的一種或幾種。所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4_ 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液。本發(fā)明所制備的帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體中合成高分子支架材料具備優(yōu)異的機械性能,此類內(nèi)部細胞基質(zhì)外部多層復(fù)合高分子材料外殼中間帶分支血管的結(jié)構(gòu)可 避免單純細胞基質(zhì)植入體內(nèi)散落進而被自體吞噬這一難題。其中細胞基質(zhì)溶液具有優(yōu)異的生物相容性，多種細胞可在其中形成多種組織。本發(fā)明可實現(xiàn)不同細胞/天然高分子材料與合成高分子支架材料在空間的準確定位，克服了組織工程存在的三維支架表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單、與真實器官相似度低、細胞種類單一且分布不均勻等缺點。本發(fā)明利用組合模具法、高分子凝固成形等原理可實現(xiàn)復(fù)雜器官中為分支血管預(yù)留通路的要求，為實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建打下基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明提供的具有三層殼模具的組合模具實施例的結(jié)構(gòu)原理示意圖。圖2是本發(fā)明的分支模具的三維結(jié)構(gòu)圖。圖3是本發(fā)明的分支模具另一種實施例的三維結(jié)構(gòu)圖。在圖I至圖3中I-第一層殼模具；2_第二層殼模具；3_第三層殼模具；4_底模具；5_分支模具；具體實施方法本發(fā)明提供的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其具體工藝步驟如下I)將不同合成高分子材料分別溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 50%的合成高分子溶液；2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動物細胞懸浮液分別按I 99 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；動物體細胞懸浮液中細胞濃度為I X IO4個/mL I X IO7個/mL ；3)預(yù)先設(shè)計好帶凹槽的底模具4、分支模具5和至少兩層殼模具，相鄰層殼模具緊密貼合，分支模具固定在最外層殼模具上；殼模具與底模具凹槽配合，并與分支模具5形成組合模具；將一種或多種細胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)6 ；4)將分支模具5和殼模具一并向上移除，然后取出最內(nèi)層殼模具并將剩余殼模具扣回到底模具4上，將一種合成高分子溶液罐注到所述最內(nèi)層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成一層合成高分子材料外殼；
5)然后再取一層殼模具，將另一種合成高分子溶液罐注到該層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成另一層合成高分子材料外殼；6)重復(fù)步驟5)，直至將殼模具取完為止，形成多層合成高分子材料外殼；7)去除底模具4得到成型結(jié)構(gòu)9，將兩個成型結(jié)構(gòu)9對接并在接縫處涂覆與最外層高分子材料外殼相同的合成高分子溶液，制成帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。本發(fā)明的優(yōu)選方案是在所述的殼模具和底模具4由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成；所述分支模具5為樹枝狀雙層結(jié)構(gòu)，外層可剝離，分支模具5采用合成高分子材料或柔性材料；所述合成高分子材料為聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚酯、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯，所述柔性材料為塑料、橡膠、纖維、硅膠或尼龍；所述的殼模具截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)；用于灌注的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物；所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物；所述動物體細胞采用干細胞或成體細胞，所述干細胞為脂肪干細胞、血液干細胞或骨髓干細胞，所述成體細胞為肝細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、腎小球細胞、胰島細胞或神經(jīng)細胞。所述的細胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為I % 30%的凍存保護劑和體積百分比為O. 001% O. 1%細胞生長因子；所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或幾種材料的混合物，所述生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子、人血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β I、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子中的一種或幾種。步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4_ 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液。以三層殼模具為例所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，組合模具包括第一層殼模具I、第二層殼模具2、第三層殼模具3、底模具4和分支模具5 ;底模具4上的凹槽與殼模具形成配合關(guān)系，第一層殼模具I內(nèi)表面與第二層殼模具2外表面緊密貼合，第二層殼模具2內(nèi)表面與第三層殼模具3外表面緊密貼合,第一層殼模具I頂端凹槽與所述分支模具5形成配合關(guān)系。實施例I :1)采用不銹鋼材料制備三層殼模具和底模具，所述殼模具表面為球面，以快速原型方法采用聚四氟乙烯材料制備雙層分支模具；2)配制纖維蛋白原溶液，在組合模具中注入少量明膠/纖維蛋白原與內(nèi)皮細胞的混合物，細胞密度為IX IO7個/mL，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成底層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；3)在組合模具中注入明膠/纖維蛋白原與內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的混合物，細胞密度為IX IO7個/mL，加入肝細胞生長因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生長因子(BB或TOGF-BB 50ng/mL)、轉(zhuǎn)化生長因子β 1(TGF β I 10ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF 2. 5ng/mL)。使細胞天然高分子材料分布均勻，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成上層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；4)將殼模具和分支模具一并向上移除，此過程中細胞/天然高分子材料層的臨時變形及破壞不影響后期成形及細胞生長分化，取第一層殼模具和第二層殼模具扣回到底模具上，配制50% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，加入I % (W/W)的肝素，將其罐注到第三層殼模具遺留的周邊縫隙中，風(fēng)干形成PLGA內(nèi)層合成高分子材料外殼；5)將第一層殼模具扣回到底模具上，配制20% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，加入I % (W/W)的肝素，將其罐注到第二層殼模具遺留的周邊縫隙中，風(fēng)干形成PLGA外層合成高分子材料外殼；6)去除底模具和第一層殼模具得到成型結(jié)構(gòu)，制作兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆20% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，風(fēng)干制成完整帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。實施例2 1)采用硅橡膠材料制備雙層殼模具和底模具，所述殼模具表面為橢球面，以快速原型方法采用PLGA材料制備雙層分支模具；2)配制纖維蛋白原溶液，在組合模具中注入少量明膠/纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為I X IO7個/mL，加入內(nèi)皮細胞生長因子并注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成底層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；3)配制含1%紫杉醇的纖維蛋白原/內(nèi)皮細胞混合物，細胞密度為IX IO6個/mL，灌注于組合模具中，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成上層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；4)將殼模具和分支模具一并向上移除，剝離分支模具外層，再次組合各模具，注入 明膠/纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為I X IO7個/mL，加入轉(zhuǎn)化生長因子β I (TGF β I 10ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(b_FGF 2. 5ng/mL)并注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成類血管壁穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；5)將殼模具和分支模具一并向上移除，取第一層殼模具扣回到底模具上，配制5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇攪拌均勻，將其罐注到第二層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用細胞培養(yǎng)液萃取法形成聚氨酯層外殼；6)去除底模具和第一層殼模具得到成型結(jié)構(gòu)，制作兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆5%的聚氨酯/乙二醇溶液，使用細胞培養(yǎng)液萃取法制成完整帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。實施例3 1)采用聚四氟乙烯材料制備三層殼模具和底模具，所述殼模具為類似器官表面的不規(guī)則形狀，以快速原型方法采用聚氨酯材料制備分支模具；2)配制1%檸檬酸鈉的膠原/內(nèi)皮細胞混合物(細胞密度為IXlO7個/mL)，灌注至組合模具中，37°C下放置10分鐘，使膠原/內(nèi)皮細胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；3)將殼模具和分支模具一并向上移除，取第一層殼模具和第二層殼模具扣回到底模具上，配制濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液，加入30 %的檸檬酸鈉，攪拌均勻，將其罐注到第三層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用PBS萃取法形成內(nèi)層合成高分子材料外殼；4)將第一層殼模具扣回到底模具上，配制10% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，加入I % (W/W)的肝素，將其罐注到第二層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用PBS萃取法形成PLGA外層合成高分子材料外殼；6)去除底模具和第一層殼模具得到成型結(jié)構(gòu)，制作兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆10% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，使用PBS萃取法制成完整帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。實施例4 1)采用聚乙烯材料制備三層殼模具和底模具，所述殼模具表面為球面，以快速原型方法采用聚乙烯材料制備雙層分支模具；2)配制纖維蛋白原溶液，在組合模具中注入少量明膠/纖維蛋白原與內(nèi)皮細胞的混合物，細胞密度為I X IO7個/mL，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成底層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；3)配制下列溶液纖維蛋白原和明膠兩種天然生物材料分別溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按I : l(v/v)比例混合均勻。然后按體積比加入10%的二甲基亞砜、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與腎小球細胞按I : I比例混合均勻，加至高分子溶液中，得到脂肪干細胞-腎小球細胞-明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物(細胞密度為IXIO4個/mL)，灌注至組合模具中，并用凝血酶溶液(30IU/mL)固定2分鐘形成上層穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；4)將殼模具和分支模具一并向上移除，剝離分支模具外層，再次組合各模具，注入明膠/纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為I X IO7個/mL，加入堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF 2. 5ng/mL)并注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成類血管壁穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；5)將殼模具和分支模具一并向上移除，取第一層殼模具和第二層殼模具扣回到底模具上，配制10% (W/V)的PLGA/四乙二醇溶液，將其罐注到第三層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用PBS萃取法形成PLGA內(nèi)層合成高分子材料外殼；6)將第一層殼模具扣回到底模具上，配制30% PU/四乙二醇溶液，將其罐注到第二層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用PBS萃取法形成PU外層合成高分子材料外殼；7)去除底模具和第一層殼模具得到成型結(jié)構(gòu)，制作兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆30% PU/四乙二醇溶液，使用PBS萃取法制成完整帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體實施例5 1)采用黃銅制備雙層殼模具和底模具，所述殼模具表面為橢球面，以傳統(tǒng)模具成型方法采用橡膠材料制備分支模具；2)將纖維蛋白原溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%高分子溶液。然后按體積比加入20%的甘油、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與胰島細胞按2 I比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(細胞密度為I X IO7個/mL)，得到脂肪干細胞-胰島細胞、明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物，灌注至組合模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)固定2分鐘形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；3)將殼模具和分支模具一并向上移除，取第一層殼模具扣回到底模具上，配制含3%紫杉醇的30%聚酯/四乙二醇溶液，將其罐注到第二層殼模具遺留的周邊縫隙中，使用細胞培養(yǎng)液萃取法形成聚酯層外殼；4)去除底模具和第一層殼模具得到成型結(jié)構(gòu)，制作兩個成型結(jié)構(gòu)對接并在接縫處涂覆30%聚酯/四乙二醇溶液，使用細胞培養(yǎng)液萃取法制成完整帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體；將上述三維結(jié)構(gòu)體在4°C下放置半小時，后置于_20°C冰箱中半小時，最后放入_196°C液氮中低溫保存，使用時快速復(fù)溫，加入培養(yǎng)液于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)備用。
權(quán)利要求
1.一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行 1)將不同合成高分子材料分別溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 50%的合成高分子溶液； 2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動物細胞懸浮液分別按I 99 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；動物體細胞懸浮液中細胞濃度為I X IO4個/mL I X IO7個/mL ； 3)預(yù)先設(shè)計好帶凹槽的底模具(4)、分支模具(5)和至少兩層殼模具，相鄰層殼模具緊密貼合，分支模具固定在最外層殼模具上；所述殼模具與底模具凹槽配合，并與分支模具(5)形成組合模具；將一種或多種細胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)(6)； 4)將分支模具(5)和殼模具一并向上移除，然后取出最內(nèi)層殼模具并將剩余殼模具扣回到底模具(4)上，將一種合成高分子溶液罐注到所述最內(nèi)層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成一層合成高分子材料外殼； 5)然后再取一層殼模具，將另一種合成高分子溶液罐注到該層殼模具遺留的周邊縫隙中，通過干膜法或濕膜法除去有機溶劑，形成另一層合成高分子材料外殼； 6)重復(fù)步驟5)，直至將殼模具取完為止，形成多層合成高分子材料外殼； 7)去除底模具(4)得到成型結(jié)構(gòu)(9)，將兩個成型結(jié)構(gòu)(9)對接并在接縫處涂覆與最外層高分子材料外殼相同的合成高分子溶液，制成帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體。
2.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的殼模具和底模具(4)由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成。
3.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述分支模具(5)為樹枝狀雙層結(jié)構(gòu)，外層可剝離，分支模具(5)采用合成高分子材料或柔性材料；所述合成高分子材料為聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚酯、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯，所述柔性材料為塑料、橡膠、纖維、硅膠或尼龍。
4.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的殼模具截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)。
5.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于用于灌注的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物。
6.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物；所述動物體細胞采用干細胞或成體細胞，所述干細胞為脂肪干細胞、血液干細胞或骨髓干細胞，所述成體細胞為肝細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、腎小球細胞、胰島細胞或神經(jīng)細胞。
7.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為1% 30%的凍存保護劑和體積百分比為.0.001% 0. 1%細胞生長因子；所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或幾種材料的混合物，所述生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子、人血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子01、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子中的一種或幾種。
8.按照權(quán)利要求I所述的一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或·1，4_ 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液。
全文摘要
一種帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜器官前體的制備方法，該方法首先制備一種或多種細胞基質(zhì)溶液和合成高分子溶液，將細胞基質(zhì)溶液分層灌注到組合模具中經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)形成多層細胞基質(zhì)層，取出分支模具并由內(nèi)而外逐層去除殼模具，將不同種合成高分子溶液分別罐注到殼模具遺留的縫隙中形成多層合成高分子外殼，去除組合模具將兩個成形結(jié)構(gòu)對接即可。本發(fā)明可成形帶分支血管網(wǎng)絡(luò)的不同種細胞基質(zhì)材料與合成高分子支架外殼結(jié)合的復(fù)雜器官前體三維結(jié)構(gòu)，克服了組織工程存在的三維支架表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單、與真實器官相似度低、細胞種類單一且分布不均勻、密閉細胞不易成活、無通道分化血管困難、支架外形局限性強等缺點。
文檔編號A61L27/38GK102631709SQ20121011041
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者王小紅 申請人:清華大學(xué)