專利名稱：長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白ptx3在預(yù)防或治療病毒性疾病中的應(yīng)用的制作方法
長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在預(yù)防或治療病毒性疾病中的應(yīng)用本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00780008561. 4、申請(qǐng)日為2007年2月28日、發(fā)明名稱為“長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在預(yù)防或治療病毒性疾病中的應(yīng)用”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本文所述發(fā)明涉及長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3(PTX3)或其有功能的衍生物之一在制備預(yù)防或治療病毒性疾病和/或抑制病毒活化的藥物中的應(yīng)用，其中所述病毒選自皰疹病毒，如巨細(xì)胞病毒(CMV);流感病毒，如H1N1、H3N2、H5N1或H5N7病毒；副粘病毒，如麻疹病毒；呼吸道合胞病毒；冠狀病毒，如SARS ；HIV病毒；肝炎病毒；或輪狀病毒。人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種皰疹病毒，見(jiàn)于約50%的一般人群。約90%具有HIV的人攜帶HCMV。在一般人群中，所述病毒在初始感染后通常潛伏在機(jī)體組織中。然而，它可在口腔、尿、和生殖道中脫落，成為感染其他人的感染源。如果免疫系統(tǒng)因?yàn)槿魏卧蜃兊萌狈Φ挚沽Γ琀CMV感染可導(dǎo)致繼發(fā)的更嚴(yán)重的感染。約5%通過(guò)垂直傳遞獲得HCMV的嬰兒患有嚴(yán)重的出生缺陷。這些出生缺陷可包括 腦損害、生長(zhǎng)不足、失明、及其他缺陷。這個(gè)問(wèn)題通常在母親在懷孕期間首次感染HCMV時(shí)發(fā)生。在一般成年人群中，HCMV處于休眠狀態(tài)，但可與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生有關(guān)。已將HCMV感染與動(dòng)脈斑塊和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。HCMV可在免疫系統(tǒng)弱化的人群中引發(fā)嚴(yán)重的問(wèn)題。這最通常在患有AIDS的人群或那些接受免疫抑制治療的患者中成為問(wèn)題。HCMV感染75%至100%的HIV陽(yáng)性患者。與HCMV有關(guān)的最常見(jiàn)的并發(fā)癥包括脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎；胃腸道感染，包括肝炎、食管炎、結(jié)腸炎、胃炎、和胰腺炎；神經(jīng)系統(tǒng)累及，包括腦炎和多神經(jīng)根炎；肺累及；和副睪炎。癌癥廣泛播散的人群或接受器官或骨髓移植的人群通常受影響。感染可由于首次暴露于HCMV而發(fā)生或是HCMV再活化的結(jié)果。在移植和癌癥患者中HCMV通常引發(fā)肺炎或胃腸道感染而導(dǎo)致腹瀉，其可致死。此外，HCMV還促成在實(shí)體器官移植接受者中慢性同種異體移植功能障礙的發(fā)生。已確實(shí)建立肺移植接受者中HCMV疾病和閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生間的關(guān)系。HCMV還是可引起同種異體移植損傷的眾多危險(xiǎn)因素之一。直接病毒侵入同種異體移植物可在肝臟或腎臟移植患者中引發(fā)HCMV肝炎。除了 HCMV產(chǎn)生的直接綜合征，此病毒感染還可增加真菌性和其它機(jī)會(huì)性感染(如卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎和愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒相關(guān)性移植后淋巴組織增生病)的危險(xiǎn)。大多數(shù)人到成年時(shí)已感染HCMV。任何接受輸血或器官移植的人都有感染HCMV的危險(xiǎn)。此外，免疫系統(tǒng)弱化的人群和未出生的」L童有患嚴(yán)重疾病的危險(xiǎn)。目前用抗病毒試劑(如更昔洛韋、膦甲酸、和西多福韋)治療免疫系統(tǒng)弱化的人群中有活性的HCMV。流感病毒引發(fā)流感(一種接觸傳染病)，其感染人的呼吸道(鼻、咽喉和肺)。流感通常突然發(fā)病，可包括下列癥狀發(fā)燒、頭痛、全身乏力(一種生病的且可極度無(wú)力的感覺(jué))、咳嗽、咽喉痛、鼻塞及身體疼痛。
副粘病毒科的病毒引發(fā)多種不同的人類臨床疾病，所述病毒包括麻疹病毒；腮腺炎病毒，其引發(fā)腮腺炎、睪丸炎和腦炎的癥狀；及副流感病毒，其是呼吸道病原體。呼吸道合胞病毒(RSV)是引發(fā)嬰兒和小于I歲的兒童的細(xì)支氣管炎和肺炎的最常見(jiàn)病原。疾病最常始于發(fā)燒、流鼻水、咳嗽、及有時(shí)哮鳴。RSV還引發(fā)終身重復(fù)感染，通常伴隨中度至重度感冒樣癥狀；但在任何年齡都可發(fā)生重度下呼吸道疾病，尤其是老年人或心臟、肺或免疫系 統(tǒng)缺乏抵抗力的人。冠狀病毒感染多種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類，在人中，它們引發(fā)呼吸道感染，包括嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)、腸道感染和神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。成年人的感染不常見(jiàn)，且再感染似乎終身發(fā)生。人免疫缺陷病毒(HIV)是一種反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的遺傳信息由RNA編碼。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，此RNA由所述病毒的酶一反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制為DNA。所述病毒遺傳信息的此cDNA拷貝可整合到核內(nèi)宿主細(xì)胞染色體中。此原病毒可于被再活化及產(chǎn)生更多感染性反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒前在多次細(xì)胞分裂中保持休眠狀態(tài)。病毒性肝炎是由病毒感染引發(fā)的任何類型的肝臟炎癥?，F(xiàn)在公認(rèn)引發(fā)肝臟疾病的三種最常見(jiàn)的病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、和非甲非乙型肝炎病毒(也稱為丙型肝炎病毒)。也確定了幾種其它類型丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及最近鑒定的庚型肝炎病毒。推測(cè)存在第七種類型(己型肝炎病毒)，但尚未證實(shí)。輪狀病毒是造成兒童重度腹瀉的最常見(jiàn)原因，在美國(guó)每年導(dǎo)致約55000兒童住院，在全世界每年導(dǎo)致超過(guò)600000兒童死亡。PTX3是在多種類型的細(xì)胞(尤其是在暴露于炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10 (IL-IP)和腫瘤壞死因子-a (TNF- a )之后的單核吞噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中表達(dá)白勺蛋白(Bottazzi, etal.，J. Biol. Chem, 1997 ；272 ;32817_32823)。此蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N-末端不關(guān)聯(lián)于任何已知分子和C-末端類似于短五聚環(huán)蛋白(如C-反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP))。已發(fā)現(xiàn)人PTX3 (hPTX3)和動(dòng)物的PTX3之間本質(zhì)上相似。PTX3基因位于小鼠3號(hào)染色體上類似于人3q區(qū)域(q24_28)的區(qū)域，與所記載hPTX3 位于 3q 25 區(qū)域中的位置一致。而且小鼠 PTX3(mPTX3) (Introna，M.，et al. Blood,87(1996) ；1862-1872)與 hPTX3 在組構(gòu)、位置及序列上非常相似(Breviario, F.，etal.J. Biol. Chem.，267. 22190，1992)。尤其是人的所述基因與小鼠的所述基因間的序列同一性是82%，若再考慮保守置換，會(huì)達(dá)到92%。hPTX3和mPTX 3序列間的高度相似性象征著五聚環(huán)蛋白在進(jìn)化過(guò)程中高度保守(Adv. Immunol. 34 :141,1983)。有關(guān)五聚環(huán)蛋白的概述，請(qǐng)參考H. Gewurz, etal. , Current Opinion inImmunology,1995,7. 54-64。已知之前對(duì)PTX3的應(yīng)用。本申請(qǐng)人提交的國(guó)際專利申請(qǐng)W099/32516(為最接近的現(xiàn)有技術(shù))描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在治療感染性(真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒)、炎性或腫瘤性疾病中的應(yīng)用。在W099/32516中沒(méi)有提到PTX3可用于治療HCMV或流感病毒。
W002/38169描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在制備用于治療與生長(zhǎng)因子FGF-2的異?；罨嚓P(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。W002/36151描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在治療自身免疫疾病中的應(yīng)用。W003/011326描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在治療女性不育中的應(yīng)用。W003/084561描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX 3在制備用于治療與生長(zhǎng)因子FGF-8異常活化相關(guān)的腫瘤性疾病的藥物中的應(yīng)用。W003072603描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在制備用于治療腫瘤的自體疫苗中的應(yīng)
用。W02005060988描述了五聚環(huán)蛋白PTX3和其與TSG-6的組合在制備治療骨或軟骨疾病及治療女性不育的藥物中的應(yīng)用。W02005060997描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX 3的抑制劑在制備用于預(yù)防和治療自身免疫疾病及骨和軟骨的退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。W02005107791描述了五聚環(huán)蛋白PTX3與抗真菌劑的組合在治療真菌感染，尤其是煙曲霉菌引發(fā)的感染中的應(yīng)用。Blood, IJanuary 2006, Volume 107, Number I 描述了 PTX3 參與限制炎性條件下的組織損傷和自身反應(yīng)性細(xì)胞的活化?，F(xiàn)在已令人驚訝并意外地發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3可用于制備用于抑制病毒活化和/或預(yù)防或治療病毒性疾病的藥物。因此，本發(fā)明的目的是應(yīng)用有效量的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3制備用于抑制哺乳動(dòng)物受試者的選自下列的病毒性疾病活化的藥物皰疹病毒，如巨細(xì)胞病毒(CMV);流感病毒，如H1N1、H3N2、H5N1或H5N7病毒；副粘病毒，如麻疹病毒；呼吸道合胞病毒；冠狀病毒，如SARS ；HIV病毒；肝炎病毒；或輪狀病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用有效量的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3制備用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物受試者的選自下列的病毒性疾病的藥物皰疹病毒，如巨細(xì)胞病毒(CMV);流感病毒，如H1N1、H3N2、H5N1或H5N7病毒；副粘病毒，如麻疹病毒；呼吸道合胞病毒；冠狀病毒,如SARS ；HIV病毒；肝炎病毒；或輪狀病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用有效量的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3制備用于治療巨細(xì)胞病毒引發(fā)的綜合征的藥物，其中所述綜合征是CMV單核細(xì)胞增多癥；所述綜合征與免疫減弱宿主有關(guān)；所述免疫減弱宿主患有AIDS ；所述免疫減弱宿主是器官移植接受者。本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用有效量的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3制備用于治療流感引發(fā)的綜合征的藥物，其中引發(fā)所述綜合征的病毒選自H1N1、H3N2、H5N1或H5N7病毒。以下非限制性實(shí)施例闡釋本發(fā)明。材料與方法所用縮寫(xiě):HCMV :人 CMV ；MCMV 鼠 CMV ；DC :樹(shù)突細(xì)胞；gB :糖蛋白 B ；pDC :漿細(xì)胞樣 DC ；PTX3 五聚環(huán)蛋白3。小鼠8至12周齡的野生型(WT)近交C57BL6、129/Sv和BALB/c雌性小鼠購(gòu)自CharlesRiver育種實(shí)驗(yàn)室(Calco，意大利)。使用了以下繁殖對(duì)純合的TLR9-缺陷型(TLR9+)、TLR4-缺陷型(TLR4+)、TLR2-缺陷型(TLR2+)、MyD88_ 缺陷型(MyD88+)和 IL_12p40_ 缺陷型(I L-12P40+)小鼠(全部以C57BL6為背景)，和IFN- y -缺陷型小鼠(IFN- y +、(以 BALB/c 為背景)(Science 2003,301 640)(Nature Immunol. 2001,2 :1144) (Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004,101 :3516) (Immunity 2004,21 :107) (J. Exp. Med. 2002,195 517)，PTX3-缺陷型小鼠(PTX3+)(以產(chǎn)生的 129/Sv_C57BL6 混合背景)(Nature 2002,420 182)，IFN- a 3 受體-缺陷型(IFN- a ^ R—勺小鼠(J. Exp. Med. 2003，197 :885)。 病原體，感染和治療從BALB/c小鼠中制備Smith株MCMV的唾液腺提取物原種，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的空斑實(shí)驗(yàn)在BALB/c小鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞上測(cè)定滴度(J. Gen. Virol. 2002,83 :2983)。將甲型流感病毒/Sydney/5/97 (H 3N2)株培養(yǎng)于含胚卵中，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的空斑實(shí)驗(yàn)在馬-達(dá)二氏犬腎(MDCK)細(xì)胞上測(cè)定了滴度(Virology 2005,340 :296)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射105(BALB/c)，5X105(C57BL6、PTX3+/+和 PTX3+)空斑形成單位(PFU)的MCMV啟動(dòng)感染。將取出的組織各自勻漿，將上清液保存于_80°C，隨后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的空斑實(shí)驗(yàn)在MEF上定量病毒滴度。在無(wú)內(nèi)毒素的條件下，通過(guò)免疫親和方法從經(jīng)PTX3轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中獲得PTX3 (Nature 2002,420 :182)，并從感染當(dāng)天開(kāi)始腹膜內(nèi)給藥(I或4mg/kg) 7或14天。感染后6小時(shí)開(kāi)始以40mg/kg腹膜內(nèi)給藥更昔洛韋(GCV)(賽美威；來(lái)自Recordati,Milan,意大利),每周3次。對(duì)照組只接受稀釋劑。通過(guò)用過(guò)碘酸希夫程序染色石蠟包埋的組織切片做了組織學(xué)檢查。煙曲霉菌菌株和培養(yǎng)條件如所述(Blood2003，102 3807)。對(duì)于共感染，經(jīng)MCMV感染的小鼠在病毒感染后2周靜脈內(nèi)接受5X105的曲霉分生孢子，隨后每日用PTX3(lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)處理一個(gè)星期。通過(guò)殼多糖測(cè)定定量真菌生長(zhǎng)，結(jié)果以“ Ug葡糖胺/器官”表示(Blood 2003,102 3807) 0實(shí)驗(yàn)件HSCT樽型受體小鼠暴露于8Gy的致死劑量，并如所述輸注107/mL來(lái)自同種異體供體小鼠的去除T細(xì)胞的供體細(xì)胞(T細(xì)胞污染< 1% ) (Blood 2003，102 :3807)。HSCT后的MCMV再活化如上述用MCMV感染小鼠。3個(gè)月后，以脾臟(J Immunol 2005，174 :1587)和肺(JVirol 1997,71:2980)中無(wú)急性MCMV感染證實(shí)MCMV處于潛伏期，這兩個(gè)器官被認(rèn)為是分子MCMV潛伏狀態(tài)的主要部位。感染的小鼠或作為同種異體供體未感染骨髓細(xì)胞的接受者(MCMV+接受者)或作為注射到未感染接受者的骨髓細(xì)胞的供體(MCMV+供體)。從HSCT次日開(kāi)始每日給藥PTX3(lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)2周。通過(guò)空斑測(cè)定評(píng)估死亡或存活小鼠(HSCT后30天時(shí)處死)肺中的MCMV病毒載量。DC亞群的產(chǎn)牛從培養(yǎng)于改良的Iscove培養(yǎng)液中的骨髓細(xì)胞獲得小鼠DC(Blood2003，102 3807)，在 150U/mL 小鼠 rGM-CSF (Sigma)和 75U/mL rIL-4 (R&D Systems)存在下培養(yǎng) I 天以獲得 CD11+DC,或在 200ng/mLFLT3-L(Immunex Corporation, Seattle, WA)存在下培養(yǎng) 9天以獲得pDC(Blood 2003,102:3807)。如Blood 2003，102 :3807所述進(jìn)行最后的成熟過(guò)程，根據(jù)⑶Ilchigh表達(dá)識(shí)別⑶11+DC，其典型地由⑶8 a +DC和⑶Ilb+DC組成。pDC被定義為 CDllc1。' Ly6G+CD8a+/_ 細(xì)胞。用 CDllc MicroBeads 和 MidiMacs (Miltenyi Biotec)通過(guò)磁激活分離法純化脾臟DC。用高分辨率顯微彩色照相機(jī)AxioCam,用AxioVision軟件Rel. 3. I (Carl Zeiss S. p. A. , Milano,意大利)拍攝照片。
_3] 流式細(xì)胞檢測(cè)分析對(duì)于全部FACS分析，細(xì)胞首先與抗CD16/32(2. 4G2)溫育以保證阻斷FcR，再用配備有CELLQuest 軟件的FACScan流式細(xì)胞突光測(cè)定儀(Becton Dickinson, MountainView, CA)分析抗原表達(dá)。用無(wú)關(guān)Ab對(duì)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照染色以獲得背景熒光值。Ab來(lái)自BDPharmingen0所得數(shù)據(jù)評(píng)估為陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。直方圖代表四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。 宇斑測(cè)丨定將培養(yǎng)至分匯合的細(xì)胞與系列稀釋的病毒樣品于37°C下溫育2小時(shí)后進(jìn)行空斑測(cè)定(Science 2001,292 :934)。所有未感染動(dòng)物的器官中都未檢測(cè)到病毒。病毒滴度以Iogltl表示(平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差，SE)。PTX3向固定化病毒的結(jié)合實(shí)驗(yàn)96孔板用含有IO4PFU的MCMV或H 3N2人流感病毒的0. 05M碳酸鹽溶液(0. 159gNa2CO3和0. 293g NaHCO3,pH9. 8) (Sigma)于4°C包被過(guò)夜。用含有5%牛血清白蛋白的PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用HCMV Ag包被的平板(AID GmbH，德國(guó))測(cè)量PTX3與HCMV的結(jié)合。用0. 5、1或5iig/mL生物素標(biāo)記的PTX3(PTX3bio+)于37°C下結(jié)合2小時(shí)。通過(guò)在加A PTX3bio+前，用0. 5或5 ii g/mL未生物素化的PTX3 (PTX3bio_)于37°C下預(yù)溫育2小時(shí)而進(jìn)行抑制。用辣根過(guò)氧化物酶底物試劑盒(Bio-Rad Laboratories,Life Science Group,Segrate意大利)讀取450nm下的光密度。PTX3與未包被病毒的平板間的非特異性結(jié)合為最低限度。病毒復(fù)制的抑制將培養(yǎng)至分匯合的MEF細(xì)胞(2 X IO4/孔)與稀釋于無(wú)血清DMEM中的5_0. 5 u g/mL PTX3于37°C下預(yù)溫育2小時(shí)后加入IO4PFU的MCMV，或未處理而用經(jīng)5-0. 5 u g/mL PTX3于37°C下預(yù)處理2小時(shí)的IO4PFU的MCMV感染。在所選實(shí)驗(yàn)中，用中和PTX3的單克隆抗體(70ng/100uL) (Clin. Exp. Immunol. 2000,119 :196)最小化后遺作用。如開(kāi)始的實(shí)驗(yàn)所指示，于37°C溫育72小時(shí)后測(cè)量感染力。于每板中的一孔進(jìn)行模擬感染并作為細(xì)胞對(duì)照組。DC的情況下，將IO6/細(xì)胞/孔與稀釋于無(wú)血清DMEM中的5 ii g/mL PTX3于37°C預(yù)溫育2小時(shí)后加入IO5PFU的MCMV，或未處理而用經(jīng)5-0. 5 u g/mL PTX3于37°C下預(yù)處理2小時(shí)的IO5PFU的MCMV感染。溫育48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞測(cè)定感染性。為抑制H 3N2復(fù)制，將3X IO4PFU的病毒粒子在加入到鋪滿的MDCK細(xì)胞前于37°C下暴露于5-0. 5 ii g/mL PTX3 2小時(shí)。在感染后的不同天通過(guò)空斑測(cè)定估計(jì)感染力。NK細(xì)胞的細(xì)胞毒件將用DX5微珠(Miltenyi Biotec)從脾臟中純化而來(lái)的NK細(xì)胞定義為NKl. 1+CD3-細(xì)胞。估計(jì)了對(duì)經(jīng)51Cr標(biāo)記的YAC-1淋巴瘤細(xì)胞的NK溶胞活性(Blood 2005，106 4397)。實(shí)時(shí)RT-PCR 以定量 MCMV 的 mRNA用高靈敏RT-PCR測(cè)定法擴(kuò)增了 MCMV糖蛋白B (gB) DNA的356_bp片段(Virus Res2003,98 :17)。將細(xì)胞在液氮中破裂后用TRIzol提取總細(xì)胞RNA(Invitrogen LifeTechnologies, Milan, Italy)。如所述進(jìn)行 cDNA 的合成和 PCR(Blood 2003，102 :3807)。合成的DNA寡核苷酸引物選自公布的MCMVgB基因序列(J. Immunol. 2005，175 :6723)。有義引物基于cDNA No. 2416-2443 :5’ -AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-3’，反義引物基于 No. 2745-2772 :5’ -CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TC G-3’。為檢驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中是否存在DNA，用下列寡核苷酸進(jìn)行了平行的肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增5’-GAG-ACC-TTC-AAC-ACC-CCA-GCC (有義)和 5’-GGC-CAT-CTC-ITG-CTC-GAA-GTC (反義)。用循環(huán)變溫加熱器(MasterCycler gradient ；Eppendorf)進(jìn)行PCR,循環(huán)條件是于95°C初始變性3分鐘，然后是95°C I分鐘、50°C I分鐘、72°C 20秒鐘的循環(huán)，最后于72°C延伸10分鐘。通討ELISA和ELISP0T測(cè)定法定量細(xì)朐閔子通過(guò)ELISA (R&D Systems and PBL, Biomedical Lab, Milan,意大利)測(cè)定了絲裂原刺激的脾臟細(xì)胞(用10 ii g/mL ConA刺激48小時(shí))或MCMV脈沖刺激的DC (24小時(shí))的培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平。所述測(cè)定的檢出限(pg/mL)是IL-12p70小于16、IFN-y小于10、IL-10小于3、及IFN-小于10。如所述通過(guò)ELISP0T測(cè)定來(lái)自脾臟的經(jīng)純化NK而計(jì)算了產(chǎn)生IFN-Y的NK細(xì)胞數(shù)量(Blood 2003，102:3807)。結(jié)果以每IO5細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的平均數(shù)量(土SE)表示，用細(xì)胞的2倍系列稀釋液的平行測(cè)定值計(jì)算。通過(guò)ELISA 定量 PTX3如所述通過(guò)ELISA進(jìn)行血清和肺勻漿(感染后I周時(shí))中PTX3的定量(Eur.J. Tmmun01. 2003,33 :2886)。統(tǒng)計(jì)分析用Student氏配對(duì)t檢驗(yàn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組值的顯著性(以p < 0. 05定義顯著性)。用曼-惠特尼u檢驗(yàn)分析存活數(shù)據(jù)。體內(nèi)組由6個(gè)動(dòng)物組成。除另有說(shuō)明外，數(shù)據(jù)是平均值土SE。結(jié)果PTX3在體外抑制CMV感染為檢驗(yàn)PTX3是否在體外影響CMV感染，評(píng)估了 I) PTX3結(jié)合于HCMV或MCMV的能力，2)病毒暴露于PTX3對(duì)于對(duì)允許性MEF細(xì)胞的有效感染的影響，和3)用PTX3處理MEF細(xì)胞對(duì)隨后的病毒感染的影響。PTX3以依賴于劑量的方式結(jié)合HMCV和MCMV，并在未標(biāo)記的PTX3存在下，所述結(jié)合顯著下降(

圖1A)。在抗150(晚期)、65和52(早期)或28 (特異性)kDa抗原的人抗體存在下，PTX3和HCMV的結(jié)合不被抑制，這一發(fā)現(xiàn)提示被PTX3和人特異性抗體識(shí)別的病毒分子的多樣性。根據(jù)72小時(shí)后通過(guò)感染細(xì)胞中MCMVgB轉(zhuǎn)錄物水平減少所評(píng)價(jià)，暴露于PTX3以依賴于劑量的方式強(qiáng)烈抑制病毒感染(圖1A)。抑制效應(yīng)很快，在暴露30-45分鐘后就已經(jīng)獲得滅活。有趣的是，用最高濃度PTX3預(yù)處理細(xì)胞也可抑制感染。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中殘留的PTX3被特異性的抗體中和，排除了游離的PTX3對(duì)細(xì)胞或所述病毒的可能的后遺作用，這些發(fā)現(xiàn)提示，PTX3影響病毒的感染力及細(xì)胞對(duì)所述感染的允許性。為估計(jì)PTX3是否會(huì)類似地結(jié)合其它有包膜病毒，評(píng)價(jià)了 PTX3在體外結(jié)合H3N2人流感病毒并抑制其感染力的能力。圖IB顯示，根據(jù)在所用最高濃度的PTX3時(shí)觀察到的致細(xì)胞病變效應(yīng)完全降低確定，PTX3在體外以依賴于濃度的方式且特異性地強(qiáng)烈結(jié)合所述病毒，并大大抑制其感染力。預(yù)處理細(xì)胞后PTX3還輕微延遲感染，此發(fā)現(xiàn)證實(shí)PTX3可能影響細(xì)胞對(duì)所述感染的允許性。在這兩種細(xì)胞類型中，PTX對(duì)細(xì)胞單層鋪滿和/或細(xì)胞形態(tài)都沒(méi)有可見(jiàn)的影響，證實(shí)PTX3無(wú)毒。MCMV的急性感染在易感BALB/c小鼠中誘發(fā)短暫但深度的免疫抑制，其可聯(lián)系到CDll+DC的感染(Nat Immunol 2001,2:1077)。CDll+DC支持MCMV的體內(nèi)和體外有效感染，然而 MCMV 不在 pDC 內(nèi)復(fù)制(J. Exp. Med. 2002，195 :517)。為評(píng)價(jià)PTX3是否也會(huì)影響MCMV對(duì)DC的感染，將經(jīng)PTX3處理的MCMV加入到來(lái)自 BALB/c小鼠的⑶Il+DC和pDC，并如上述評(píng)價(jià)了感染力。也在感染前用PTX3預(yù)處理了 DC。結(jié)果顯示，MCMV在CDll+DC中復(fù)制，但PTX3處理所述病毒或所述細(xì)胞大大降低病毒復(fù)制。在pDC中檢測(cè)不到任何病毒復(fù)制(圖1C)。PTX3還降低來(lái)自C57BL6小鼠的⑶II+DC內(nèi)的病毒復(fù)制。這些結(jié)果提示，PTX3可能通過(guò)抑制病毒感染力及通過(guò)縮短所述感染的后續(xù)階段而預(yù)防MCMV感染。PTX3在體內(nèi)保護(hù)對(duì)抗CMV感染和再活化上述結(jié)果可預(yù)測(cè)PTX3具有體內(nèi)抗病毒效應(yīng)。評(píng)價(jià)了 PTX3給藥在易感(BALB/c)或抗性(C57BL6)小鼠的急性原發(fā)感染及在HSCT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性倩罨械男?yīng)。腹膜內(nèi)給藥亞致死量的MCMV感染小鼠，所述小鼠再用不同劑量的PTX3或GCV處理，于感染后1、2及4周用標(biāo)準(zhǔn)的空斑實(shí)驗(yàn)滴定測(cè)定了其脾臟、肺、肝臟和唾液腺中的滴度載量(圖2A)。與之前的報(bào)道(Virus Res 2003,98 :17) 一致，相比C57BL6小鼠，MCMV在易感的BALB/c小鼠內(nèi)臟中復(fù)制到高的滴度，尤其是在感染早期。但PTX3在此早期顯著降低所述病毒載量，尤其是在肺和脾臟中，在其中所述效應(yīng)與感染后I周時(shí)GCV的效應(yīng)相似。在易感小鼠的肺和脾臟中的所述抗病毒效應(yīng)比在抗性小鼠中更顯著(大于兩個(gè)對(duì)數(shù)的差別)。在C57BL6抗性小鼠肝臟中的所述病毒滴度低于易感的BALB/c小鼠，且?guī)缀醪皇躊TX3處理的影響。用PTX3延長(zhǎng)處理(2周)更有效，尤其是在肺和脾臟中(圖2A)。用PTX3處理還改善易感小鼠肺、脾臟和肝臟中的炎性病理和細(xì)胞募集反應(yīng)。這些結(jié)果提示，PTX3可能是宿主抗病毒免疫應(yīng)答的重要組分。為直接弄清這一問(wèn)題，測(cè)量了感染過(guò)程中產(chǎn)生的PTX3水平，及評(píng)價(jià)了 PTX3+小鼠對(duì)MCMV的易感性及對(duì)外源性PTX3給藥的反應(yīng)性。感染后循環(huán)PTX3水平?jīng)]有升高(在BALB/c小鼠中從16，0到16. 7ng/mL，及在C57BL6小鼠中從14，0到16. Ong/mL)。但在肺中的局部水平顯著升高，尤其是在BALB/c小鼠(從0.5到2. 13ng/mL)中。與這些發(fā)現(xiàn)一致，PTX3+小鼠比PTX3+/+小鼠對(duì)感染更易感，尤其是在肺中，其病毒滴度在用PTX3處理后大大降低。PTX3不改變PTX3+小鼠肝中的低病毒滴度(圖2B)。有趣的是，PTX3大大降低這些小鼠唾液腺中的病毒載量。對(duì)感染小鼠肺的組織學(xué)檢查顯示，相比PTX3+/+小鼠，PTX3+小鼠的炎性病理更嚴(yán)重，包含重度細(xì)胞募集反應(yīng)，伴隨實(shí)質(zhì)破壞、支氣管周圍纖維變性及Globet細(xì)胞增生的跡象。但在兩種類型的小鼠中，用PTX3處理均大大改善炎癥應(yīng)答(圖2C)。總之，這些數(shù)據(jù)提示，PTX3有助于宿主對(duì)MCMV的免疫應(yīng)答，外源供應(yīng)PTX3可有決定性的抗病毒效果。
因?yàn)橥N異體移植后潛伏的HCMV的再活化是主要臨床問(wèn)題，也評(píng)價(jià)了 PTX3在實(shí)驗(yàn)性HSCT中的MCMV再活化中的影響。因?yàn)楣w或接受者的HCMV血清陽(yáng)性可與免疫介導(dǎo)的并發(fā)癥的危險(xiǎn)增加有關(guān)(Lancet，2004，Infect Dis. 4 :725)，用易感或抗性小鼠，在MCMV+接受者或MCMV+供體中評(píng)價(jià)了 PTX3的活性。從存活率降低且肺中的病毒復(fù)制升高來(lái)看，在每個(gè)組合中MCMV的再活化發(fā)生于移植物植入后的10至20天之間。但從長(zhǎng)期生存且?guī)缀鯚o(wú)病毒復(fù)制來(lái)看，用PTX3處理完全阻止了病毒再活化(圖2D)。PTX3保護(hù)經(jīng)MCMV感染的小鼠不患侵襲性肺曲霉病、HCMV再活化容易誘發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括曲霉菌(Aspergillus spp.)的二重感染(Oncology(Williston Park)2000，14 :1701)。如已顯示的那樣，PTX在宿主的抗真菌免疫中發(fā)揮非冗余作用，且用PTX3處理在實(shí)驗(yàn)性HSCT中防止曲霉病發(fā)生(Nature 2002,420:182)。為評(píng)價(jià)是否用PTX 3處理MCMV感染的小鼠也降低其患侵襲性曲霉病的危險(xiǎn)，用PTX3處理MCMV感染的小鼠一個(gè)星期，并在一個(gè)星期后氣管內(nèi)感染曲霉分生孢子。結(jié)果顯示，從目標(biāo)器官中真菌負(fù)荷增加來(lái)看，用MCMV預(yù)感染增加了真菌的感染力。但用PTX3處理幾乎完全降低了真菌生長(zhǎng)，且恢復(fù)了抗真菌抵抗力(圖2E)。PTX3在MCMV感染中恢復(fù)DC/NK反應(yīng)性且促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生MCMV感染易感的BALB/c小鼠的最顯著特征之一是脾臟中⑶8 a +DC早期消失，可能是由于缺乏支持該 DC 亞群的 NK 細(xì)胞(Nat. Immunol. 2001,2 :1077 ；Nat. Immunol. 2003,4 175)。實(shí)際上，在感染中CD8 a +DC和Ly49H NK細(xì)胞群的擴(kuò)增相互調(diào)節(jié)(Mol.Tmmun01. 2005,42 547)。因此我們尋找了 PTX3對(duì)MCMV感染小鼠脾臟和肺中DC亞群和NK細(xì)胞的擴(kuò)增和功能活性的影響。圖3顯示，PTX3處理不影響兩個(gè)器官中的⑶4+或⑶8+T細(xì)胞擴(kuò)增(A)，而擴(kuò)增了脾臟中的CDllc+DC和CD8 a +DC亞群(B)，及脾臟和肺中的NKl. I+NK細(xì)胞(C)。從活化標(biāo)記⑶69表達(dá)升高看來(lái)，NK細(xì)胞被充分活化⑶。PTX3處理后，產(chǎn)生IFN- y的細(xì)胞的頻率和離體純化的脾臟NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性被顯著上調(diào)(圖3E)。PTX3處理沒(méi)有擴(kuò)增及活化未感染小鼠的NK細(xì)胞。因?yàn)镸CMV感染中的NK細(xì)胞早期活化受IFN- a / 0 (促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增生)和11-12(誘導(dǎo)正^￥產(chǎn)生)介導(dǎo)(J. Exp. Med. 2003，197 :885)，評(píng)估了 DC亞群在PTX3存在下暴露于MCMV后產(chǎn)生細(xì)胞因子的模式。通過(guò)使用來(lái)自未感染BALB/c小鼠的骨髓衍生⑶II+DC和pDC亞群以允許區(qū)分PTX3對(duì)DC和其對(duì)病毒本身的影響。將DC在病毒感染前用PTX3預(yù)處理，或未處理而用經(jīng)PTX3處理的MCMV感染。與之前的發(fā)現(xiàn)(Nat. Immunol. 2005，1011) 一致，兩個(gè)DC亞群均響應(yīng)病毒產(chǎn)生IFN-a和11-12口70，盡管口0(產(chǎn)生的比^111)〇多。在細(xì)胞或病毒處理之后，PTX3增加兩種細(xì)胞因子產(chǎn)生，特別是IL-12p70，但僅僅是對(duì)于CDllc+DC(圖4A)，且受到來(lái)自C57BL6小鼠的DC誘導(dǎo)(盡管程度較低)。這些數(shù)據(jù)加上圖I顯示的數(shù)據(jù)提示，與⑶II+DC的感染性和細(xì)胞因子產(chǎn)生大大受PTX3的影響相反，PTX3既不影響pDC響應(yīng)MCMV的感染性也不影響其活化程序。為聯(lián)系體外細(xì)胞因子產(chǎn)生模式和發(fā)生在體內(nèi)的模式，測(cè)量了來(lái)自經(jīng)MCMV原發(fā)感染且經(jīng)PTX3處理的小鼠的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-12p70、IFN-a ,IFN-y和IL-10的產(chǎn)生。還比較了易感和抗性小鼠及PTX3+和PTX3+/+小鼠間的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平。發(fā)現(xiàn)用PTX3處理導(dǎo)致易感(BALB/c和PTX3+)和抗性(C57BL6和PTX3+/+)小鼠中所有細(xì)胞因子的產(chǎn)量升高，盡管后者中程度較低(圖4B)。總之，這些數(shù)據(jù)提示，響應(yīng)于MCMV，PTX3促進(jìn)依賴于IL-12的途徑甚于依賴于IFN-a的途徑。這也在再活化模型中得以證實(shí)，其中PTX3的保護(hù)作用與依賴于IL-12p70/IFN-Y的途徑的活化相關(guān)，尤其是在接受者是血清陽(yáng)性的條件下(圖4C)。PTX3的效力有賴依賴于IL-12p70/IFN-y的途徑
為直接評(píng)估IFN- a、IL-12p70和IFN- y的產(chǎn)生在急性MCMV感染中PTX3的保護(hù)效力中的相對(duì)作用，評(píng)價(jià)了具有IFN- y、IL-12p40和IFN- a 缺陷的小鼠中PTX 3的相對(duì)效力。如已報(bào)道(J. Exp. Med. 2003，197 :885)，從與相對(duì)應(yīng)的野生型小鼠相比，肺中病毒載量升高多于I個(gè)對(duì)數(shù)來(lái)看，具有IFN-Y或IFN-a PR缺陷大大增加對(duì)感染的易感性。相反，IL_12p40缺陷并不顯著增加病毒載量(從3.4X103到4.2X103，野生型相對(duì)于IL-12P40+小鼠)(圖5A)。PTX3抑制IFN- a ^ R+的病毒載量多于I個(gè)對(duì)數(shù)，高于野生型小鼠中所觀察到的效應(yīng)。相反，與相對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照小鼠相比，IFN- y +或IL-12p40+中的抑制活性顯著降低(經(jīng)PTX3處理后，在I FN- y +中從6. 3到61og1Q相對(duì)于在BALB/c野生型中4. 8到3. 41og10,在IL-12P40+中從3. 6到3. 41og10相對(duì)于在C57BL6野生型中3. 4到2. 91og10)(圖5A)。經(jīng)PTX3處理的IFN- a ^ R+小鼠產(chǎn)生高水平的IL-12和IFN- y，此發(fā)現(xiàn)證實(shí)IL-12p70/IFN-Y軸在PTX3的保護(hù)效力中具有顯著作用。PTX3活化對(duì)MCMV的不依賴于TLR9/MyD88的感知作用有效的抗MCMV免疫監(jiān)督要求有功能的TLR信號(hào)，尤其是TLR9/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)快速清除MCMV具有決定性的作用，而TLR2、TLR3和TLR4似乎不起顯著的作用(Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004，101 :3516)。為評(píng)價(jià)急性感染中TLR在PTX3效力中的作用，用MCMV攻擊TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型小鼠，追蹤肺中的病毒復(fù)制。根據(jù)公布的數(shù)據(jù)(Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 2004，101 :3516)，TLR9+ 和尤其是 MyD88+ 小鼠比 C57BL6 小鼠更易感MCMV,而TLR2和TLR4缺陷不顯著影響小鼠的抵抗力(圖5B)。PTX3不僅仍在TLR9+和MyD88v^小鼠中有效，其效力相比C57BL6小鼠明顯升高，尤其是在MyD88+小鼠中(PTX3處理后，在野生型中從3. 4到2. 91og1Q相對(duì)于在MyDSS+小鼠中4. 8到3. 21og1(l和在TLR9+小鼠中3. 9到31og1Q)。有趣的是，PTX3在TLR2+和TLR4+小鼠中完全無(wú)效，此發(fā)現(xiàn)提示這些TLR可能參與PTX3對(duì)抗病毒免疫應(yīng)答的活化。PTX3的效力再次與IL-12和IFN- y水平直接相關(guān)，所述IL-12和IFN- y水平在來(lái)自MyDSS+和TLR9+小鼠的脾細(xì)胞上清液中顯著升高-否則其產(chǎn)量會(huì)如其它實(shí)驗(yàn)已顯示的那樣低(J. Immunol. 2005，175 :6723)，及在TLR2+和TLR4+小鼠中消失(圖5)。此發(fā)現(xiàn)與已公布的數(shù)據(jù)一致，顯示盡管在血清中顯著缺乏，在MyD88+和TLR9+小鼠中可產(chǎn)生延遲但顯著高水平的IFN_y (JImmunoI. 2005，175 6723)。因?yàn)樗衅渌鸗LR(除了 TLR3)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也都需要MyD88連接蛋白(Annu.Rev. Immunol. 2003,21 :335)，因此TLR(非TLR9)途徑參與對(duì)MCMV的感知及隨后由PTX3誘導(dǎo)的應(yīng)答。本發(fā)明旨在提供分配給或用于分配給接受病毒性疾病治療(或抑制病毒活化)的患者的治療包，包括一個(gè)或多個(gè)單位劑量，每個(gè)單位劑量中包含一定量的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3，從而使得定期給藥一個(gè)或多個(gè)所述單位劑量可有效治療如HCMV ;和為此的成品藥用容器，所述容器可進(jìn)一步含有或包含標(biāo)簽，所述標(biāo)簽指示所述長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3用于治療患有如HCMV的患者。另外，本發(fā)明旨在提供一種產(chǎn)品，包括包裝材料和包含在所述包裝材料中的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3，其中所述長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3對(duì)治療HCMV是治療上有效的，且其中所述包裝材料包含標(biāo)簽，所述標(biāo)簽指示所述長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3可用于治療HCMV。根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“治療(treat) ”或“治療(treating) ”具有其通常的含義，包含預(yù)防、阻止、減輕、抑制、改善、停止、遏制、減緩、逆轉(zhuǎn)病毒性疾病進(jìn)展、活化，或降低所述病毒性疾病的嚴(yán)重性。根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“有效量”指一定量的化合物，其能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的結(jié)果。例如，用于治療病毒性疾病而給藥的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3的 有效量是指預(yù)防、阻止、減輕、改善、停止、遏制、減緩或逆轉(zhuǎn)所述病毒性疾病進(jìn)展或降低所述病毒性疾病嚴(yán)重性所需的量，根據(jù)初級(jí)護(hù)理醫(yī)師的判斷，日給藥劑量將取決于受試者的體重、年齡和患者綜合狀況。本發(fā)明還包括使用藥物制劑的方法，所述藥物制劑含有作為活性成分的長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3與藥物載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道這樣的制劑及其生產(chǎn)，請(qǐng)參考如REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)。所述制劑優(yōu)選配成所述活性成分的單位劑量形式。術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指物理上分離的單元，適合于以單元的劑量實(shí)施于人類受試者，每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)設(shè)量的活性物質(zhì)，聯(lián)合合適的藥物賦形劑。所述長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3可以藥物組合物的形式與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑結(jié)合給藥，根據(jù)所述化合物在所選載體和/或賦形劑中的溶解度和化學(xué)性質(zhì)，所選給藥途徑，及標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐確定載體或賦形劑的比率和性質(zhì)。藥物組合物以藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方式制備，請(qǐng)參考如REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES, (16th ed. 1980)。所述載體或賦形劑可為固體、半固體、或液體物質(zhì)，其可作活性成分的載體(vehicle)或介質(zhì)(medium)。合適的載體或賦形劑為本領(lǐng)域熟知。所述藥物組合物可適合于口服、吸入、胃腸外、或局部應(yīng)用，且可以片劑、膠囊、氣霧劑、吸入劑、栓劑、溶液、懸液、月旨質(zhì)體等形式給予患者。附圖討論圖IPTX在體外結(jié)合目.抑制CMV和流感病毒復(fù)制(A)生物素標(biāo)記的PTX3(PTX3bio+)與人(HCMV)或小鼠(MCMV)病毒的結(jié)合。將不同濃度的未生物素化的PTX3(PTX3bio_)加入到HCMVAg包被的或MCMV包被的平板上，于37°C下溫育2小時(shí)，之后加入不同濃度的PTX3bio+，再于37°C下溫育2小時(shí)。用辣根過(guò)氧化物酶底物試劑盒讀取450nm下的光密度。*P < 0. 05，I或0. 5 y g/mL相對(duì)于5 u g/mLPTX3bio+ < 0. 05，有和無(wú)PTX3bio_的PTX3bio+。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。為抑制病毒復(fù)制，將MEF細(xì)胞未處理而用未處理的MCMV感染(0);未處理而用經(jīng)5-0. 5 u g/mL PTX3預(yù)處理的MCMV感染(V);或與5-0. 5 u g/mL PTX3預(yù)溫育(C)后加入未處理的MCMV。-，未感染細(xì)胞。感染后72小時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR評(píng)價(jià)MCMVgB轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。所示結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的I個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。
(B)PTX3bio+與人H3N2流感病毒的結(jié)合。如上述向用H3N2包被的平板中加入PTX3bio-繼而PTX3bio+。*P < 0. 05，有和無(wú)PTX3bio1 勺PTX3bio+。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。為抑制病毒復(fù)制，將MDCK細(xì)胞用經(jīng)0. 5-5 u g/mL PTX3預(yù)處理的H3N2感染后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的空斑測(cè)定評(píng)價(jià)了病毒復(fù)制。所示結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的I個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。(C)DC是在GM-CSF(CD11+DC)或Flt3L(漿細(xì)胞樣細(xì)胞，pDC)的存在下產(chǎn)生自BALB/c小鼠的骨髓祖細(xì)胞，將所述DC用MCMV感染(表示為MCMV)，并在48小時(shí)后用光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)其形態(tài)，并如上述通過(guò)實(shí)時(shí)PCR評(píng)價(jià)病毒復(fù)制。將細(xì)胞于感染前在37°C下暴露于5 ii g/mLPTX3 2小時(shí)(表示為PTX3+MCMVa)，或暴露于經(jīng)PTX3處理的病毒粒子(表示為PTX3+MCMVb)。_，未感染細(xì)胞。圖2PTX3在體內(nèi)保護(hù)對(duì)抗CMV感類和再活化(A和 B)用 IO5(BALB/c)，5X IO5(C57BL6、PTX3+/+和 PTX3+) PFU 的 MCMV腹膜內(nèi)感染動(dòng)物。通過(guò)對(duì)在不同時(shí)間取出的組織的標(biāo)準(zhǔn)的空斑測(cè)定在MEF細(xì)胞上定量了病毒滴度。從感染當(dāng)天開(kāi)始給藥PTX3和GCV。對(duì)照組只接受稀釋劑。病毒滴度以Iogltl表示(平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差，SE)。結(jié)果是4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(C)過(guò)碘酸希夫式染色來(lái)自用MCMV感染，并如上述經(jīng)PTX3 (+)或稀釋劑(_)處理一周的PTX3+/+和PTX3+小鼠的肺切片的組織學(xué)分析。與PTX3+/+小鼠相比，在PTX3+小鼠中觀察到更多的細(xì)胞募集反應(yīng)，伴有實(shí)質(zhì)破壞、支氣管周圍纖維變性和Globet細(xì)胞增生的跡象(插圖中是放大了 20倍的圖象)，PTX3處理改善了所述反應(yīng)和伴隨的跡象。在處理次日進(jìn)行組織學(xué)檢查。全部圖片是放大了 10倍的圖象。(D)如上述用MCMV感染BALB/c或C57BL6小鼠。三個(gè)月后，以脾臟和肺中無(wú)急性MCMV感染來(lái)證實(shí)MCMV處于潛伏期。感染的小鼠或作為同種異體供體未感染骨髓細(xì)胞的接受者(MCMV+接受者)或作為注射到未感染接受者的骨髓細(xì)胞的供體(MCMV+供體)。從HSCT次日開(kāi)始每日給藥PTX3 (lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)2周。通過(guò)空斑測(cè)定估計(jì)死亡或存活小鼠(HSCT后30天處死)肺中的MCMV病毒載量。MST，半數(shù)存活時(shí)間(天數(shù))。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P < 0. 05,處理和未處理小鼠之間的肺病毒載量。(E)感染MCMV的BALB/c小鼠在病毒感染后2周，靜脈內(nèi)接受曲霉分生孢子，隨后每日用PTX3 (lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)處理一個(gè)星期。感染后3天通過(guò)殼多糖測(cè)定定量真菌生長(zhǎng)，結(jié)果以殼多糖含量(Ug葡糖胺/器官)表示。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P<0.05，MCMV感染的小鼠相對(duì)于未感染小鼠的真菌載量。**P < 0. 05，PTX處理的相對(duì)于未處理的MCMV感染的小鼠的真菌載量。圖3PTX在體內(nèi)支持樹(shù)突細(xì)胞和NK細(xì)胞活化對(duì)來(lái)自未處理(-)或經(jīng)PTX3處理(lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)一周后一天(+)MCMV感染的BALB/c小鼠的總脾臟和肺細(xì)胞(A，C)、脾臟DC (B)、脾臟和肺NK細(xì)胞(D)的表型分析。無(wú)(None)，未感染的小鼠。數(shù)值代表FACS分析中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。(E)通過(guò)ELISP0T測(cè)定來(lái)自如上述感染和處理的BALB/c小鼠的產(chǎn)生IFN- y的脾 臟NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的針對(duì)YAC-I靶的51Cr釋放測(cè)定)和頻率。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P < 0. 05，感染相對(duì)于未感染小鼠。**P < 0. 05，PTX3處理的相對(duì)于未處理的經(jīng)感染的小鼠。所示結(jié)果代表5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的3個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。圖4PTX3促講細(xì)朐閔子產(chǎn)牛(A)在GM-CSF(CDllc+)或Flt3L(pDC)存在下從BALB/c小鼠的骨髓祖細(xì)胞產(chǎn)生DC。為產(chǎn)生細(xì)胞因子，將DC于感染前預(yù)暴露于5 ii g/mL PTX3 (a)或未處理而用經(jīng)PTX3處理的病毒感染(b)。通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子，以pg/mL表示。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P< 0.05，經(jīng)MCMV感染的DC相對(duì)于未感染DC的細(xì)胞因子產(chǎn)量。#P<0. 05，用經(jīng)PTX3處理的病毒感染的DC相對(duì)于經(jīng)PTX3處理的DC。(B)MCMV感染過(guò)程中小鼠中細(xì)胞因子產(chǎn)生。來(lái)自經(jīng)MCMV原發(fā)感染并經(jīng)PTX3處理的小鼠的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平(以Pg/mL表示)。*P<0.05，經(jīng)PTX 3處理的小鼠相對(duì)于未處理小鼠。(C)MCMV再活化模型中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。用MCMV感染BALB/c或C57BL6小鼠。感染的小鼠或作為同種異體供體未感染骨髓細(xì)胞的接受者(MCMV+接受者)或作為注射到未感染接受者的骨髓細(xì)胞的供體(MCMV+供體)。從HSCT次日開(kāi)始每日給藥PTX3 (lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)2周。通過(guò)ELISA測(cè)定脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平(pg/mL)。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P < 0. 05，經(jīng)PTX3處理的相對(duì)于未處理的小鼠。圖5PTX3 活件依賴于 IL-12/IFN- Y ,不依賴于 TLR9/MvD88(A)經(jīng) MCMV 感染和 PTX3 處理后 BALB/c、IFN-Y+、C57BL6、IL_12p40+ 和IFN- a @ + 小鼠的感染和病毒載量。用 IO5 (BALB/c, IFN- y +、，5 X IO5 (C 57BL6、IL-12P40+和I FN-a P _勺PFU的MCMV腹膜內(nèi)感染動(dòng)物。通過(guò)對(duì)感染后7天取出的肺組織的標(biāo)準(zhǔn)空斑測(cè)定在MEF細(xì)胞上定量病毒滴度。從感染當(dāng)天開(kāi)始每日給藥PTX3 (lmg/kg/腹膜內(nèi)給藥)一個(gè)星期。對(duì)照組只接受稀釋劑。病毒滴度以Iogltl表示。短線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P < 0. 05，經(jīng)MCMV處理的小鼠相對(duì)于未經(jīng)MCMV處理的小鼠。結(jié)果代表4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(B)經(jīng) PTX3 處理的 C57BL6、TLR2+、TLR4+、TLR9+ 和 MyD88+ 小鼠中的 MCMV 復(fù)制。如上述用 5X10s(C57BL6、TLR2+、TLR4+、TLR9+、MyD88+)PFU 的 MCMV 腹膜內(nèi)接種并用PTX3處理小鼠。感染后I周時(shí)通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定肺中的MCMV商度。對(duì)照組只接受稀釋齊U。病毒滴度以Iogltl表示。短線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P< 0.05，經(jīng)MCMV處理的小鼠相對(duì)于未經(jīng)MCMV處理的小鼠。結(jié)果代表4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。本申請(qǐng)涉及以下項(xiàng)目I.長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在制備預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物受試者的病毒性疾病的藥物中的應(yīng)用。2.項(xiàng)目I的應(yīng)用，用于抑制病毒活化。3.項(xiàng)目I或2的應(yīng)用，其中所述病毒選自皰疹病毒、流感病毒、副粘病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、HIV病毒、肝炎病毒或輪狀病毒。4.項(xiàng)目3的應(yīng)用，其中所述皰疹病毒是巨細(xì)胞病毒(CMV);所述流感病毒選自H1N1、H3N2、H5N1或H5N7 ;所述副粘病毒是麻疹病毒；所述冠狀病毒是SARS。5.項(xiàng)目I的應(yīng)用，用于治療巨細(xì)胞病毒引發(fā)的綜合征，其中所述綜合征是CMV單核細(xì)胞增多癥；
所述綜合征與免疫減弱宿主有關(guān)；所述免疫減弱宿主患有AIDS ;所述免疫減弱宿主是器官移植接受者。6.項(xiàng)目I的應(yīng)用，用于治療流 感引發(fā)的綜合征。
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3在制備預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物受試者的病毒性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述病毒是流感病毒。
2.權(quán)利要求I的應(yīng)用，用于抑制病毒活化。
3.權(quán)利要求I或2的應(yīng)用，其中所述流感病毒選自H1N1、H3N2、H5N1或H5N7。
4.權(quán)利要求I的應(yīng)用，用于治療流感引發(fā)的綜合征。
全文摘要
描述了長(zhǎng)五聚環(huán)蛋白PTX3(PTX3)或其有功能的衍生物之一在制備預(yù)防或治療病毒性疾病和/或抑制病毒活化的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102657844SQ20121011601
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2007年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者F·貝斯東尼, L·羅曼尼, M·薩斯薩諾, P·卡米納蒂, S·鮑扎 申請(qǐng)人:泰克諾根股份公司