專利名稱：艾葉揮發(fā)油及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種艾葉揮發(fā)油及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBv)引起的一種世界性疾病。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界大約有20億人感染過HBV，其中約有3. 5億人是HBV攜帶者， 我國約有I. 2億HBV攜帶者。乙型肝炎病毒是導(dǎo)致急性、慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因，每年有30 50萬人死于HBV引起的肝硬化或肝癌。目前臨床上抗HBV藥物主要為干擾素和核苷類藥物。這兩類藥物雖然在HBV感染的治療上取得了比較好的療效，但是有報道稱干擾素適應(yīng)癥范圍窄，不良反應(yīng)多。核苷類藥物停藥后易復(fù)發(fā)，長期使用會產(chǎn)生耐藥性， 易出現(xiàn)腎毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)，因此，尋找新型安全有效的抗乙肝病毒藥物是臨床急需解決的問題。中藥具有多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮藥效等特點。傳統(tǒng)中藥在長期治療乙型肝炎過程中體現(xiàn)了它獨有的優(yōu)勢，開發(fā)具有抗乙肝病毒作用的中藥和天然藥物是當前的研究熱點。艾葉(Folium Artemisiae Argyi)是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,在我國的很多地區(qū)均有分布。傳統(tǒng)藥學(xué)理論認為艾葉有理氣血、逐寒濕等功效。近代醫(yī)學(xué)研究證明艾葉還具有抗菌、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血等作用。目前，尚未見到有關(guān)于艾葉提取物被用于抗乙肝病毒的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種艾葉揮發(fā)油，以及該艾葉揮發(fā)油在制備抗乙肝病毒藥物方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種艾葉揮發(fā)油，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得將用水浸泡過的艾葉進行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液；蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得。具體的，可將艾葉粉碎后，用其重量8 15倍的水浸泡8 15h (用以使艾葉充分浸潤)，然后將艾葉及浸泡液進行水蒸氣蒸餾，蒸餾時間6 10h。所述艾葉揮發(fā)油在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。艾葉揮發(fā)油可直接或者包合后制成多種劑型溶液劑(如芳香水劑、醑劑、乳劑等)、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、緩釋制劑及納米制劑等劑型?？梢砸园~揮發(fā)油為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型；還可以與其他抗乙肝病毒藥物共同作為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型。芳香水劑將艾葉揮發(fā)油加蒸餾水(I: 199)，用力振搖15min使成飽和溶液后放置，用蒸餾水潤濕的濾紙濾過，自濾紙上添加適量蒸餾水至全量，滅菌，分裝即得。規(guī)格 25μ l/5mL·臨床擬用量50 μ I/日，2次/日。醑劑將艾葉揮發(fā)油溶解于90%乙醇，再加蒸餾水(4:55:21)，滅菌，分裝即得。規(guī)格50μ Ι/ml。臨床擬用量50μ I/日，I次/日。乳劑將艾葉揮發(fā)油用吐溫-80進行乳化，超聲一定時間，加蒸餾水1:39配制成揮發(fā)油乳濁液，滅菌，分裝即得。規(guī)格25μ1/πι1。臨床擬用量50μ1/日，2次/日。注射劑將艾葉揮發(fā)油加羥丙基-環(huán)糊精與注射用水用膠體磨研磨，加入氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，調(diào)ΡΗ，灌封，滅菌即得。規(guī)格12μ1/2πι1。臨床擬用量12μ1/日，I次/日。普通膠囊將艾葉揮發(fā)油溶于少量無水乙醇，攪拌下緩緩滴入環(huán)糊精50°C飽和水溶液中，滴完繼續(xù)攪拌O. 5h，放冷，置冰箱冷藏24h，抽濾，蒸餾水洗滌，40°C干燥，所得粉末與硬脂酸鎂等混合均勻，或?qū)~揮發(fā)油用可生物降解的明膠和阿拉伯膠或其它藥用囊材，用復(fù)凝聚法或噴霧干燥法包裹成微囊，與硬脂酸鎂等混合均勻，填入空膠囊中，即得。 規(guī)格0. Ig/粒(含量25 μ I/粒)。臨床擬用量50μ I/日，2次/日。軟膠囊將艾葉揮發(fā)油與經(jīng)加熱滅菌、澄清的食用植物油混合，充分攪拌，與明膠、 甘油、蒸餾水制成的明膠液，用滴制機滴制軟膠囊，即得。規(guī)格10mg/粒(含量25μ I/粒)。 臨床擬用量50 μ I/日，2次/日。片劑將艾葉揮發(fā)油用β_環(huán)糊精包裹，或者微囊化，與微晶纖維素、乳糖、硬脂酸鎂等輔料混配，按本領(lǐng)域公知的制片技術(shù)和裝備，經(jīng)過標準的凹沖壓成片，制成片劑。規(guī)格 O. Ig/片(含量25 μ I/片)。臨床擬用量50μ I/日，2次/日。顆粒劑將艾葉揮發(fā)油用β_環(huán)糊精包裹，或者微囊化，與蔗糖、糊精、乳糖等輔料混配制粒，整粒，滅菌分裝即得。規(guī)格0. Ig/袋(含量25 μ I/袋)。臨床擬用量50μ I/日，
2次/日。滴丸將艾葉揮發(fā)油用吐溫-80作界面活性劑，在熱的明膠液中制成乳劑后滴制成丸?；蛘邔~揮發(fā)油用環(huán)糊精包裹，加入熔融的PEG6000，滴制成丸。規(guī)格10mg/ 粒(含量25 μ I/粒)。臨床擬用量50μ I/日，2次/日。緩釋制劑將艾葉揮發(fā)油與明膠、阿拉伯膠、乙基纖維素等囊材進行微囊化，加入稀釋劑制成緩釋膠囊，或者加入乳糖、乙醇、乙基纖維素、硬脂酸鎂等壓制成緩釋片。規(guī)格
O.3g/片(含量150 μ I/片)。臨床擬用量:150 μ 1/3日。納米制劑將艾葉揮發(fā)油與磷脂、助乳化劑和水以納米乳化法制成納米乳或亞微乳，再倒入冰水中冷卻即得到納米?；騺單⑷??；蛞陨硐嗳莸母呷埸c脂質(zhì)-單硬脂酸甘油酯為骨架材料作為藥物載體，以豆磷脂和泊洛沙姆F-68等為表面活性劑，用熔融-超聲法和高壓勻質(zhì)法制成固體脂質(zhì)納米粒。規(guī)格12μ1/2πι1。臨床擬用量12μ I/日。本發(fā)明艾葉揮發(fā)油的提取方法簡單，所得艾葉揮發(fā)油經(jīng)體外細胞試驗證明具有較強的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
具體實施例方式以下通過優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。實施例I一種艾葉揮發(fā)油，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得取500g粉碎過的艾葉置于燒瓶中(燒瓶中放入數(shù)粒沸石)，加入6000g水振搖混合后浸泡12h左右，然后將艾葉及浸泡液進行水蒸氣蒸餾(具體的，可以將燒瓶與揮發(fā)油測定器、及回流冷凝管連接，將燒瓶置于電熱套中緩慢加熱至沸，并保持微沸8h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的綠色油層 (3. Oml)即得。實施例2
一種艾葉揮發(fā)油，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得取500g粉碎過的艾葉置于燒瓶中(燒瓶中放入數(shù)粒沸石)，加入4500g水振搖混合后浸泡IOh左右，然后將艾葉及浸泡液進行水蒸氣蒸餾(具體的，可以將燒瓶與揮發(fā)油測定器、及回流冷凝管連接，將燒瓶置于電熱套中緩慢加熱至沸，并保持微沸6h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的綠色油層 (2. 7ml)即得。實施例3
一種艾葉揮發(fā)油，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得取500g粉碎過的艾葉置于燒瓶中(燒瓶中放入數(shù)粒沸石)，加入7000g水振搖混合后浸泡15h左右,然后將艾葉及浸泡液進行水蒸氣蒸餾(具體的，可以將燒瓶與揮發(fā)油測定器、及回流冷凝管連接，將燒瓶置于電熱套中緩慢加熱至沸，并保持微沸10h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的綠色油層 (3. Iml)即得。艾葉揮發(fā)油的體外試驗
I.I主要試驗材料
I.I. I HepG2. 2. 15細胞株由廣州暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地贈予，本研究室自行傳代培養(yǎng)供實驗使用。I. 1.2主要試劑拉米夫定(3TC，賀普丁片)購自葛蘭素-史克制藥(蘇州)有限公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Amersco 公司；MTT購自美國Sigma公司；G418,購自美國invitrogen公司；HBV核酸擴增突光定量檢測試劑盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上?？迫A生物技術(shù)有限公司；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上?？迫A生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒，美國Omega公司。1.1.3主要儀器生物安全柜Hfsafe_1200TE Class II Type B2，香港力康發(fā)展有限公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱HF160W，香港力康發(fā)展有限公司；酶標儀168-1000XC， 美國BIO RAD ;熒光PCR檢測儀，美國Roche LightCyclerl. 5 ;全自動滅菌器HVE-50，日本HIRAYAMA ；96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板，50ml細胞培養(yǎng)瓶，美國corning公司；超純水儀為 Millipore公司產(chǎn)品。實施例I所得艾葉揮發(fā)油對細胞的毒性試驗
依據(jù)Mosmann建立的MTT比色法檢測實施例I所得艾葉揮發(fā)油對H印G2. 2. 15細胞的毒性。具體為細胞長滿培養(yǎng)瓶后，加入O. 25%胰蛋白酶，消化后加入培養(yǎng)液吹打成單細胞， 加入細胞計數(shù)板計數(shù)，濃度為2 X IO4個/mL后接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每孔ΙΟΟμΙ),每個濃度設(shè)四個孔，置CO2培養(yǎng)箱(37°C，5. 0%C02)中培養(yǎng)24h。細胞長成單層后加入含有不同體積濃度艾葉揮發(fā)油的1640培養(yǎng)基，并設(shè)不含艾葉揮發(fā)油的正常細胞為空白對照組。連續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入20μ1含結(jié)晶紫的MTT，于CO2培養(yǎng)箱(37°C，5. 0% CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后，棄去上清液,每孔加入200μ1 DMS0，用微量振蕩器充分震蕩，使結(jié)晶紫充分溶解。用酶標儀 (檢測波長490nm，參考波長630nm)讀取各孔OD值，記錄結(jié)果。計算不同體積濃度艾葉揮發(fā)油對!fepG2. 2. 15細胞的抑制百分率，結(jié)果見表I。
權(quán)利要求
1.一種艾葉揮發(fā)油，其特征在于，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得將用水浸泡過的艾葉進行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液；蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得。
2.如權(quán)利要求I所述的艾葉揮發(fā)油，其特征在于，將艾葉粉碎后，用其重量8 15倍的水浸泡8 15h,然后將艾葉及浸泡液進行水蒸氣蒸懼,蒸懼時間6 10h。
3.權(quán)利要求I或2所述的艾葉揮發(fā)油在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種艾葉揮發(fā)油，該揮發(fā)油經(jīng)下述方法制得將用水浸泡過的艾葉進行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液；蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得。該艾葉揮發(fā)油的提取方法簡單，所得艾葉揮發(fā)油經(jīng)體外細胞試驗證明具有較強的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
文檔編號A61P31/20GK102600224SQ20121011760
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者侯迎迎, 張壯麗, 張小俊, 張艷, 張長征, 江金花, 王東陽, 王寧, 王桂芳, 趙志鴻, 鄭立運, 陳慧平, 馬方, 黃勇勇 申請人:河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院