專利名稱：芳香酶抑制劑的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥用途，具體涉及芳香酶抑制劑在制備防治男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類壽命的延長(zhǎng),老年男性的下尿道(lower urinary tract, LUT)越來越多的受到社會(huì)和醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查表明40-49歲的男性中有約26%的人具有中度和重度的下尿道綜 合癥(lower urinary tract syndrome, LUTS);在 70 歲的男性中有約 46% 出現(xiàn) LUTS。我國的流行病調(diào)查表明，在上海市市區(qū)一般人群中抽取40歲以上男性居民1583名，通過國際前列腺癥狀評(píng)分(IPSS)和生活質(zhì)量(QoL)評(píng)分等方法，調(diào)查該人群中LUTS的患病率及對(duì)生活質(zhì)量的影響。結(jié)果在40-49歲、50-59歲、60-69歲和大于70歲年齡組中，中、重度LUTS(IPSS彡8)患病率分別為8. 7%、19. 4%、32. 3%和40. 2%，呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)患病率上升趨勢(shì)；隨著LUTS嚴(yán)重程度的增加，患者的QoL評(píng)分也顯著上升(P < O. 01)。我國男性LUTS患病率也不斷接近歐美國家，嚴(yán)重影響男性的生理健康和生活質(zhì)量。男性的LUTS的主要病因是膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO),尿道發(fā)炎，小便失禁和膀胱癌。膀胱出口梗阻(B00)是下尿道綜合癥(LUTS)中最常見的一種病(Groutz etal. 2001)。B00從尿動(dòng)力學(xué)定義是指膀胱頸和近端尿道處各種原因?qū)е碌哪蛞毫鞒鲎枇ι?，泌尿困難，不能排尿以及不能排空膀胱中的儲(chǔ)尿。B00常導(dǎo)致膀胱逼尿肌功能異常，繼而產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如尿流間斷，泌尿困難，不能排尿以及不能排空膀胱中的儲(chǔ)尿，嚴(yán)重的能引起腎積水，慢性腎功能不全，長(zhǎng)期排尿困難導(dǎo)致腹壓增高，還可引起腹股溝疝，內(nèi)痔與脫肛，腎衰竭和猝死等。目前B00的治療手段主要有藥物治療、手術(shù)治療，其中I、外科手術(shù)治療目前臨床上可接受的介入性治療主要是經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TURP)、開放性前列腺切除術(shù)(OS)、經(jīng)尿道前列腺電氣化術(shù)(TUVP)、激光氣化術(shù)(VLAP)、經(jīng)尿道微波治療術(shù)(TUMT)、經(jīng)尿道穿刺消融術(shù)(TUNA)、間質(zhì)激光凝固術(shù)(ILC)、尿道支架術(shù)。臨床上應(yīng)根據(jù)病人的具體情況，選擇最有利于病人的手術(shù)方式。標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)療效明顯，癥狀得長(zhǎng)期改善且危險(xiǎn)性小。但目前越來越傾向于微創(chuàng)治療，在一定程度上癥狀得到改善，危險(xiǎn)性(某些病例)也小于開放手術(shù)，但是目前缺乏有關(guān)持久性證據(jù)，尚未確定這些新技術(shù)在費(fèi)用和療效上是否比標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)(如TURP)有更大的優(yōu)勢(shì)(楊勇2002)。2、藥物治療a IAR拮抗劑在前列腺中的主要亞型是a Ia AR和a Id AR, a la AR拮抗劑能夠改善BPH中前列腺平滑肌收縮狀態(tài)(Andersson 2000 ；Michel and Vrydag 2006),減輕前列腺對(duì)尿道的擠壓，從而改善膀胱梗阻的癥狀。a Ia AR阻滯劑雖然能夠帶來前列腺平滑肌的舒張和增加尿流量，改善BPH引起的梗阻癥狀，但是BPH帶來的LUTS的評(píng)分沒有改變。只有a Ia AR和a Id AR阻滯劑聯(lián)合使用，LUTS的評(píng)分才得以改變(Haynes et al. 2003 ；Sigala et al. 2004 ；Barendrecht et al. 2008)。a IAR拮抗劑其有效性和安全性已在開放擴(kuò)展臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。但臨床現(xiàn)有的所有a IAR拮抗劑均與頭暈、乏力和立位性低血壓的發(fā)生有關(guān)。5α-還原酶抑制劑睪酮在5α-還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出口梗阻的主要病因之一。在目前現(xiàn)有的激素治療中，5α-還原酶抑制劑非那雄胺是唯一在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中顯示良好有效性和可接受的安全性藥物。非那雄胺最常見的副作用是性功能不良，如射精減少、性欲下降和陽萎。目前已上市的藥物皆是針對(duì)治療前列腺病變引起的膀胱出口梗阻，尚未見到對(duì)雌/雄激素比例失調(diào)引起的膀胱出口梗阻的治療。芳香酶是屬于細(xì)胞色素Ρ450的一種復(fù)合酶，可氧化脫去C19雄激素(雄烯二酮和睪酮)的19-甲基，使A環(huán)芳構(gòu)化，從而轉(zhuǎn)變成C18雌激素(雌酮和雌二醇)。因此，芳香 酶是體內(nèi)合成雌激素的重要酶。芳香酶抑制劑通過和芳香酶的結(jié)合能力，抑制芳香酶活性可降低體內(nèi)雌激素的水平。目前常用的芳香酶抑制劑是三吡咯衍生物，是非留體類競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如阿那曲唑(Anastrozole)、來曲唑(Letrozole)、芬羅唑(Finrozole)和伏氯唑(Vorozole)等。來曲唑(Letrozole)，化學(xué)名稱為1_[雙(4-氰基苯基)甲基]_1，2，4_三氮唑，或者為4，4' -(IH-1,2,4-三唑-I-基亞甲基)-雙苯腈，其CAS登記號(hào)為112809-51-5，是新一代芳香酶抑制劑，為人工合成的芐三唑類衍生物，來曲唑通過抑制芳香酶，使雌激素水平下降，從而消除雌激素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的刺激作用。主要用于絕經(jīng)后晚期乳腺癌，多用于抗雌激素治療失敗后的二線治療。阿那曲唑(Anastrozole)，化學(xué)名(四甲基_5_(1H-1，2，4_三唑-I-基甲基)_1，3-苯二乙腈)，分子式=C17H19N5，分子量293. 37，CAS登記號(hào)為120511-73-1。為強(qiáng)效非甾體類芳香酶抑制劑?？山档脱獫{雌激素水平，產(chǎn)生抑制乳腺腫瘤生長(zhǎng)的作用。臨床上用于絕經(jīng)后婦女的晚期乳腺癌治療。芬羅唑(Finrozole)和伏氯唑(Vorozole),也屬于芳香酶抑制劑,可用于絕經(jīng)后婦女的晚期乳腺癌治療。目前尚未見到芳香酶抑制劑在膀胱出口梗阻相關(guān)用途方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種芳香酶抑制劑的新用途。本發(fā)明提供了芳香酶抑制劑在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述膀胱出口梗阻的癥狀是尿頻、尿急、排尿困難、淋漓不盡、排尿時(shí)間延長(zhǎng)。所述膀胱出口梗阻由雌/雄激素比例失調(diào)導(dǎo)致的；所述芳香酶抑制劑為三吡咯衍生物，優(yōu)選為阿那曲唑、來曲唑、芬羅唑和伏氯唑。所述芳香酶抑制劑為含有芳香酶抑制劑的制劑，該制劑可市售獲得，或與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成制劑。所述制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、口服液或注射劑，所述注射劑為注射液或凍干粉針。
所述藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，選自填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、潤(rùn)濕劑、溶劑、表面活性劑或矯味劑中的一種或幾種。所述填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素或葡萄糖等;所述粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、淀粉、糊精、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解劑選自微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；所述潤(rùn)滑劑選自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸鈣、碳酸氫鈉、微粉硅膠、滑石粉或硬脂酸鎂；所述助懸劑選自微粉硅膠、蜂蠟、纖維素、固態(tài)聚乙二醇；所述潤(rùn)濕劑選自甘油、吐溫-80、乙氧基氫化蓖麻油或卵磷脂；所述溶劑選自乙醇、液態(tài)聚乙二醇、異丙醇、吐溫-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油選自大豆油、蓖麻油、花生油、調(diào)和油等；所述表面活性劑選自十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、月旨肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐溫)等；所述矯味劑選自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、檸檬酸或糖精鈉。所述芳香酶抑制劑的用量為l_50mg/Kg/d,優(yōu)選為5_25mg/Kg/d。本發(fā)明提供的芳香酶抑制劑的新用途具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明提出了芳香酶抑制劑類藥物的新用途，具體涉及在治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的新應(yīng)用，該藥物能夠快速有效的治療膀胱出口梗阻，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為治療膀胱出口梗阻提供了一種新方法；2、實(shí)驗(yàn)證實(shí)用芳香酶抑制劑來治療膀胱出口梗阻及其導(dǎo)致的下尿道綜合征，癥狀減輕明顯，治療率為100%。


圖I :芳香酶表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 :PCR鑒定結(jié)果，6號(hào)為陽性，+為陽性對(duì)照。圖3 Southern Blot篩選結(jié)果，I為陽性對(duì)照，是回收的探針，6為southern blot陽性鼠。圖4 :小鼠生殖泌尿系統(tǒng)表型的鑒定左邊兩鼠分別1是為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的尿潴留小鼠，2為陰性對(duì)照組的野生型小鼠，右邊一鼠為圖3s0Uthern blot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠的解剖學(xué)分析為尿潴留引起的膀胱的形態(tài)學(xué)變化。圖5 :膀胱組織HE染色及Van Gieson染色結(jié)果，A為HE染色結(jié)果，B為Van Gieson染色結(jié)果；其中，I為野生型小鼠，2為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；&表示膠原纖維，b表示肌纖維。圖6 :芳香酶基因的半定量RT-RCR，AU A2為芳香酶轉(zhuǎn)基因小鼠，WT1，WT2為野生型小鼠。
圖7 :芳香酶抑制劑Western Blot檢測(cè)結(jié)果，A1，A2為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，WT為野生
型小鼠。圖8 :芳香酶抑制劑處理的轉(zhuǎn)基因鼠和陽性對(duì)照鼠A為來曲唑處理的轉(zhuǎn)基因鼠；B為阿那曲唑處理的轉(zhuǎn)基因鼠；C為芬羅唑處理的轉(zhuǎn)基因鼠，圖中A:WT為陰性對(duì)照組，AROM+為尿潴留小鼠，AROM+latrozol為來曲唑組；AROM+Anastrozole為阿那曲唑組；AROM+Finrozole為芬羅唑組。圖9:組織病理學(xué)分析，其中A為陰性對(duì)照組(即WT)，為野生型鼠尿道口的括約肌；B為尿潴留小鼠(即AROM+)為轉(zhuǎn)基因鼠尿道口的括約?。籆為來曲唑組(即AROM+latrozol) ;D為為阿那曲唑組(AROM+Anastrozole) ;E為為芬羅唑組(AR0M+Finrozole)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I:小鼠模型的制備參考文獻(xiàn)Molecular mechanisms of bladder outlet obstruction intransgenic male mice over expressing aromatase(Cypl9al). Linff, Rahman NA, Lin J,Zhang H, Gou K, Yu ff, Zhu D, Li N, Huhtaniemi I, Li X. Am J Pathol. 201IMar ；178 (3)1233-44. PMID :21356374。試驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。C57BL/6是國外引進(jìn)的近交系，是B6F129和B6JEiF78雜交，而后經(jīng)過129代的同胞兄妹近交而生產(chǎn)的近交系，相關(guān)基因型是a/a。試驗(yàn)試劑pUB6/V5_HisA(Cat. No. V25020),購自 Invitrogen, Carlsbad, CA ；pRC/CMV (Cat. No. 10131027)，購自 Invitrogen, Carlsbad, CA。用C57BL/6小鼠構(gòu)建膀胱出口梗阻動(dòng)物模型，具體方法如下一、重組表達(dá)載體(或?yàn)榉枷忝副磉_(dá)載體)的構(gòu)建UUbiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I的獲得用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII酶切pUB6/V5_HisA，回收Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I片段，其中Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I及該片段在載體pUB6/V5-HisA上兩端的酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如序列表中人工序列I所示；人工序列I自5'末端起第1-6位核苷酸為BglII的識(shí)別序列(AlGATCT)，人工序列I自5'末端起第1218-1223位核苷酸為HindIII的識(shí)別序列(A|AGCTT);人工序列I自5'末端起第7-1217位核苷酸為片段Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I的序列，其人工合成序列見序列表中的人工序列I所示。2、人芳香酶編碼基因的cDNA的獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的人芳香酶編碼基因的cDNA全長(zhǎng)序列如序列表中人工序列2所示，其中序列2自5’末端第1-6位核苷酸為HindIII的識(shí)別序列(A | AGCTT)，第2155-2160位核苷酸為XbalI的識(shí)別序列(T I CTAGA)，第7-2154位核苷酸為人芳香酶編碼基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其人工合成序列見序列表中的人工序列2所示。3、牛生長(zhǎng)激素基因的polyA /[目號(hào)序列
在載體PRC/CMV上具有牛生長(zhǎng)激素基因的polyA信號(hào)序列，其核苷酸序列見序列表中的人工序列3所示；4、重組表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII酶切載體pRC/CMV，回收大片段(即去除CMV啟動(dòng)子的載體片段)，將其與步驟(I)中酶切獲得的Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I片段連接，得到重組載體pRC/Ubiquitin C ；用限制性內(nèi)切酶HindIII/Xbal酶切重組載體pRC/Ubiquitin C，回收大片段；用限制性內(nèi)切酶Hindlll/Xbal酶切人芳香酶編碼基因的cDNA片段，連接，得到重組表達(dá)載體pRC/Ubiquitin C/cDNA(即芳香酶表達(dá)載體)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示,得到0嫩片段“1113丨911；[1:;[11C基因的啟動(dòng)子、外顯子I和內(nèi)含子I+人芳香酶編碼基因的cDNA+bGH polyA”，其核苷酸序列見序列表中的人工序列4所示。二、轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建將構(gòu)建的芳香酶表達(dá)載體用Bgl II和Dra I進(jìn)行雙酶切，回收DNA片段，SPUbiquitin C基因的啟動(dòng)子、外顯子I和內(nèi)含子I+人芳香酶編碼基因的cDNA+bGH polyA,將上述DNA片段制成2ng/l·! L的懸液，顯微原核注射入C57BL/6小鼠受精卵中；胚胎移植入待孕母體子宮中；生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，得到的轉(zhuǎn)基因小鼠計(jì)作H)代。具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下(一 )超數(shù)排卵(超排)與取卵I、超數(shù)排卵取4-6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵，二者注射時(shí)間間隔為45h，排卵發(fā)生在注射hCG后13h，注射劑量為每鼠8ul。注射hCG后每只母鼠置于一個(gè)單獨(dú)飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。2、取卵用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下，置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶針頭的注射器將受精卵沖出，用透明質(zhì)酸酶去除包圍著的顆粒細(xì)胞后立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌4次即可用于顯微注射。( 二 )注射外源 DNA 顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。取已制備好的受精卵細(xì)胞和外源DNA懸液，在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時(shí)先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液，然后推動(dòng)注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將1-2μ L DNA注入(DNA濃度2ng/l·! L)。注射完畢，慢慢抽出注射針，將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復(fù)。50-80%的受精卵在顯微注射后仍保持健康。(三)注射后受精卵(或胚胎)的移植將注射有外源DNA的受精卵在顯微操作當(dāng)天移植到交配后O. 5d假孕雌鼠的輸卵管內(nèi)。外源DNA可直接導(dǎo)入原核內(nèi)，導(dǎo)入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合。待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用如下移植方法用戊巴比妥鈉麻醉受體鼠，從假孕鼠陰道向子宮頸管 道插入外徑10毫米的粗導(dǎo)管，然后將直徑5毫米的細(xì)導(dǎo)管插入粗導(dǎo)管內(nèi)側(cè)，伸入到子宮體或一側(cè)子宮角。將囊胚連同2毫升保存液一起通過細(xì)導(dǎo)管移植進(jìn)去，具體是用干冰產(chǎn)生出來的二氧化碳經(jīng)過導(dǎo)管將囊胚吹入到子宮內(nèi)1-3分鐘。
也可以采用如下移植方法用戊巴比妥鈉麻醉受體鼠，沿受體鼠背部中線最后一根肋骨水平切Icm左右切口，輕輕撥開切口，可見位于卵巢上方的白色脂肪墊.用小鑷子夾住白色脂肪墊將其拉到體外，用小血管夾夾住，并靠其重力起固定作用，以防輸卵管縮回體腔。用移卵管吸15-20個(gè)受精卵準(zhǔn)備移植.將小鼠轉(zhuǎn)到解剖鏡下仔細(xì)尋找到輸卵管?？梢娸斅压鼙灰粚映拾胪该鞯哪夷に@，將囊膜撕破而暴露輸卵管，將移卵管內(nèi)受精卵移植到輸卵管膨大部。將輸卵管小心放回，縫合。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。三、轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選陽性小鼠的鑒定及繁育運(yùn)用PCR及Southern Blot方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因小鼠； ( 一 ) PCR 篩選方法模板DNA為假孕母鼠所產(chǎn)Founder幼鼠的鼠尾DNA，(假孕母鼠生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱為Founder)正向引物見序列表中的人工序列5，反向引物見序列表中的人工序列6，擴(kuò)增572bp片段，不能擴(kuò)增出該片段的為陰性，能擴(kuò)增出該片段并通過測(cè)序正確的為陽性。結(jié)果如圖2所示，6號(hào)為陽性，+為陽性對(duì)照，將PCR陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如序列表中的人工序列4的自5'末端起第853-1424位核苷酸所示，表明PCR產(chǎn)物結(jié)果正確。(二)Southern Blot 篩選方法I、基因組DNA的制備按常規(guī)鼠尾提取DNA的方法制備DNA ；2、基因組DNA的限制酶切在I. 5ml 離心管中依次加入 20μ g DNA(1 μ g/μ I)，4· Ομ I IOX 酶切 buffer，
5.0μ I EcoRI (IOU/μ I)，加 ddH20 至 500 μ 1，37°C 消化過夜。3、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳制備O. 8%凝膠一般用于Southern雜交的電泳膠取O. 8%。電泳電泳樣品中加入IOXLoading緩沖液,混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。l_2V/cm,DNA從負(fù)極泳向正極。電泳至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠另一端時(shí)，停止電泳。正常電泳圖譜呈現(xiàn)一連續(xù)的涂抹帶。4、DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物(毛細(xì)管法)I)試劑準(zhǔn)備變性液0. 5M NaOH ；I. 5M NaCl ;中和液1M Tris-HCl (pH 7. 4)；
I.5M NaCl ;轉(zhuǎn)移液(20 X SSC) :175. 3g NaCl ;82. 2g檸檬酸三鈉，NaOH調(diào) pH至 7· 0，加 ddH20至 IOOOml02)操作步驟堿變性室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中30分鐘。中和將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液15分鐘。轉(zhuǎn)移按凝膠的大小剪裁帶正電尼龍膜并剪去一角作為標(biāo)記，水浸濕后，浸入轉(zhuǎn)移液中5分鐘。剪一張比膜稍寬的長(zhǎng)條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。轉(zhuǎn)移過程一般需要8-24小時(shí)，每隔數(shù)小時(shí)換掉已經(jīng)濕掉的紙巾。轉(zhuǎn)移液用20XSSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個(gè)操作過程中要防止膜上沾染其它污物。轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出膜，浸入6X SSC溶液數(shù)分鐘，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80°C烘2小時(shí)，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。5、探針標(biāo)記進(jìn)行Southern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記
I)取25_50ng模板DNA(EcoRI酶切構(gòu)建完成的質(zhì)粒載體，回收2. 7K片段)于O. 5ml離心管中，100°C變性5分鐘，立即置冰浴。2)在另一個(gè)O. 5ml離心管中加入10 μ I Labeling 5Xbuffer (含有隨機(jī)引物，隨機(jī)引物是小的核苷酸序列)，2 μ I dNTPmix(含dATP、dGTP、dTTP各O. 5πιΜ)，2μ I BSA(小牛血清白蛋白)，3μ 1[α -32PJdCTP, 5U Klenow 酶。3)將步驟I)中的變性模板DNA加入到步驟2)中的離心管中，加ddH20至50 μ 1，混勻，室溫內(nèi)放置90分鐘。4)加50 μ I終止緩沖液終止反應(yīng)。6、雜交 預(yù)雜交膜浸入2XSSC中5分鐘，在雜交瓶中加入雜交液(8cmX8cm的膜加5ml即可)，將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42°C雜交爐中，使雜交體系升到42°C，得到預(yù)雜交的雜交液。雜交倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42°C的雜交液。將探針100°C加熱5分鐘，使其變性，迅速加到雜交瓶中，42 °C雜交過夜。7、洗膜與檢測(cè)取出膜，在2XSSC溶液中漂洗5分鐘，然后按照下列條件洗膜2XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分鐘；1XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分鐘；O. 5XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分鐘；O. 2XSSC/0. 1% SDS,56°C, 10 分鐘；O. 1XSSC/0. 1% SDS，56°C，10 分鐘。在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過程無論在哪一步達(dá)到終點(diǎn)，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2XSSC中2分鐘，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入磷板中，三天后掃描磷板，結(jié)果如圖3(1為陽性對(duì)照，是回收的芳香酶基因的探針，6為southern blot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠)。以上結(jié)果表明，篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠正確。四、遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)將步驟三篩選得到的陽性雌鼠與野生型C57BL/6公鼠配對(duì)，繁育得到Fl代；對(duì)卩1代小鼠進(jìn)行篩選，方法同步驟三所述。以此類推，繁育F2代，F(xiàn)3代，F(xiàn)4代，每一代都進(jìn)行陽性篩選，陽性轉(zhuǎn)基因鼠中均能檢測(cè)到該插入的基因。五、陽性轉(zhuǎn)基因鼠的表型鑒定及組織學(xué)分析和基因表達(dá)分析將按照上述方法得到的Fl代和F2代陽性轉(zhuǎn)基因公鼠成年后進(jìn)行生殖泌尿系統(tǒng)表型鑒定、組織病理學(xué)分析、基因表達(dá)分析。(一)表型鑒定結(jié)果陽性轉(zhuǎn)基因公鼠成年后生殖泌尿系統(tǒng)表型鑒定結(jié)果如圖4所示，左邊兩鼠分別為I為陽性轉(zhuǎn)基因的尿潴留小鼠，(2)表示陰性對(duì)照組的野生型小鼠，右邊一鼠為圖3Southern blot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠的解剖學(xué)分析為尿潴留引起的膀胱的形態(tài)學(xué)變化。(二)組織學(xué)分析解剖獲取所述轉(zhuǎn)基因小鼠的膀胱及尿道，放入到4%的多聚甲醛溶液中固定48小時(shí)，水洗4小時(shí)后進(jìn)行組織包埋，HE染色及膠原Van Giesan染色，具體步驟如下I、將固定好的組織用PBS洗滌2次，每次10分鐘。然后進(jìn)行脫水和浸蠟，方法如下70%乙醇(I小時(shí))，80%乙醇(I小時(shí))，90%乙醇(I小時(shí))，95%乙醇(I小時(shí))，無水乙醇(I小時(shí)X2), 二甲苯(15分鐘一次,5分鐘一次)，石臘一 (30分鐘)，石臘二(30分鐘)，石蠟三(30分鐘)；2、將處理過的組織放在包埋盒底部中央，倒入融化的蠟，室溫中冷卻；3、切片 I)將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上；2)將護(hù)刀蓋推至打開位置；3)搖動(dòng)快速進(jìn)退手輪，使石蠟塊與刀口貼近，但不超過刀口 ；4)調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15-30度；5)調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般5μπι;6) 一切調(diào)整好后就可以切片，此時(shí)右手搖動(dòng)大手輪，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度以每分鐘40-50轉(zhuǎn)為宜。7)切成的蠟帶到20-30厘米時(shí)，右手用另一支毛筆將蠟帶挑起，平放在蠟帶盤上(注意靠刀面的一面較光滑朝下)。4、貼片切好的蠟帶置于撈片機(jī)溫水中(注意蠟片光面向下)，待其完全展開后，取一清潔的以粘片劑處理的載玻片撈取至片上中間部位。并作好標(biāo)記。5、烤片把玻片標(biāo)本置于片架上，37°C溫度烤片24小時(shí)。6、HE 染色I(xiàn))組織芯片置于二甲苯中浸泡15分鐘；2)更換二甲苯后再浸泡7分鐘；3)無水乙醇I中浸泡5分鐘；4)無水乙醇II中浸泡5分鐘；5) 95%乙醇中浸泡5分鐘；6) 90%乙醇中浸泡5分鐘；7) 80%乙醇中浸泡5分鐘；8) 70%乙醇中浸泡5分鐘；9)蘇木精中浸泡15分鐘；10)水洗2分鐘；11)鹽酸酒精分化10秒；12) 80%乙醇中2分鐘；13) 70%乙醇中2分鐘；14)伊紅中79秒；15) 90%乙醇中浸泡3分鐘；16) 95%乙醇中浸泡3分鐘；
17)無水乙醇II中浸泡3分鐘；18)無水乙醇I中浸泡5分鐘； 19) 二甲苯II中3分鐘；20) 二甲苯I中3分鐘；21)中性樹膠封片，鏡檢。7、Van Gieson 染色I(xiàn))試劑的配制Weigert 氏蘇木素A 液lg 蘇木素(haematoxylin), IOOml 無水酒精；B 液:4ml30%三氯化鐵(ferric chloride),95ml 蒸懼水，Iml 鹽酸。Van Gieson 氏液A 液Ig 酸性品紅(acid fuchsin), IOOml 蒸懼水。B 液1. 22%苦味酸飽和水溶液(picric acid)。Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合,幾個(gè)小時(shí)內(nèi)用完,最長(zhǎng)不得超過一天。蘇木素配后經(jīng)二十多天才能成熟，必須提前配制。該液能抵抗弱酸性染液，對(duì)已著染的細(xì)胞核在酸性染液的作用，不易被脫去顏色，如果不特別深染，則無須分化。Van Gieson氏液取B液9ml,加入A液Iml,即可使用。2)操作方法切片脫蠟至水；用Weigert氏蘇木素染20min ;水洗；必要時(shí)可分化；流水沖洗IOmin ;染VanGieson氏液Imin ;用95%酒精快速分化；無水酒精脫水,二甲苯透明，封固。染色結(jié)果如圖5所示(A表示HE染色結(jié)果，B表示膠原纖維染色(Van Gieson染色)結(jié)果，其中，I表示野生型小鼠，2表示陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；粉紅的部分表示膠原纖維，b橙色的部分表示肌纖維，結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因小鼠膀胱尿潴留，膀胱中固有層增厚，逼尿肌排列紊亂。逼尿肌層萎縮。尿道括約肌萎縮。Van Gieson染色顯示膠原增多。(三)基因表達(dá)分析快速解剖獲取轉(zhuǎn)基因小鼠的膀胱于液氮中速凍，-80°C保存，留待提取RNA和蛋白質(zhì)，通過RT-PCR和Western Blot方法做基因表達(dá)檢測(cè)，具體方法如下I、RT-PCR :I)總RNA的提取及檢測(cè)A迅速從液氮中取出膀胱，剪取50mg左右，剪碎放入勻漿杯中，加入Iml Trizol,用勻漿器勻漿l_2min，將組織勻漿液轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，室溫放置5min。B加入200μ I體積比為I : 24的異戊醇/氯仿，充分混勻，務(wù)必成乳白色，冰中放置 IOmin0C 4°C,以 12000 轉(zhuǎn)/min 離心 lOmin。D取上清，加入等體積異丙醇(預(yù)冷)混勻。E-20°C放置 Ih 后，4°C，10000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin0F棄上清，沉淀溶于800 μ I 75%的乙醇，室溫放置lOmin，4°C，10000轉(zhuǎn)/min離心IOmin0G重復(fù)步驟6) —次。
H小心棄上清，在恒溫箱中65°C烘干；核酸分析儀測(cè)定總RNA的0D26(l/0D28(l，根據(jù)A260值計(jì)算RNA樣品濃度RNA樣品濃度(ng/ μ I) = A260 XDNA稀釋倍數(shù)X 50。痕量DNA的消化A 向 RNA 水溶液中加入 10 μ I 的 IOxDNase-I 緩沖液，O. 5 μ IRnsin (40-200U/ μ I)，2. 0μ I DNase-1 (5U/μ I)，4.0 μ 10. 1MDTT，用 DEPC 水調(diào)至 100ml，37。。保溫 15min。B加入等體積的酚氯仿(I I)混勻。C 4°C, 12000r/min 離心 lOmin。D取上清，加入1/10體積的3mol/l的NaAc和2. 5倍體積的預(yù)冷的乙醇混勻。E_20°C沉淀 30min 以上，10000r/min, 4°C離心 15min。F沉淀用乙醇淋洗兩次，烘干，溶于無核酸酶水中，存于_70°C備用。G紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的含量。2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈A反轉(zhuǎn)錄體系如表I所示表I:反轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.芳香酶抑制劑在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述男性膀胱出口梗阻的癥狀是尿頻、尿急、排尿困難、淋滴不盡、排尿時(shí)間延長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述男性膀胱出口梗阻是由雌/雄激素比例失調(diào)引起的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香酶抑制劑為三吡咯衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香酶抑制劑為阿那曲唑、來曲唑、芬羅唑和伏氯唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香酶抑制劑為含芳香酶抑制劑的制劑，由芳香酶抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、口服液或注射劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香酶抑制劑類的用量為l_50mg/Kg/d。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香酶抑制劑類的用量為5-25mg/Kg/d。
全文摘要
本發(fā)明涉及芳香酶抑制劑的新用途，具體涉及芳香酶抑制劑在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。該藥物能夠快速有效的治療雄性小鼠膀胱出口梗阻，更好的切合臨床應(yīng)用，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，為治療膀胱出口梗阻提供了一種新方法。
文檔編號(hào)A61P13/02GK102641502SQ20121012533
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者于萬鵬, 張華 , 李向東, 林蔚 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)