專利名稱：一種腸道病毒疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明涉及一種腸道病毒疫苗的制備方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
手足ロ病可由多種腸道病毒所引起，其中包括CoxA5，A10, A16，A19，EV71，以及部分?？刹《竞涂滤_奇B組病毒，以CoxA16和EV71最為常見。腸病毒71型(EV71)是屬人腸病毒屬，小RNA病毒科,是手足ロ病的主要病原之一。嬰幼兒感染后引起手足ロ及皰疹性咽峽炎，少數(shù)可發(fā)生無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫及急性弛緩性癱瘓等并發(fā)癥，出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)癥狀。自1969年首次在美國加利福尼亞分離出病毒以來，全世界經(jīng)歷多次EV71的暴發(fā)流行。1997年以來，感染EV71的人數(shù)顯著增加，特別在亞太地區(qū)，1997年馬來西亞EV71感染約6000人，30多名兒童死亡，平均年齡I. 5歲。1998年臺灣共報告129106例手足ロ感染，405名為嚴重中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，78例死亡。2008年春季，我國安徽阜陽暴發(fā)手足ロ疫情，78名兒童死亡，近萬人感染，引起了社會各界的普遍關(guān)注。我國衛(wèi)生部自2008年5月，將該病列入法定報告?zhèn)魅静蟾娌》N。近幾年來，手足ロ病傳染流行越來越廣泛，尚未有有效的藥物及疫苗可用于該病的治療與預(yù)防。目前已有多家研究単位研究EV71疫苗，但尚有ー些不能令人滿意的地方。目前用于生產(chǎn)EV71疫苗的基質(zhì)細胞可分為ニ類ー類是二倍體細胞，主要是人胚肺細胞；ー類是Vero傳代細胞。前者，EV71病毒在此二倍體細胞中繁殖滴度低，產(chǎn)量受到限制，擴大生產(chǎn)比較困難；對于后者，由于Vero細胞是傳代細胞,疫苗中所含的傳代細胞DNA含量需要在30ng以下，但去除病毒液中的DNA又較困難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高、效率較低。因此，生產(chǎn)EV71疫苗的基質(zhì)細胞尚需改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供EV71、CoxA16等腸道病毒疫苗的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種腸道病毒疫苗的制備方法，所述方法包括(I)取10 15天齡的沙鼠，處死，無菌取下肌肉組織(主要是骨骼肌)，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的細胞培養(yǎng)液洗2次，去盡洗液；(2)肌肉組織加10倍質(zhì)量的含O. 2% (w/v)膠原酶ΙΙ、0· 25% (w/v)胰蛋白酶的消化液，4°C消化過夜；w/v表示質(zhì)量體積百分比濃度，某組分濃度1%表示IOOmL溶液中該組分含量為Ig ;(3)終止消化后棄去消化液，加質(zhì)量為肌肉組織質(zhì)量10倍的細胞培養(yǎng)液反復(fù)吹打，分散細胞，依次過100、200和400目的不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液，離心，棄上清液，沉淀細胞用細胞培養(yǎng)液重新懸浮，加新生牛血清至其終濃度為10% (v/v)，接種至細胞瓶，36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(4)差速貼壁2h后，吸取細胞上清液，接種新培養(yǎng)瓶，36°C培養(yǎng)至細胞生長達到70% 80%融合時，換含5% (v/v)新生牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞達到95%融合時，用于病毒接種；(5)取95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，接種病毒滴度為IXlO3 tl 5 X IO3 0TCID50的含腸道病毒的病毒液，置35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，加含I %(v/v)新生牛血清、100U/ml卡那霉素的細胞培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)細胞出現(xiàn)病變(表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓和脫落)，收獲上清液(此為第2代病毒)；(6)收獲的上清液作為病毒液接種至新制備的95%融合的肌肉單層細胞，按步驟
(5)重復(fù)操作4 5次，直至收獲的上清液中病毒滴度大于I X IO6 tlTCID5ci (EV71經(jīng)單層沙鼠肌肉細胞中連續(xù)傳代5 6代后，細胞病變出現(xiàn)的時間可由原來的10天左右縮短至3天左右；病毒滴度可由原來的I 5X IO3tlTCID5。堤高至IXIO7qTCID5q以上)，離心去除細胞碎片，加10% (v/v)新生牛血清，再加病毒液2倍體積量的脫脂牛奶，即為病毒毒種，分裝后，-80°C保存?zhèn)溆茫?(7)取步驟(6)病毒毒種，接種至新制備的95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶，置35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，用細胞培養(yǎng)液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的無牛血清的細胞培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)2 3天，收獲病毒上清液；(8)所得病毒上清液滅活后，經(jīng)10萬分子量孔徑的超濾膜濃縮，再過S印harose或Sephacryl凝膠柱層析，收獲第一峰，即為疫苗原液；疫苗原液經(jīng)PBS稀釋使抗原量為I 160左右，按0.5% (w/v)比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再經(jīng)檢驗、分裝，即為疫苗成品；滅活采用常規(guī)β_丙內(nèi)脂或甲醛滅活，用于病毒滅活的β_丙內(nèi)脂體積用量為收獲病毒體積量的三千之一至五千之一，如用甲醛滅活病毒，體積用量為收獲病毒體積量的ニ千之一至四千之一。步驟(I) (7)中，所述細胞培養(yǎng)液為下列之一 ΜΕΜ培養(yǎng)液，F(xiàn)lO培養(yǎng)液或FlO/DMHM培養(yǎng)液。所述腸道病毒為腸道病毒EV71或CoxA16，可從手口足病患者水泡液中分離獲得。所述疫苗也可為EV71與CoxA16雙價疫苗，將腸道病毒EV71和CoxA16分別按步驟⑴ ⑶方法制得疫苗半成品，再按I : I體積比混合，經(jīng)檢驗、分裝后，得到EV71與CoxA16雙價疫苗成品。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明選擇沙鼠肌肉細胞作為培養(yǎng)EV71或CoxA16病毒的基質(zhì)細胞，EV71或CoxA16病毒在此細胞上生長滴度高，可多次收液；此細胞可多次傳代，并可建立成肌細胞株，用于疫苗的生產(chǎn)，節(jié)約沙鼠的消耗；它是原代細胞，不存在傳代細胞DNA難以處理等問題，制備疫苗生產(chǎn)エ藝相對簡単，純化方便，它所制備的疫苗對嬰幼兒接種，更安全、可靠。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例I :制備EV71單價疫苗(一 )制備細胞單層
取10 15天齡沙鼠，剪斷頸動脈放血處死，置O. 2% (v/v)新潔而滅消毒液中浸泡30分鐘，無菌取后腿肌肉細胞，剪碎，含100U/ml卡那霉素的MEM培養(yǎng)液洗二次，去盡洗液；加肌肉組織重10倍質(zhì)量的O. 2% (w/v)膠原酶ΙΙ、0. 25% (w/v)胰蛋白酶消化液，置4°C消化；16 20小時后棄消化液，加肌肉組織重10倍質(zhì)量的MEM液反復(fù)吹打分散細胞，依次過100、200和400目的不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液，離心，棄上清液，沉淀細胞用MEM重新懸浮，加新生牛血清至最終濃度為10% (v/v)，接種細胞瓶，36 °C培養(yǎng)2 3天。當細胞生長達到70% 80%融合時，換5% (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。細胞達到95%融合時，用于病毒接種；( ニ)病毒接種及傳代原始EV71病毒株為現(xiàn)有已知的毒株(CGMCC No. 3650)，保存病毒的維持液為含10% (v/v)小牛血清、100U/ml卡那霉素的pH7. 2MEM培養(yǎng)液，其中病毒滴度約為Ixio3 0TCid50 ； 取上述步驟已生長良好的細胞瓶，棄培養(yǎng)液，加入EV71病毒，35 V培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，加MEM培養(yǎng)液35°C培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)病變(表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓和脫落)，收獲病毒液，凍融一次，使細胞中的病毒釋放出來，離心去細胞碎片，收集上清液；病毒傳代收獲的上清液作為病毒液加入至新的95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶中，35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄上清液，加MEM培養(yǎng)液35°C培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)病變，收獲病毒液，凍融一次，離心去細胞碎片，收集上清液重復(fù)上述操作直至獲得第5代病毒的上清液，其病毒滴度約為I X IO7 tlTCID5ci，加10% (v/v)新生牛血清，再加病毒液2倍體積量的脫脂牛奶，經(jīng)檢定合格后，作為疫苗生產(chǎn)用毒種；(三)病毒増殖取以上病毒毒種，接種95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶，置35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，用MEM培養(yǎng)液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的無牛血清的MEM培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)2 3天，收獲上清液；(四)病毒滅活、濃縮與純化將收獲的病毒液加1/4000體積的丙內(nèi)脂，滅活病毒2h。滅活的病毒，經(jīng)10萬分子量孔徑的超濾膜濃縮適當倍數(shù)，再經(jīng)S印harose或S印hacryl凝膠柱層祈，收獲第一峰，即為疫苗原液。病毒原液需進行無菌試驗、抗原量測定、殘余牛血清測定和安全試驗。各項試驗和測定均合格者，進入下一道エ序。(五)加人血白蛋白將疫苗原液經(jīng)PBS稀釋使抗原量為I : 160左右，再按0.5% (w/v)加人血白蛋白，即為疫苗半成品。經(jīng)無菌試驗合格，進行分裝，每支I. 1ml，即為成品。成品疫苗液體需進行外觀檢查、無菌試驗、pH值測定、效カ測定、防腐劑試驗、毒性試驗。以上檢測全部符合國家的疫苗制檢規(guī)程的要求，即為EV71滅活疫苗。實施例2 :制備CoxA16疫苗在實施例I中將接種病毒更換為CoxA16病毒株(由杭州第六人民醫(yī)院提供)，其它制備方法相同，可制備CoxAie疫苗半成品及疫苗成品。實施例3 :制備EV71與CoxA16雙價疫苗在實例I制備的EV71疫苗半成品與實驗例2制備的CoxA16疫苗半成品，按I : I體積比混合，進行分裝，即為雙 價腸道病毒疫苗。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒疫苗的制備方法，所述方法包括 (1)取10 15天齡的沙鼠，處死，無菌取下肌肉組織，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的細胞培養(yǎng)液洗2次，去盡洗液； (2)加肌肉組織10倍質(zhì)量的含O.2%膠原酶ΙΙ、0. 25%胰蛋白酶的消化液，4°C消化過夜； (3)終止消化后棄消化液，加質(zhì)量為肌肉組織質(zhì)量10倍的細胞培養(yǎng)液反復(fù)吹打，分散細胞，依次過100、200和400目的不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液，離心，棄上清液，沉淀細胞用細胞培養(yǎng)液重新懸浮，加新生牛血清至其終濃度為10%，接種至細胞培養(yǎng)瓶，置36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4)差速貼壁2h后，將上清懸浮細胞轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)瓶，36°C培養(yǎng)至細胞生長達到70% 80%融合時，換含5%新生牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞達到95%融合時，用于病毒接種； (5)取95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，接種病毒滴度為IX 103_° 5 X IO3 0TCID50的含腸道病毒的病毒液，置35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，加含I %新生牛血清、100U/ml卡那霉素的細胞培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)病變，收獲上清液； (6)收獲的上清液作為病毒液接種至新制備的95%融合的肌肉單層細胞，按步驟(5)重復(fù)操作4 5次，直至收獲的上清液中病毒滴度大于I X IO6 ciTCID5tl，離心去除細胞碎片，加10 %新生牛血清，再加病毒液2倍體積量的脫脂牛奶，混勻，即為病毒毒種，分裝后，-80°C保存?zhèn)溆茫? (7)取步驟(6)病毒毒種，接種至新制備的95%融合的肌肉單層細胞培養(yǎng)瓶，置35°C培養(yǎng)箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，用細胞培養(yǎng)液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的無牛血清的細胞培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)2 3天，收獲病毒上清液； (8)所得病毒上清液滅活后，經(jīng)10萬分子量孔徑的超濾膜濃縮，再過S印harose或Sephacryl凝膠柱層析，收獲第一峰，即為疫苗原液；疫苗原液經(jīng)PBS稀釋使抗原量為1 160，按0.5%比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再經(jīng)檢驗、分裝，即為疫苗成品； 步驟⑴ (7)中，所述細胞培養(yǎng)液為下列之一 MEM培養(yǎng)液，F(xiàn)lO培養(yǎng)液或F10/DMEM培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述腸道病毒為腸道病毒EV71或CoxA16。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I) (7)中所述細胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述疫苗為EV71與CoxA16雙價疫苗，將腸道病毒EV71和CoxAie分別按步驟(I) (8)方法制得疫苗半成品，再按比例混合，經(jīng)檢驗、分裝后，得到EV71與CoxA16雙價疫苗成品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以沙鼠肌肉細胞作為病毒培養(yǎng)的基質(zhì)細胞制備腸道病毒疫苗的方法。本發(fā)明選擇沙鼠肌肉細胞作為培養(yǎng)EV71或CoxA16病毒的基質(zhì)細胞，EV71或CoxA16病毒在此細胞上生長滴度高，可多次收液；此細胞可多次傳代，可建立成肌細胞株，用于疫苗的生產(chǎn)，節(jié)約沙鼠的消耗；它是原代細胞，不存在傳代細胞DNA難以處理等問題，制備疫苗生產(chǎn)工藝相對簡單，純化方便，所制備的疫苗對嬰幼兒接種，更安全、可靠。
文檔編號A61P31/14GK102657858SQ20121012707
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者周小龍, 夏時暢, 姚蘋蘋, 徐芳, 朱函坪, 朱智勇, 楊章女, 謝榮輝, 錢磊 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心