專利名稱：一種凍干滅活乙型腦炎疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型凍干滅活乙型腦炎全病毒疫苗。
背景技術：
流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B,簡稱乙腦)的病原體1934年在日本發(fā)現，故又稱日本乙型腦炎(Japanese Encephalitise)。乙腦病毒屬披膜病毒科黃病毒屬，球形病毒顆粒外有囊膜，對溫度、乙醚等有機溶劑敏感。乙腦病毒經蚊蟲傳播，夏秋季流行。全球每年發(fā)病約50000例，主要流行地區(qū)為我國南方、東南亞及熱帶地區(qū)等國家，WHO建議所有乙腦流行國家均應實施乙腦疫苗免疫。目前國際上使用的乙腦疫苗主要為全病毒乙腦滅活疫苗和減毒活疫苗。疫苗在運輸和儲存過程中保持良好穩(wěn)定性是保證疫苗免疫效果的關鍵。與液體制劑相比，凍干疫苗具有更好的穩(wěn)定性。目前我國絕大部分凍干疫苗含有動物源蛋白，如人血白蛋白、明膠等。人血白蛋白及明膠具有攜帶源自動物本身病毒等外源因子的潛在危險，同時，明膠或血清蛋白也常常引起疫苗受種者的過敏反應。因此有必要尋找一種適合于全病毒滅活疫苗的穩(wěn)定的不含蛋白的賦形劑，尤其是適合于乙腦全病毒的穩(wěn)定劑。另外，由于純化疫苗中雜蛋白含量較低，與疫苗有效蛋白加在一起總蛋白含量也僅為100微克以內，病毒顆粒處于完全裸露狀態(tài)，因此比起未經純化的疫苗，純化疫苗更加不穩(wěn)定。本發(fā)明的目的就是建立一種不含明膠和人血白蛋白的穩(wěn)定劑和賦形劑配方，使疫苗在凍干、儲存及運輸過程中保持良好的穩(wěn)定性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種乙腦全病毒凍干制劑，其包含(a)滅活的乙腦全病毒；(b)穩(wěn)定劑，其包含麥芽糖，乳糖，和任選地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸(優(yōu)選地，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和賴氨酸中的一種或更多種，更優(yōu)選地為精氨酸)；以及任選地(c)緩沖劑(優(yōu)選地,磷酸鹽)，表面活性劑(優(yōu)選地，tween80),等滲調節(jié)劑(優(yōu)選地鈉鹽，更優(yōu)選地氯化鈉)，和/或螯合劑(優(yōu)選地EDTA或EDTA鈉鹽)。在一個實施方式中，本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑中穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖。在一個實施方式中，本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑中穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖和海藻糖。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖和甘露醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖和山梨醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，甘露醇和山梨醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖和甘露醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖和山梨醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，甘露醇和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，山梨醇和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和山梨醇。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖，山梨醇和精氨酸。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑為麥芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。在一個實施方式 中，本發(fā)明的凍干制劑包含滅活的乙腦全病毒，麥芽糖，乳糖，甘露醇，氯化鈉和磷酸鹽緩沖劑。在一個實施方式中，本發(fā)明的凍干制劑包含滅活的乙腦全病毒，麥芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，氯化鈉和磷酸鹽緩沖劑。在一個實施方式中，本發(fā)明的凍干制劑包含滅活的乙腦全病毒，麥芽糖，乳糖，海藻糖，精氨酸，和磷酸鹽緩沖劑。本文所述穩(wěn)定劑并不排除所述物質除了穩(wěn)定作用之外還起其它作用，例如，所述麥芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇等物質還可以起賦形劑的作用。其它物質的命名(例如，緩沖齊 ，表面活性劑，等滲調節(jié)劑，螯合劑等等)也是類似的。本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑不包含動物源蛋白質，例如明膠和人血白蛋白。本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑中所述滅活的乙腦全病毒是以VERO細胞或者人二倍體細胞為基質生產的，優(yōu)選地，采用生物反應器和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞和繁殖病毒。本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑中所述滅活乙腦病毒采用下述方法滅活將收獲的病毒懸液經過超濾濃縮、超速離心純化后用甲醛滅活。本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑在使用前需要進行重構，重構按照本領域的已知方法并根據生產商提供的說明書進行。例如，在一個實施方式中，本發(fā)明的凍干制劑用O. I-Iml注射用水/ 一次人用劑量(例如，O. 4-0. 6ml注射用水/ 一次人用劑量，例如O. 5ml注射用水/一次人用劑量)進行重構。本文所述一次人用劑量優(yōu)選地為一個包裝單元的劑量，例如一瓶凍干制劑劑量。在本發(fā)明的乙腦全病毒凍干制劑重構后的溶液中病毒的濃度為10-20微克/ml，并且總蛋白不高于20微克/ml，糖類(例如，麥芽糖，乳糖和海藻糖)的濃度(W/W)為I % -15% (例如，1-14%, 1-13%, 1-12%, 1-11%, 1-10 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10%,11%，12%，13%，14%，15% 等)，例如，麥芽糖濃度(W/W)為 1-10% (例如，I %，2 %，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)，乳糖濃度(W/W)為 1-10% (例如，I %，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)，海藻糖濃度(W/W)為 0-10% (例如，O. 1%,0. 2%,O. 3%,0.4%，0.5%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)。下述物質如果存在的話，其在所述凍干制劑重構后的溶液中的濃度分別為如下所述甘露醇 2 % -20 % (W/W)，山梨醇 2-10 % (ff/ff)，EDTA 或者 EDTA 鈉鹽 O. 03-3 % (V/ff)，tween80 O. 001-0. I % (ff/ff)，磷酸鹽緩沖液 IOmM-IOOmM,氯化鈉 O. 05-0. 15M,精氨酸O. 35 O. 9mM,谷氨酸O. 8 I. 6mM,谷氨酰胺O. 15 O. 45mM,賴氨酸O. 385 O. 77mM。本文所用的“W/W”表示“重量/重量”。在一個實施方式中，本發(fā)明凍干制劑中麥芽糖與乳糖的重量比為0.5 : 1-1 : O. 5,在一個實施方式中，所述重量比為O. 6 : 1-1 : O. 6,在一個實施方式中，所述重量比為O. 7 1-1 O. 7，在一個實施方式中，所述重量比為0.8 1-1 O. 8，在一個實施方式中，所述重量比為O. 9 1-1 O. 9，在一個實施方式中，所述重量比為I : I。在一個實施方式中，本發(fā)明凍干制劑中麥芽糖與海藻糖的重量比為10 : 1-2 : I,在一個實施方式中，所述重量比為9 1.2 1，在一個實施方式中，所述重量比為8 : 1.2 : 1，在一個實施方式中，所述重量比為7 1-2 1，在一個實施方式中，所述重量比為6 1.2 1，在一個實施方式中，所述重量比為5 1-2 1，在一個實施方式中，所述重量比為4 : 1-2 : I,在一個實施方式中,所述重量比為3 : 1-2 : I,在一個實施方式中，所述重量比為5 2。在一個實施方式中，本發(fā)明凍干制劑中麥芽糖乳糖海藻糖的重量比為5 : 5 : 2，在一個實施方式中，所述重量比為10 5 4，在一個實施方式中，所述重量比為10 10 1，在一個實施方式中，所述重量比為10 : 5 : I。 本發(fā)明還提供了上述任一種乙腦全病毒凍干制劑重構所得的液體制劑。在一個實施方式中，所述液體制劑為用O. 5ml注射用水將凍干制劑重構獲得。本文所述“包含”，“包括”等類似開放式用語也涵蓋了“由......組成”的情形。本發(fā)明與現有的疫苗相比具有顯著的優(yōu)越性。表I為本發(fā)明疫苗的一種配方與現有乙腦疫苗配方的比較表I現行乙腦疫苗賦形劑與本發(fā)明配方比較
權利要求
1.一種乙腦全病毒凍干制劑，其包含 (a)滅活的乙腦全病毒； (b)穩(wěn)定劑，其包含麥芽糖，乳糖，和任選地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸(優(yōu)選地，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和賴氨酸中的一種或更多種，更優(yōu)選地為精氨酸)； 以及任選地 (C)緩沖劑(優(yōu)選地,磷酸鹽),表面活性劑(優(yōu)選地，tween80),等滲調節(jié)劑(優(yōu)選地鈉鹽，更優(yōu)選地氯化鈉)，和/或螯合劑(優(yōu)選地EDTA或EDTA鈉鹽)。
2.權利要求I的乙腦全病毒凍干制劑，所述制劑不包含動物源蛋白質，例如明膠和人血白蛋白。
3.權利要求I的乙腦全病毒凍干制劑，所述滅活的乙腦全病毒是以VERO細胞或者人二倍體細胞為基質生產的，優(yōu)選地，采用生物反應器和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞和繁殖病毒。
4.權利要求3的乙腦全病毒凍干制劑，所述滅活乙腦病毒采用下述方法滅活將收獲的病毒懸液經過超濾濃縮、超速離心純化后用甲醛滅活。
5.權利要求I的乙腦全病毒凍干制劑，其中在所述凍干制劑重構后的溶液中病毒的濃度為10-20微克/ml，并且總蛋白不高于20微克/ml。
6.權利要求I的乙腦全病毒凍干制劑，其中在所述凍干制劑重構后的溶液中糖類(例如，麥芽糖，乳糖和海藻糖)的濃度為1^-10% (W/W)。
7.權利要求I的乙腦全病毒凍干制劑，其中下述物質如果存在的話，其在所述凍干制劑重構后的溶液中的濃度分別為如下所述甘露醇2%-20% (W/W)，山梨醇2-10% (ff/ff)，EDTA 或者 EDTA 鈉鹽 0. 03-3 % (ff/ff)，tween80 0. 001-0. I % (ff/ff)，磷酸鹽緩沖液IOmM-IOOmM,氯化鈉0. 05-0. 15M,精氨酸0. 35 0. 9mM,谷氨酸0. 8 I. 6mM,谷氨酰胺.0.15 0. 45mM,賴氨酸 0. 385 0. 77mM。
8.權利要求5-7任一項的乙腦全病毒凍干制劑,其中所述重構是用0.I-Iml注射用水/ 一次人用劑量(例如，0. 5ml注射用水/ 一次人用劑量)進行的。
9.由權利要求1-8任一項的乙腦全病毒凍干制劑重構所得的液體制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乙腦全病毒凍干制劑，其包含(a)滅活的乙腦全病毒；(b)穩(wěn)定劑，其包含麥芽糖，乳糖，和任選地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸；以及任選地(c)緩沖劑，表面活性劑，等滲調節(jié)劑)，和/或螯合劑。
文檔編號A61K47/26GK102631672SQ20121013111
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權日2012年4月27日
發(fā)明者任秀寶, 石慧穎 申請人:天津百若克醫(yī)藥生物技術有限責任公司