專利名稱：用于治療癌癥的嵌合腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地本發(fā)明涉及具有治療應(yīng)用的溶瘤腺病毒。
背景技術(shù)：
在美國(guó)和其它地區(qū)，癌癥是死亡的主要原因。根據(jù)癌癥的類型，典型地采用外科手術(shù)、化療和/或放射進(jìn)行治療。這些治療通常失敗，顯然需要有新的治療手段進(jìn)行單獨(dú)使用或與傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合使用。一種方法是使用腺病毒，單獨(dú)使用或作為能夠給腫瘤細(xì)胞輸送抗-癌治療蛋白的載體。腺病毒是無包膜二十面體雙鏈DNA病毒，具有大約36千個(gè)堿基對(duì)的基因組。該病毒基因組的每一末端具有已知的反向末端重復(fù)(ITR)短序列，其實(shí)病毒復(fù)制所必需的。迄今為止檢測(cè)到的所有人類腺病毒基因組具有相同的總體結(jié)構(gòu)；即，編碼特定功能的該基因定位于病毒基因組的相同位置。所述病毒基因組含有5個(gè)早期轉(zhuǎn)錄單位(E1A、E1B、E2、E3和E4)、2個(gè)延遲早期單位(IX和Iva2)和I個(gè)被加工產(chǎn)生5個(gè)家族的晚期mRNAs (L1-L5)的晚期單位(主要晚期)。由早期基因編碼的蛋白質(zhì)參與復(fù)制，而晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。所述病毒基因組的一部分可以用外源DNA容易地進(jìn)行取代，且重組腺病毒在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的，這些特性使得這些病毒對(duì)基因治療具有潛在用途(參見Jolly，D. (1994)CancerGene Therapy 1:51-64)。目前，致力于產(chǎn)生臨床上有用的腺病毒治療的研究已聚焦于腺病毒血清型，Ad5。這一人類腺病毒的遺傳學(xué)被很好地表征，對(duì)其進(jìn)行分子操縱的系統(tǒng)也被充分地描述。大量生產(chǎn)方法已經(jīng)被開發(fā)以支持臨床應(yīng)用，可獲得一些關(guān)于該制劑的臨床經(jīng)驗(yàn)，參見，Jolly,D. (1994) Cancer Gene Therapy，1:51-64。涉及人類腺病毒(Ad)在癌癥治療中的應(yīng)用的研究已聚焦于開發(fā)基于Ad5的腺病毒，該腺病毒在特定的腫瘤細(xì)胞類型中有更效價(jià)或者優(yōu)先靶向特定的腫瘤細(xì)胞類型；且如果要想使得腺病毒治療在臨床上得到實(shí)際應(yīng)用，則存在產(chǎn)生更有效的溶瘤病毒的需求。Ad5僅僅是51種目前已知的腺病毒血清型中的一種，基于不同的特性包括紅血球凝聚特性其被分類為亞群A至F(參見，Shenk, ^Adenoviridae:The Viruses andTheir Replication,，，F(xiàn)ields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea. , Lippincott, Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001))。這些血清型在多個(gè)水平上不同，例如在人類和嚙齒動(dòng)物中的病理學(xué)、用于附著的細(xì)胞受體，但是這些區(qū)別在很大程度上被忽略了其可作為開發(fā)更有效的溶瘤腺病毒的潛在方法(除纖維蛋白改變(fiber alterations)夕卜，參見 Stevenson et al. (1997)J. Virol. 71:4782-4790;Krasnykh et al. (1996)J. Virol. 70:6839-6846 ；ffickham et al. (1997)J.Virol.71:8221-8229;Legrand etal. (2002)Curr. Gene Ther. 2:323-329 ；Barnett et al. (2002)Biochim. Biophys. Acta1-3:1-14;美國(guó)專利申請(qǐng) 2003/0017138)。對(duì)腺病毒血清型間的差異的利用可以為利用具有增強(qiáng)的選擇性和效價(jià)的新的腺病毒的更有效的基于腺病毒的療法提供來源。存在對(duì)這種改良的基于腺病毒的治療的需求
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了對(duì)基于病毒的治療有用的新的嵌合腺病毒或其變體或衍生物。特別地，本發(fā)明提供了具有包含E2B區(qū)域的基因組的嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區(qū)域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列； 其中所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此間不相同；以及，其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出提高的治療指數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒還包含編碼纖維蛋白、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白的區(qū)域，其中編碼所述蛋白的核酸均來自相同的腺病毒血清型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合腺病毒包含經(jīng)修飾的E3或E4區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞、乳腺腫瘤細(xì)胞、胰腺腫瘤細(xì)胞、肺腫瘤細(xì)胞、前列腺腫瘤細(xì)胞、卵巢腫瘤細(xì)胞或造血腫瘤細(xì)胞中顯示出提高的治療指數(shù)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中顯示出提高的治療指數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒的E2B區(qū)域包含SEQ ID N0:3。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒包含SEQ ID NO: I。本發(fā)明提供了具有包含E2B區(qū)域的基因組的重組嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區(qū)域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同；其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出提高的治療指數(shù)；以及其中所述嵌合腺病毒已通過缺失選自El、E2、E3或E4的一或多個(gè)編碼參與腺病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)的腺病毒區(qū)域而成為復(fù)制缺陷型。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合腺病毒還包含一種編碼治療性質(zhì)蛋白質(zhì)的異源基因，其中所述異源基因在被所述腺病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述治療性蛋白質(zhì)選自由細(xì)胞因子和趨化因子、抗體、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)所組成的組。本發(fā)明提供了將本發(fā)明的嵌合腺病毒用于治療目的的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合腺病毒可被用以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，包含SEQ ID NO: I的嵌合腺病毒被用于抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合腺病毒作為將治療蛋白輸送給細(xì)胞的載體是有用的。本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明的嵌合腺病毒的方法，其中該方法包括h)集合代表腺病毒亞群B至F的腺病毒血清型，從而產(chǎn)生腺病毒混合物；i)將來自步驟(a)的集合的腺病毒混合物在腫瘤細(xì)胞的活躍生長(zhǎng)培養(yǎng)物中，以高至足以促進(jìn)血清型之間發(fā)生重組但沒有高至產(chǎn)生過早細(xì)胞死亡的顆粒/細(xì)胞比率進(jìn)行傳代；j)從步驟(b)收獲上清；k)用在步驟(C)中收獲的上清感染腫瘤細(xì)胞的靜止培養(yǎng)物； I)在出現(xiàn)任何細(xì)胞病變(CPE)的跡象之前，從步驟(d)中收獲細(xì)胞培養(yǎng)物上清；m)用在步驟(e)中收獲的上清感染腫瘤細(xì)胞的靜止培養(yǎng)物；和η)通過空斑純化從在步驟(f)中收獲的上清中分離所述嵌合腺病毒。


圖I :Ad在TMAE HPLC柱上的保留時(shí)間圖。A)用以產(chǎn)生原始的起始病毒池的各Ad血清型的保留圖。B)分別衍生自HT-29、Panc-l、MDA-231和PC-3細(xì)胞系的20代傳代池的保留圖。圖2 :各病毒池的細(xì)胞溶解活性。用各自的病毒池以VP/細(xì)胞比率為100-0. 01感染A) HT-29、B)MDA-231、C) Panc-I和D) PC-3細(xì)胞。根據(jù)不同的細(xì)胞系在感染后的不同天數(shù)(如圖所標(biāo)示)進(jìn)行MTS檢測(cè)。圖面中的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次一式四份的檢測(cè)，結(jié)果以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差表示。每一圖面描述了一個(gè)代表性的試驗(yàn)，且至少在3個(gè)獨(dú)立的時(shí)間對(duì)全部病毒池的靶腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)(圖例_ · -Ad5、一V—初始病毒池、-■-衍生自池的特定細(xì)胞，20代)。圖3 =ColoAdl和Ad5對(duì)人腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞溶解活性。對(duì)A) —大組人腫瘤細(xì)胞系，和B) —組人結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行MTS檢測(cè)以測(cè)定其潛在的效價(jià)特異性。根據(jù)不同的細(xì)胞系在不同天數(shù)進(jìn)行所述MTS檢測(cè)。每一圖面是重復(fù)了至少3次的一個(gè)代表性試驗(yàn)。圖面中的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次一式四份的檢測(cè)，結(jié)果以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差表示(圖例_ · _Ad5、—V— ColoAdl)。圖4 =ColoAdl和Ad5對(duì)一組指出細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。用ColoAdl和Ad5以VP/細(xì)胞比率為100-0. 01感染HS-27、HUVEC和SAEC細(xì)胞(分別為原始成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞)。根據(jù)不同的細(xì)胞在感染后的不同天數(shù)進(jìn)行MTS檢測(cè)，每一圖面是重復(fù)了至少3次的一個(gè)代表性試驗(yàn)。圖面中的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次一式四份的檢測(cè)，結(jié)果以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示(圖例-# _Ad5、——V——ColoAdl)。圖5 =ColoAdU Ad5和0NYX-015對(duì)原始正常內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系(HT-29)的細(xì)胞溶解活性。每一圖面是重復(fù)了至少3次的一個(gè)代表性試驗(yàn)。圖面中的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次一式四份的檢測(cè)，結(jié)果以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差表示(圖例_ · -Ad5、一V—ColoAdl、- ■ -Onyx-OI5)。
圖6 :ColoAdl、Adllp和Ad5對(duì)正常上皮細(xì)胞系(SAEC)和人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29)的細(xì)胞溶解活性。每一圖面是重復(fù)了至少3次的一個(gè)代表性試驗(yàn)。圖面中的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次一式四份的檢測(cè)，結(jié)果以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示(圖例_ · -Ad5、—▽—Adllp、- ■ -CoIoAdI)。圖7 :重組病毒的細(xì)胞溶解活性。按照實(shí)施例6的記載構(gòu)建代表4個(gè)病毒群體(Adp11 > ColoAdK 左端 Adllp/ 右端 ColoAdl (ColoAdl. I)和左端 ColoAdl/ 右端Adllp (ColoAdl. 2))的重組病毒。每一群體在HT29細(xì)胞中的溶解活性按照先前的描述進(jìn)行測(cè)定。(圖例_ 魯 _Ad5、-▽-Adllp、- ■ —ColoAdl —ColoAdl. 1、_ ▲ —ColoAdl. 2)。
具體實(shí)施例方式說明書中所提及的所有出版物，包括專利和專利申請(qǐng)，在此通過引用完整地合并入本發(fā)明，相當(dāng)于每一份單獨(dú)的出版物被特別地和單獨(dú)地指出通過引用以其整體合并入本發(fā)明。

除非特別說明，本申請(qǐng)所使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。一般地，本申請(qǐng)所使用的術(shù)語和下面描述的試驗(yàn)方法是在本領(lǐng)域中廣泛已知和普遍應(yīng)用的。本申請(qǐng)所用術(shù)語“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”指目前已知的51種人類腺病毒血清型或?qū)矸蛛x的人類腺病毒血清型中的任何一種。參見，例如Strauss, “Adenovirus infections in humans，，，The Adenoviruses, Ginsberg, ea.
,Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)。這些血清型被分類于 A至F亞群中(參見，Shenk, ^Adenoviridae: The Viruses and Their Replication，，，F(xiàn)ieldsVirology, Vol. 2,Fourth Edition,Knipe, ea. , Lippincott Williams &Wilkins, pp. 2265-2267，2001)，如表 I 中所示。表I
權(quán)利要求
1.一種用于分離具有包含E2B區(qū)域的基因組的重組嵌合腺病毒的方法，所述E2B區(qū)域包含來自第一種腺病毒血清型的核酸序列和來自第二種腺病毒血清型的核酸序列；所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同，其中所述方法包括 a)集合代表腺病毒亞群B至F的腺病毒血清型，從而產(chǎn)生腺病毒混合物； b)將來自步驟(a)的集合的腺病毒混合物在腫瘤細(xì)胞的活躍生長(zhǎng)培養(yǎng)物中，以高至足以促進(jìn)血清型之間發(fā)生重組但沒有高至產(chǎn)生過早細(xì)胞死亡的顆粒/細(xì)胞比率進(jìn)行傳代； c)從步驟(b)收獲上清； d)用在步驟(C)中收獲的上清感染腫瘤細(xì)胞的靜止培養(yǎng)物； e)在出現(xiàn)任何CPE的跡象之前，從步驟(d)中收獲細(xì)胞培養(yǎng)物上清； f)用步驟(e)中收獲的上清感染腫瘤細(xì)胞的靜止培養(yǎng)物；和 g)通過空斑純化從在步驟(f)中收獲的上清中分離重組嵌合腺病毒。
2.權(quán)利要求I的方法，其中在收獲步驟(C)中的上清之前進(jìn)行步驟(b)兩遍。
3.權(quán)利要求I的方法，其中在步驟(g)之前重復(fù)步驟(e)和(f)20遍。
4.權(quán)利要求I的方法，其中在步驟(g)之后進(jìn)行第二輪空斑純化。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是結(jié)腸腫瘤細(xì)胞、乳腺腫瘤細(xì)胞、胰腺腫瘤細(xì)胞、肺腫瘤細(xì)胞、前列腺腫瘤細(xì)胞、卵巢腫瘤細(xì)胞或造血腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明為用于治療癌癥的嵌合腺病毒，涉及具有治療用途的溶瘤腺病毒。本發(fā)明提供了重組嵌合腺病毒以及生產(chǎn)它們的方法。本發(fā)明的嵌合腺病毒包含衍生自B至F亞群分類的腺病毒血清型的核酸序列，并顯示出提高的治療指數(shù)。
文檔編號(hào)A61K35/76GK102816742SQ20121013565
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者保羅·哈登, 特麗·赫米斯頓, 艾琳·庫(kù)恩 申請(qǐng)人:普西奧克瑟斯醫(yī)療有限公司