專利名稱：一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DVH)引起的雛鴨一種急性高度致死性傳染病，這種病的特點是發(fā)病急、病程短、傳染快、發(fā)病率與死亡率都比較高的疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer Factor)又稱傳輸因子，可以作為細(xì)胞免疫促進劑，是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，這種物質(zhì)將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機體的免疫 反應(yīng)，提高受體的細(xì)胞免疫功能；同時促進B淋巴細(xì)胞分泌作用，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的抵抗力，這種轉(zhuǎn)移因子分子量小、無毒、活性強、無抗原性、不起過敏反應(yīng)等優(yōu)點，對于治療動物病毒性疾病、細(xì)胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤、真菌性疾病時，可以起輔助治療作用。盡管目前已經(jīng)有一些抗鴨病毒性肝炎的藥品和制劑，但由于現(xiàn)有的藥品制劑針對性不強，療效有限，而且治療性的制劑多是在發(fā)病之后才應(yīng)用的，不能起到根本的治療作用。目前已報道的轉(zhuǎn)移因子的提取方法大多關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，而且多是體內(nèi)轉(zhuǎn)移因子免疫法的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，以雞脾臟或外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA)和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞,從而促進體外產(chǎn)生大量抗鴨肝炎病毒特異轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明制備方法的具體步驟如下
1)淋巴細(xì)胞的制備首先選擇健康雞，在無菌的條件下采取雞脾臟或抗凝血，制成單層淋巴細(xì)胞；
2)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，以單層形式傳代，備用；
3)病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于9-10日齡雞胚的尿囊腔內(nèi)，37°C培養(yǎng)72-120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
4)轉(zhuǎn)移因子的制備經(jīng)過植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，即得抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。步驟I)所述雞脾細(xì)胞制備過程中胰酶濃度要求O. 22-0. 25%，pH為7. 3-7. 6，用量為組織體積量的5-7倍。步驟4)所述促進雞脾臟細(xì)胞或血淋巴細(xì)胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60_180mg/L。本發(fā)明關(guān)于體外制備的抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子能夠高效的抑制鴨病毒性肝炎病毒，保護正常機體細(xì)胞免受鴨病毒性肝炎的感染，達(dá)到根本上預(yù)防的作用。這種通過傳代培養(yǎng)可以生產(chǎn)出大量的產(chǎn)品，出產(chǎn)率高，成本低，可以節(jié)約大量的人力、物力，可避免產(chǎn)品攜帶外援病毒及其他病源微生物。這制備方法具有簡單、易操作、生產(chǎn)成本低等特點。
具體實施例方式結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的說明。實施例I
一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實施例是以雞外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進體外產(chǎn)生大量抗鴨肝炎病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下
1.抗凝血的采集選擇健康無傳染病雞，采血部位消毒，用50mL的無菌注射器，心臟采集抗凝血，加入濃度為lmg/mL的肝素鈉5mL ；
2.淋巴細(xì)胞分離抗凝血與淋巴細(xì)胞分離液(購買北京普利生物有限公司，按使用說明操作)按I :1的比例加入消毒后的離心管中，淋巴細(xì)胞分離液加到離心管的底部，3000r/min離心15min,收集中間的白色層；然后用pH7. O的Hanks液反復(fù)清洗淋巴細(xì)胞4次，5000r/min，離心lOmin，收集沉淀，用含30%的犢牛血清DMEM (購買InvitrogenCorporation，按使用說明操作)80mL充分混勻，然后分裝于IOOmL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2, 37°C恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)2天的培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞貼壁生長形成單層；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，首先將長成單層淋巴細(xì)胞層用
O.22%的胰酶37°C短時間消化，吹打分散，加入pH7. O的Hanks液終止，再洗3遍，取1/3加入到干凈培養(yǎng)瓶，5% C02，37°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察一次，長成單層為止；
4.病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于9日齡雞胚的尿囊腔中，37°C培養(yǎng)72h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)當(dāng)單層淋巴細(xì)胞長成后，更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM)，同時加入濃度為60mg/L的植物血凝素，鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；經(jīng)過3天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后將細(xì)胞瓶經(jīng)過微振蕩，將培養(yǎng)液移置于離心管中離心，收集上清液；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備上清液利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，400W,10min)破碎后，離心取上清，經(jīng)O. 22um濾膜過濾，濾液經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即得抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。實施例2
一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實施例是以雞外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進體外產(chǎn)生大量抗鴨肝炎病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下1.抗凝血的采集選擇健康無傳染病雞，采血部位消毒，用50mL的無菌注射器，心臟采集抗凝血，加入濃度為lmg/mL的肝素鈉5mL ；
2.淋巴細(xì)胞分離抗凝血與淋巴細(xì)胞分離液(購買北京普利生物有限公司，按使用說明操作)按I :1的比例加入消毒后的離心管中，淋巴細(xì)胞分離液加到離心管的底部，2500r/min離心20min,收集中間的白色層；然后用pH7. 2的Hanks液反復(fù)清洗淋巴細(xì)胞4次，4000r/min，離心lOmin，收集沉淀，用含30%的犢牛血清DMEM (購買InvitrogenCorporation,按使用說明操作)80mL充分混勻，然后分裝于IOOmL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%C02，37°C轉(zhuǎn)瓶機中培養(yǎng)，經(jīng)3天的培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞貼壁生長形成單層；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，首先將長成單層淋巴細(xì)胞層用O. 25%的胰酶37°C消化2 min,吹打分散，加入pH7. 2的Hanks液終止，再洗2遍，取1/3加入到干凈培養(yǎng)瓶，5% C02，37°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察一次，長成單層為止；
4.病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于10日齡雞胚的尿囊腔中，37°C培養(yǎng)96h增殖病 毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)當(dāng)單層淋巴細(xì)胞長成后，更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM)，同時加入濃度為180mg/L的植物血凝素，鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)過3天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后將細(xì)胞瓶經(jīng)過微振蕩，將培養(yǎng)液移置于離心管中離心，收集上清液；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備上清液經(jīng)過超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，離心取上清，經(jīng)O. 22um濾膜過濾，濾液經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即得抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。實施例3
一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實施例主要包括雞脾臟制備單層淋巴細(xì)胞、添加植物血凝素和病毒誘導(dǎo)等步驟，具體步驟如下
1.脾臟的采集選取健康無傳染病的雞，在無菌條件下摘取脾臟，然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內(nèi)臟表面液體，用酒精消毒表面，剔除臟器表面脂肪組織和筋膜，用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內(nèi)部取部分組織，置于30mL的燒杯中，然后將其剪碎成直徑小于
O.Icm的塊，再用pH7. 2的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質(zhì)，盡可能保證組織干凈；
2.脾細(xì)胞制備上述碎組織中加入5倍量的pH為7.3、濃度O. 22%的胰酶液，放入37°C的水浴鍋中消化20min ，每5 min搖動一次，以便組織充分消化，直到組織變成透明，周邊發(fā)毛為止，說明消化完全，可以取出燒杯，吸取胰液，加入預(yù)熱維持液PH7. 2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使組織分散，然后經(jīng)過濾留取濾液；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，取濾液10uL，稀釋100倍，然后顯微鏡下觀察，與血細(xì)胞計數(shù)規(guī)則一樣，確定稀釋倍數(shù)；將用DMEM液稀釋后的濾液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件5% C02、37°C恒溫箱上培養(yǎng)，每天觀察兩次，在顯微鏡下觀察是否形成單層細(xì)胞，確定傳代培養(yǎng)；
4.病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于9日齡雞胚的尿囊腔中，37°C培養(yǎng)120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；5.誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代培養(yǎng)成單層淋巴細(xì)胞后，更換營養(yǎng)液為維持液，同時加入濃度為100mg/L植物血凝素和鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)，進行2天的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，400W，10min)破碎后，離心取上清，過濾，再經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。實施例4
一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實施例主要包括雞脾臟制備單層淋巴細(xì)胞、添加植物血凝素和病毒誘導(dǎo)等步驟，具體步驟如下
1.脾臟的采集選取健康無傳染病的雞，在無菌條件下摘取脾臟，然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內(nèi)臟表面液體，用酒精消毒表面，剔除臟器表面脂肪組織和筋膜，用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內(nèi)部取部分組織，置于30mL的燒杯中，然后將其剪碎成直徑小于
O.Icm的塊，再用pH7. O的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質(zhì)，盡可能保證組織干凈；
2.脾細(xì)胞制備上述碎組織中加入7倍量的pH為7.6、濃度O. 25%的胰酶液，放入37°C的水浴鍋中消化30min ，每5 min搖動一次，以便組織充分消化，直到組織變成透明，周邊發(fā)毛為止，說明消化完全，可以取出燒杯，吸取胰液，加入預(yù)熱維持液PH7. O的Hanks液，用吸管吹打90次充分使組織分散，然后經(jīng)過濾留取濾液；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，取濾液10uL，稀釋100倍，然后顯微鏡下觀察，與血細(xì)胞計數(shù)規(guī)則一樣，確定稀釋倍數(shù)；將用DMEM液稀釋后的濾液分裝于細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)條件5% C02、37°C恒溫箱上培養(yǎng)，每天觀察兩次，在顯微鏡下觀察是否形成單層細(xì)胞，確定傳代培養(yǎng)；
4.病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于10日齡雞胚的尿囊腔中，37°C培養(yǎng)120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代培養(yǎng)成單層淋巴細(xì)胞后，更換營養(yǎng)液為維持液，同時加入濃度為140mg/L植物血凝素和鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)，進行2天的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，400W,10 min)破碎后，離心取上清，過濾，再經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。實驗例I :動物保護試驗
取300只12日齡健康雛鴨，隨機分成對照、試驗、空白三組，每組100只，在新環(huán)境中適應(yīng)三天，自由采食，攻毒劑量為I. 0 108CFU/只，攻毒后第三天試驗組開始接種抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子，每只肌注O. 2ml/只，每天一次，對照組注射生理鹽，空白全程生理鹽水，觀察臨床癥狀和死亡率作為指標(biāo)反應(yīng)本品的臨床應(yīng)用效果。結(jié)果顯示對照組發(fā)病率100%和死亡率100%，空白組沒有變化,試驗組發(fā)病率25%，而死亡率3%。實驗例2 :動物安全試驗
取健康小白鼠150只，隨機分成空白、注射組、口服三組，每組50只，空白口服和注射蒸餾水2 ml/只，注射組注射本品5 ml/只，口服組灌服本品5 ml/只，觀察小白鼠的變化。結(jié)果顯示三組都無異常變化，說明本品安全，無不良反應(yīng)。實驗例3 皮膚刺激性試驗取30只小白兔，分成對照、皮下注射、皮內(nèi)注射2組，采用脫毛劑對家兔脊柱兩側(cè)被毛脫去，保證皮膚的完整性，然后注射本品I ml/只，對照組注射生理鹽水，分成單次給藥、多次給藥觀察皮膚的變化。結(jié)果顯示，注射生理鹽水的10只中，有5只發(fā)生紅腫，一天消腫，試驗組中各有3只發(fā)生，12小時內(nèi)全部消腫。實驗例4
本實驗例采用各種常規(guī)方法對發(fā)明的抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的檢測
I、多肽含量的測定用Folin-酚法或分光光度法測定多肽，以鴨外周血液為基礎(chǔ)原料多肽含量O. 46g/L，以鴨脾臟為原料制備的轉(zhuǎn)移因子多肽含量O. 39g/L。2、蛋白質(zhì)的測定采用20%磺基水楊酸方法，提取液沒有發(fā)生渾濁和沉淀現(xiàn)象，呈陰性，不含蛋白質(zhì)。3、無菌檢測根據(jù)《中華人民共和國獸藥典2011版》進行檢測，沒有細(xì)菌生長。 4、核糖含量測定利用分光光度法測定，以鴨外周血液為基礎(chǔ)原料核糖含量
O.34g/L，以鴨脾臟為原料制備的轉(zhuǎn)移因子核糖含量O. 43g/L。5、外觀及pH值測定黃色澄明液體，酸度值為7. 0-7. 3之值。通過以上實驗例，我們可以得到本發(fā)明所提取的抗鴨病毒肝炎轉(zhuǎn)移因子不僅能安全高效的抑制鴨病毒性肝炎病毒，還能夠保護正常機體細(xì)胞免受鴨病毒性肝炎的感染，提高機體的免疫力。本品的體外制備方法是可行的，這種發(fā)明方法不僅操作簡便，減小工作強度，生產(chǎn)成本低，應(yīng)在臨床上廣泛推廣。
權(quán)利要求
1.一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于以雞脾臟或外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進體外產(chǎn)生大量抗鴨肝炎病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下 1)淋巴細(xì)胞的制備首先選擇健康雞，在無菌的條件下采取雞脾臟或雞抗凝血，制成單層淋巴細(xì)胞； 2)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，以單層形式傳代，備用； 3)病毒的接種將鴨肝炎病毒接種于9-10日齡雞胚的尿囊腔內(nèi)，37°C培養(yǎng)72-120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒； 4)轉(zhuǎn)移因子的制備經(jīng)過植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，即得抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是步驟I)所述雞脾細(xì)胞制備過程中胰酶濃度要求0. 22-0. 25%，pH為7. 3-7. 6，用量為組織體積量的5-7倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是步驟4)所述促進雞脾臟細(xì)胞或血淋巴細(xì)胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60-180mg/L0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子的制備方法，利用體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方式，經(jīng)過鴨肝炎病毒的誘導(dǎo)制備抗鴨病毒性肝炎轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明是以雞脾臟或外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進體外產(chǎn)生大量抗鴨肝炎病毒特異轉(zhuǎn)移因子。該轉(zhuǎn)移因子能夠有效的抑制鴨病毒性肝炎病毒，使正常的機體免受鴨病毒性肝炎的感染，起到根本的預(yù)防作用。本發(fā)明方法方法具有簡單、易操作等特點。
文檔編號A61P37/04GK102697808SQ20121013630
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者吳紅云, 郭俊清 申請人:鄭州后羿制藥有限公司