專利名稱：一種靶向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體及制備方法和應用。背景技術：
microRNA (miRNA)是一類長度為18 25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’ UTR)完全或部分互補配對結(jié)合，導致靶mRNA降解或翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控靶基因的表達。大量的科學研究表 明，microRNA廣泛參與了生物體多種生理及病理過程，如個體發(fā)育，細胞增殖、凋亡和分化，代謝、免疫與應激反應的調(diào)節(jié)，腫瘤形成等。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟多階段的過程，除了外界致癌因素的作用外，機體的內(nèi)在因素也起著重要作用，后者常常伴隨著原癌基因的激活和抑癌基因的失活，還有凋亡相關基因的異常表達等也與細胞癌變有密切關系。腫瘤的靶向治療是針對腫瘤特異性的發(fā)病機制或是信號傳導通路，采用能與靶分子特異性結(jié)合的單克隆抗體或小分子物質(zhì)等，靶向引導治療藥物至腫瘤靶部位，從而抑制腫瘤生長，達到治療腫瘤的目的。如前列腺干細胞抗原(PSCA)主要在前列腺上皮中表達，在其他正常組織僅有低水平表達，其表達水平不足正常前列腺的1%，PSCA在前列腺癌表達增強，而且在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移時出現(xiàn)明顯的表達上調(diào)。由于以上幾點，PSCA成為了前列腺癌分子靶向治療較為理想的靶標。miRNA轉(zhuǎn)運載體的研究和開發(fā)一直是實現(xiàn)miRNA對腫瘤的靶向治療的關鍵問題。研究人員一直在尋找合適的載體材料能有效地將miRNA輸送到腫瘤靶部位，并在一定時間內(nèi)維持其功效，并且對其功效進行在體無創(chuàng)的連續(xù)監(jiān)測。目前，用于miRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)運的方法主要包括病毒載體、轉(zhuǎn)運試劑與miRNAs直接偶聯(lián)、脂質(zhì)體或多聚物介導的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。但是這些方法缺乏足夠的靶向性和安全性，轉(zhuǎn)運的miRNA分子更傾向于分布在肝臟脾臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，不能有效跨越細胞膜到達靶向治療的腫瘤組織，常常導致非特異的免疫反應。分子影像技術是在細胞和分子水平對生理或病理過程進行定性和定量研究的無倉|J、實時的影像技術。因此，在對腫瘤生物學行為的研究中，分子影像技術可以通過在體可視化手段，定性甚至定量地揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程，并在腫瘤治療中準確實時地監(jiān)測其療效，成為腫瘤研究和臨床診療不可替代的重要手段。光學成像技術具有高靈敏度(單分子水平)、超快速響應(皮秒級)、高空間分辨率(衍射極限)、多參量檢測和低損傷等優(yōu)點。同時，由于光學分子探針種類繁多且光譜范圍廣，使得載體并行獲取多分子事件信息成為可能，然而，光學成像技術也存在一些固有缺陷，即其成像深度有限，這就需要借助其他的技術手段來彌補這一不足。磁共振成像有著極精細的空間分辨率和極佳的組織分辨率，可在高分辨地顯示組織解剖結(jié)構(gòu)地同時，對深部組織進行精細、準確地定位，這一天然的優(yōu)勢正好彌補光學分子成像的缺點，因此，將這兩種技術相互融合，相互補充，是一種非常理想的多模態(tài)分子成像模式磁共振成像提供空間結(jié)構(gòu)和深部組織信息，光學成像提供腫瘤分子成像信息。三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體及制備方法和應用，用于靶向轉(zhuǎn)運miRNA到目標靶點，實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療，采用四氧化三鐵磁性納米顆粒轉(zhuǎn)運miRNA，并且在納米顆粒上修飾了熒光標記，利用近紅外熒光成像和磁共振成像相結(jié)合的雙模態(tài)成像技術實時監(jiān)測miRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和對腫瘤的治療效果。為實驗上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體，所述多功能磁性納米載體的活性成分為單克隆抗體、突光染料與microRNA轉(zhuǎn)運載體的偶聯(lián)產(chǎn)物。所述的制備方法為首先制備右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒，然后將熒光染料與納米顆粒交聯(lián)，接著通過一個連接劑將特異性單克隆抗體連接到納米顆粒上，最后將microRNA也通過連接劑連接到納米顆粒上，最終得到可用于光學和磁共振成像的microRNA磁性納米載體。所述的制備方法的包括以下具體步驟
(1)采用化學共沉淀法，加入摩爾比為2:1的FeCl3X6H20和FeCl2X4H20，以氨水為沉淀劑，右旋糖苷為表面活性劑，按照沉淀、陳化、純化、干燥的步驟合成右旋糖苷包裹的氨基化的磁性納米顆粒；
(2)將N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的熒光染料與透析好的氨基化的磁性納米顆?；靹驍嚢?，過柱純化后得到結(jié)合了熒光染料的磁性納米顆粒；
(3)將上述磁納米顆粒通過N-羥基琥珀酰亞胺酯與連接劑N-琥珀酰胺-3-(2- 二硫哌啶)-丙酸酯(STOP)相連，過柱純化后將單克隆抗體通過巰基活化的哌啶二硫基團反應連接到SPDP連接劑上，過柱純化后得到進一步交聯(lián)了抗體的納米顆粒；
(4)合成microRNA雙鏈核苷酸，并在有義鏈的5’端作硫代修飾，去保護后與步驟(3)得到的納米顆粒一起4°C孵育過夜，最終得到可用于光學和磁共振成像的microRNA多功能磁性納米載體。步驟(I)所述的氧化鐵磁性納米顆粒的平均粒徑為60-90 nm,磁飽和強度值為60-100 emu/g,表面 zeta 電位 30-50 mV。步驟(2)所述的熒光染料為Cy3，Cy5, Cy5. 5或Cy7。一種microRNA多功能磁性納米載體在抗腫瘤及制備癌癥基因治療藥物中的應用。一種microRNA多功能磁性納米載體在實時監(jiān)測microRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和對腫瘤的治療效果中的應用。所述microRNA轉(zhuǎn)運載體為右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和效果
1.采用右旋糖苷包裹磁性納米顆粒，提高了其在水和生理介質(zhì)(PBS生理緩沖液及血漿)中的溶解性，延長了納米顆粒在體內(nèi)的血液循環(huán)時間；
2.在納米顆粒表面接上腫瘤特異性的單克隆抗體，使得整個納米顆粒對聚集到特異腫瘤部位具有很強的靶向性；
3.本發(fā)明制備的納米顆粒既可以將miCToRNA轉(zhuǎn)運到體內(nèi)用于腫瘤的靶向治療，又能同時應用近紅外熒光成像和磁共振成像技術進行在體實時監(jiān)測，對miRNA在腫瘤中的療效進行在體評估。
四

圖I為本發(fā)明miRNA-16的交聯(lián)作用后得到的多功能磁性納米顆粒MN-Cy5. 5-PSCA-miRNA-16 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明制備的磁性納米載體進行抗腫瘤細胞實驗在作用48小時后，利用MTT方法檢測的對腫瘤細胞生長抑制效果的結(jié)果。五具體實施方式
本發(fā)明一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體,所述多功能磁性納米載體的活性成分為單克隆抗體、突光染料與microRNA轉(zhuǎn)運載體的偶聯(lián)產(chǎn)物,所述microRNA轉(zhuǎn)運載體為右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒。本發(fā)明的制備方法首先制備右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒，然后將熒光染料與納米顆粒交聯(lián)，接著通過一個連接劑將特異性單克隆抗體連接到納米顆粒上，最后將miRNA也通過連接劑連接到納米顆粒上，最終得到可用于光學和磁共振成像的miRNA磁性納米載體。具體包括以下步驟
(I)采用化學共沉淀法，加入摩爾比為2:1的FeCl3X6H20和FeCl2X4H20，以氨水為沉淀劑，右旋糖苷為表面活性劑，按照沉淀、陳化、純化、干燥的步驟合成右旋糖苷包裹的氨基化的磁性納米顆粒。(2)將N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的熒光染料與透析好的氨基化的磁性納米顆?；靹驍嚢?，過柱純化后得到從而得到結(jié)合了熒光染料的磁性納米顆粒，(所述的熒光染料為Cy3, Cy5, Cy5. 5 或 Cy7 等)。(3)將上述磁納米顆粒通過N-羥基琥珀酰亞胺酯與一個商品化的連接劑N-琥珀酰胺-3- (2- 二硫哌啶)-丙酸酯(STOP)相連，過柱純化后將單克隆抗體通過巰基活化的哌啶二硫基團反應連接到SPDP連接劑上，過柱純化后得到進一步交聯(lián)了抗體的納米顆粒。(4)合成miRNA雙鏈核苷酸，并在有義鏈的5’端作硫代修飾，去保護后與上述得到的納米顆粒一起4 °C孵育過夜，最終得到可用于光學和磁共振成像的miRNA多功能磁性納米載體。本發(fā)明所述四氧化三鐵納米顆粒的平均粒徑大小為60-90 nm，磁飽和強度值為60-100 emu/g,表面 zeta 電位為 30-50 mV。一種microRNA多功能磁性納米載體在抗腫瘤及制備癌癥基因治療藥物中的應用。一種microRNA多功能磁性納米載體在實時監(jiān)測microRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和對腫瘤的治療效果中的應用。本發(fā)明所述miRNA多功能磁性納米顆?？梢宰鳛樵煊皠?，可以同時用于近紅外熒光成像和磁共振成像，應用于實時監(jiān)測納米顆粒體內(nèi)分布和腫瘤治療中的變化情況。本發(fā)明所述miRNA多功能磁性納米載體具有抑制腫瘤細胞生長的作用。以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。磁性氧化鐵納米顆粒的制備
分別稱取FeCl3X6H20 I. 17 g和FeCl2X4H20 0. 43 g (摩爾比為2:1)，右旋糖苷TlO2.5 g在充氮氣的環(huán)境下溶解于15 ml超純水中。用恒溫磁力攪拌器攪拌，同時緩慢滴加28%氨水，直至溶液pH值升至12，液體由黃綠色變成黑色，超聲分散3 min，然后在60 V恒溫水浴30 min ;所得產(chǎn)物冷卻后以12000 r/min離心15 min，棄去沉淀，保留上清液。將上清液用超聲探頭攪拌，再加入適量冰乙酸，至調(diào)節(jié)PH值至7. O.最后超純水稀釋100倍，放置透析袋過濾24 hr后，O. 22 _濾膜過濾，除去所有其他雜質(zhì)，純化產(chǎn)物。最終得到右旋糖苷包裹的氨基化的磁性納米顆粒(MN-NH2),分裝后滅菌，放置于4°C冰箱備用。熒光染料cy5. 5的交聯(lián)
調(diào)節(jié)磁性納米顆粒MN-NH2的pH值至9. 6，將I mg的Cy5. 5-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Amersham Biosciences 公司)溶解于 20 mmol /I,的朽1 樣酸納和 O. 15 mol/L 的 NaCl 的混合溶液中，并加入10 mg的磁性納米顆粒(MN-NH2),室溫下攪拌12小時后，過柱子G-25純化，去除沒有結(jié)合的Cy5. 5，從而得到結(jié)合了 Cy5. 5的磁性納米顆粒(MN_Cy5. 5)。單克隆抗體PSCA抗體的交聯(lián)
將上述產(chǎn)物磁納米顆粒(MN-Cy5. 5)與一個連接劑N-琥珀酰胺-3- (2- 二硫哌啶)-丙酸酯(STOP，Pierce公司)按照摩爾比1:4混合，在磷酸緩沖液中反應30 min，得到的產(chǎn)物在pH8. I的100 mmol/L磷酸鈉溶液中經(jīng)過G-25柱純化,然后將PSCA抗體(Santa Cruz公司)加入到上述PH8. I的100 mmol/L磷酸鈉溶液中，控制PSCA與SPDP的摩爾比為1:2，最終PSCA通過巰基活化的哌啶二硫基團反應連接到納米顆粒的2個SPDP連接劑上，過柱子G-25純化，得到交聯(lián)產(chǎn)物MN-Cy5. 5-PSCA。miRNA-16 的交聯(lián)
公司合成miRNA-16雙鏈核苷酸(上海吉碼)，并在有義鏈的5’端作硫代修飾以增強其穩(wěn)定性。在交聯(lián)之前，RNA先在3%的Tris-HCl中作去保護處理，并隨后作酒精沉淀濃縮。之后取 2 OD 的 miRNA-16 溶解于 50 mmol/L NaCl 和 10 mmol/L EDTA (PH 8)中，隨后加入上述交聯(lián)好的納米顆粒一起4度孵育過夜。最后通過G-50柱子純化得到的最終交聯(lián)產(chǎn)物MN-Cy5. 5-PSCA-miRNA-16。其結(jié)構(gòu)示意圖參見圖I。該多功能納米顆粒中，一分子的氧化鐵納米顆粒核心結(jié)合2分子的cy5. 5染料，2分子的PSCA抗體及2分子的miRNA-16.對本發(fā)明制備的磁性納米載體進行抗腫瘤細胞實驗
人前列腺癌細胞株PC-3在含有10%的胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，恒溫37° C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。^ 3X104 cell/cm2細胞接種到96孔板，貼壁生長24小時。加入不同濃度梯度的miRNA-16多功能納米顆粒組和陰性對照組，每組平行設立3個復孔，37° C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加入20 ul新配制的MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，去除上清液，每孔加入DMSO溶液150 ul，混勻后酶標儀檢測波長490 nm的吸光度值，計算腫瘤細胞存活率。細胞存活率(％)=(A實驗組/ A對照組)X100%。參見圖2，圖2為作用48小時后采用MTT法檢測的對腫瘤細胞生長的抑制效果。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，該發(fā)明的microRNA-16多功能納米顆粒在O IOOuM作用后，對人前列腺癌細胞PC-3的生長抑制作用明顯增強。
權利要求
1.一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體,其特征在于所述多功能磁性納米載體的活性成分為單克隆抗體、突光染料與microRNA轉(zhuǎn)運載體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權利要求I所述一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體的制備方法,其特征在于，所述的制備方法為首先制備右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒，然后將熒光染料與納米顆粒交聯(lián)，接著通過一個連接劑將特異性單克隆抗體連接到納米顆粒上，最后將microRNA也通過連接劑連接到納米顆粒上，最終得到可用于光學和磁共振成像的microRNA磁性納米載體。
3.根據(jù)權利要求2所述一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體的制備方法,其特征在于，所述的制備方法的包括以下具體步驟 (1)采用化學共沉淀法，加入摩爾比為2:1的FeCl3X6H20和FeCl2X4H20，以氨水為沉淀劑，右旋糖苷為表面活性劑，按照沉淀、陳化、純化、干燥的步驟合成右旋糖苷包裹的氨基化的磁性納米顆粒； (2)將N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的熒光染料與透析好的氨基化的磁性納米顆?；靹驍嚢?，過柱純化后得到結(jié)合了熒光染料的磁性納米顆粒； (3)將上述磁納米顆粒通過N-羥基琥珀酰亞胺酯與連接劑N-琥珀酰胺-3-(2- 二硫哌啶)-丙酸酯(STOP)相連，過柱純化后將單克隆抗體通過巰基活化的哌啶二硫基團反應連接到SPDP連接劑上，過柱純化后得到進一步交聯(lián)了抗體的納米顆粒； (4)合成microRNA雙鏈核苷酸，并在有義鏈的5’端作硫代修飾，去保護后與步驟(3)得到的納米顆粒一起4°C孵育過夜，最終得到可用于光學和磁共振成像的microRNA多功能磁性納米載體。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的氧化鐵磁性納米顆粒的平均粒徑為60-90 nm,磁飽和強度值為 60-100 emu/g,表面 zeta 電位 30-50 mV。
5.根據(jù)權利要求3所述的一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的熒光染料為Cy3，Cy5, Cy5. 5或Cy7。
6.根據(jù)權利要求2所述的一種microRNA多功能磁性納米載體在抗腫瘤及制備癌癥基因治療藥物中的應用。
7.根據(jù)權利要求2所述的一種microRNA多功能磁性納米載體在實時監(jiān)測microRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和對腫瘤的治療效果中的應用。
8.根據(jù)權利要求I所述的一種祀向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體,其特征在于所述microRNA轉(zhuǎn)運載體為右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向轉(zhuǎn)運microRNA的多功能磁性納米載體的制備方法及其應用。其制備方法包括以下步驟首先制備右旋糖苷包裹的氨基化的四氧化三鐵磁性納米顆粒，然后將熒光染料與納米顆粒交聯(lián)，接著通過一個連接劑將特異性單克隆抗體連接到納米顆粒上，最后將microRNA也通過連接劑連接到納米顆粒上，最終得到可用于光學和磁共振成像的microRNA磁性納米載體。本發(fā)明可通過單克隆抗體的特異性介導納米粒進入腫瘤細胞，所載的microRNA分子能夠抑制腫瘤細胞生長，具有抗腫瘤作用，同時由于磁性納米載體上修飾了熒光標記和磁性納米顆粒能夠作為磁共振成像技術的造影劑，故可利用近紅外熒光成像和磁共振成像相結(jié)合的雙模態(tài)成像技術實時監(jiān)測microRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和對腫瘤的治療效果。
文檔編號A61P35/00GK102631687SQ201210137549
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權日2012年5月7日
發(fā)明者張象涵, 梁繼民, 王福, 田捷, 詹勇華, 陳丹 申請人:西安電子科技大學