專利名稱：基于穿膜肽的口服復合納米載體及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體的說是利用穿膜肽和固體脂質納米粒構建一種新型口服復合納米載體。此復合納米載體的特征在于利用固體脂質納米粒在胃腸道內特殊的吸收途徑和穿膜肽的促吸收作用，有效解決口服難吸收藥物的吸收問題，提高藥物的口服生物利用度。
背景技術：
穿膜肽(cell-permeable peptides, CPPs)是一類具有較強細胞膜穿透能力的多肽，它們具有高效穿過細胞膜而不損傷細胞膜結構和功能的特點。多數(shù)研究證明穿膜肽在常規(guī)的用量范圍內基本沒有毒性。穿膜肽可以促進多肽、蛋白質等難吸收藥物在鼻腔粘膜、腸道粘膜、肺部給藥、皮膚給藥的吸收，從而使很多藥物和治療方法重獲新生。有研究證明， 采用長鏈脂肪酸對水溶性穿膜肽進行修飾，可以增加穿膜肽的兩親性，從而使其更容易插入到磷脂雙分子層中。此外，修飾后的穿膜肽細胞攝取能力會明顯增強。固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)系指以生物相容的高熔點脂質為骨架材料制成的納米球。SLN作為藥物傳遞系統(tǒng)載體，與常見的藥物載體相比具有生物相容性好、可生物降解、載藥能力強、物理化學存儲穩(wěn)定、對靶器官有特異趨向性、成本低和利于大規(guī)模生產等優(yōu)點，是一種具有發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)。研究表明，固體脂質納米粒作為口服藥用載體，可以在一定程度上改善難吸收藥物的口服吸收，但其主要經(jīng)Peyer結上的M細胞或胞飲作用轉運，吸收較為有限。常見的吸收促進劑連續(xù)使用會給粘膜造成直接損傷，使其臨床使用時受到了限制。因此急需開發(fā)一種既能有效的促進納米粒的口服吸收，又對胃腸道粘膜及其人體的生理功能造成最小傷害的口服納米粒載體。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的旨在提供一種脂質穿膜肽修飾固體脂質納米粒的新型口服復合納米載體及其制備方法和用途。所述的復合納米載體，其特征在于它含有難吸收藥物、固體脂質材料、穩(wěn)定劑和脂質穿膜肽。所述的復合納米載體，其特征在于按質量比它含有0. I 30%的難吸收藥物，10 98%的固體脂質材料，0. I 60%的穩(wěn)定劑，0. 01 25%的脂質穿膜肽，0 20%抗氧化劑，0 95%凍干支撐劑，0 95%的水。所述的復合納米載體，其特征在于所述的難吸收藥物包括下列的一種或多種紫杉醇、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、長春新堿、9-羥基喜樹堿、藤黃酸。所述的復合納米載體，其特征在于所述的固體脂質材料選自各種長鏈脂肪酸以及脂肪酸的甘油酯的一種或多種。所述的復合納米載體，其特征在于所述的穩(wěn)定劑是磷脂和(或)表面活性劑，磷脂選自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂的一種或多種，表明活性劑選自泊洛沙姆188和吐溫80的一種或兩種。所述的復合納米載體,其特征在于所述的脂質穿膜肽為精氨酸(Arginine, R)的直鏈聚合物Rn(n = 5 16)，它們的N端被脂肪酸修飾，脂肪酸優(yōu)選碳鏈為8 20碳原子的，更優(yōu)選的硬脂酸(Stearic Acid, SA)。所述的復合納米載體，其特征在于可以制備難吸收藥物的口服藥物制劑。有益成果當制備的復合納米載體口服后，首先帶正電荷的納米?？梢晕綆ж撾姷奈改c道表面，增加納米粒的局部濃度，其次脂質穿膜肽可以抑制P-糖蛋白的外排作用，從而促進納米?？诜?，提高藥物口服生物利用度。


圖I為市售制劑(Taxol)大鼠口服給藥后的血藥濃度-時間曲線(n = 6)。 圖2為紫杉醇固體脂質納米粒(PTX-SLN)大鼠口服給藥后的血藥濃度-時間曲線(n = 6)。圖3為SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒(SA-R8-PTX-SLN)大鼠口服給藥后的血藥濃度-時間曲線(n = 6)。以下通過非限定性實施例進一步詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍，不局限于此。
具體實施例方式下列實施例中R為精氨酸，SA為硬脂酸實施例I :穿膜肽修飾9-羥基喜樹堿固體脂質納米粒(I)穿膜肽的合成采用固相合成法合成SA-R9，具體過程如下在50ml側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入Ig Rinkamide-MBHA樹脂(0. 74mmol. g—1)，加20mL DMF溶脹lOmin，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20 % U啶/DMF溶液，攪拌30min，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入I. 44g(2. 22mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0.46g(2. 22mmol) 二環(huán)己基碳二亞胺和0. 30g(2. 22mmol) HOBt (I-羥基苯并三唑)和20mlDMF,室溫攪拌進行縮合反應。反應2h后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾,用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸己聯(lián)接于樹脂上。后面接著聯(lián)接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Fmoc_Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH,Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH。最后樹脂用甲醇洗第三次,真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50ml圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (v/v))，室溫下攪拌3h。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到SA-RRRRRRRRR粗肽。將IOOmg上述的SA-RRRRRRRRR粗肽溶于2ml純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經(jīng)旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得SA-RRRRRRRRR純肽。質譜分析表明，其分子量為1699，與理論值相符。最終得N端被硬脂酸修飾的RRRRRRRRR(SA-R9)。(2)固體脂質納米粒制備精密稱取15mg 9-輕基喜樹堿、200mg山箭酸甘油酯、IOOmg卵磷脂置于500mL爺型瓶，加入一定量氯仿振搖溶解，真空旋蒸除去氯仿形成含藥薄膜，抽真空過夜除去痕量有機溶劑；稱取50mg泊洛沙姆188至IOmL蒸餾水中形成水相；將水相加入到茄型瓶中水化成均勻乳池液，探頭超聲，得到9-輕基喜樹堿固體脂質納米粒粗品，離心(2000rpm, IOmin)除去少量金屬屑，過0. 8 y m濾膜三次，整粒，得9-羥基喜樹堿固體脂質納米粒分散液。精確移取5mL 9_羥基喜樹堿固體脂質納米粒分散液，加入7. 5mg SA-R9，磁力攪拌過夜(4°C，12h)，得到脂質穿膜肽SA-R9和9-羥基喜樹堿固體脂質納米粒的復合納米載體。該復合納米載體的平均粒徑為168. 3nm,多分散系數(shù)PDI為0. 174，zeta電位為21. 5mV,·9-羥基喜樹堿的包封率為93. 74%。以5%蔗糖為凍干保護劑，將上述復合納米載體制備成凍干粉保存，使用時用蒸餾水復溶使用。實施例2 :穿膜肽修飾紫杉醇固體脂質納米粒(I)穿膜肽的合成采用固相合成法合成SA-R8,具體過程如下在50ml側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入Ig Rinkamide-MBHA樹脂(0. ，加20mL DMF溶脹lOmin，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20 % U啶/DMF溶液，攪拌30min，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入I. 44g(2. 22mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)、0.46g(2. 22mmol) 二環(huán)己基碳二亞胺和0. 30g(2. 22mmol) HOBt (I-羥基苯并三唑)和20mlDMF,室溫攪拌進行縮合反應。反應2h后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾,用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸己聯(lián)接于樹脂上。后面接著聯(lián)接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Fmoc_Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50ml圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (v/v))，室溫下攪拌3h。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到SA-RRRRRRRR粗肽。將IOOmg上述的SA-RRRRRRRR粗肽溶于2ml純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經(jīng)旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得SA-RRRRRRR純肽。質譜分析表明，其分子量為1543，與理論值相符。最終得N端被硬脂酸修飾的RRRRRRRR(SA-R8)。
(2)固體脂質納米粒制備精密稱取IOmg紫杉醇、225mg單硬脂酸甘油酯、225mg大豆磷脂置于500mL茄型瓶，加入一定量氯仿振搖溶解,真空旋蒸除去氯仿形成含藥薄膜,抽真空過夜除去痕量有機溶劑；稱取IOOmg泊洛沙姆188和IOOmg吐溫80至IOmL蒸餾水中形成水相；將水相加入到茄型瓶中水化成均勻乳濁液，探頭超聲，得到紫杉醇固體脂質納米粒粗品，離心(2000rpm，IOmin)除去少量金屬屑，過0. 8 ii m濾膜三次,整粒,得紫杉醇固體脂質納米粒分散液。精確移取5mL紫杉醇固體脂質納米粒分散液，加入IOmg SA-R8,磁力攪拌過夜，得到脂質穿膜肽SA-R8和紫杉醇固體脂質納米粒的復合納米載體。該復合納米載體的平均粒徑為217. lnm，多分散系數(shù)I3DI為0. 280, zeta電位為34. 3mV，紫杉醇的包封率為91. 70%。以10%蔗糖為凍干保護劑，將上述復合納米載體制備成凍干粉保存，使用時用蒸餾水復溶使用。(3)大鼠藥動學實驗18只SD雄性大鼠，體重(200 ±20) g，隨機分為三組，作為受試動物。服藥前禁食12小時，自由飲水。給藥方案其中參比制劑為市售制劑(Taxol)，受試制劑為自制的紫杉醇固體脂質納米粒(PTX-SLN)和SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒(SA-R8-PTX-SLN), 口服給藥(20mg/kg)。市售制劑(Taxol)、紫杉醇固體脂質納米粒和SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米?？诜o藥后分別于 0. 25,0. 5,0. 75、l、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48h，眼底取血 0. 4mL置肝素抗凝塑料離心管中，6000rpm離心IOmin,取0. 15mL上層血衆(zhòng),備用。市售制劑(Taxol)大鼠口服給藥后的血藥濃度_時間曲線見圖I。紫杉醇固體脂質納米粒(PTX-SLN)大鼠口服給藥后的血藥濃度-時間曲線見圖2。SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒(SA-R8-PTX-SLN)大鼠口服給藥后的血藥濃度-時間曲線見圖3。由圖I、圖2和圖3可見，市售制劑(Taxol)和紫杉醇固體脂質納米?？诜o藥后，分別在4h和12h后血藥濃度已在檢測限以下，SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒在36h仍在檢測限以上。表ITaxol、PTX-SLN 和 SA-R8-PTX-SLN 的大鼠口服藥動學參數(shù)(n = 6)
ParameterUnitTaxolPTX-SLNSA-R8-PTX-SLN
^tg mL'10.74士0.200.73±0.041.42士0.22*
Tmaxh1.33 士0.580.92±0.140.83士 0.14
AUQm Hg h mL11.32±0.214.43±0.35*12.76士2.75*
AUCo-CO HghmL'11.47±0.174.84±0.22*17.08士 6.68*
MRTh2.26±0.325.89±0.48*25.82±12.37*
CLmLh"12743.1±312.4 827.07±39.02*229.73±132.53*注*P< 0. 05，與 Taxol 比較。采用非房室模型計算市售制劑(Taxol)、紫杉醇固體脂質納米粒和SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒大鼠口服給藥后的藥動學參數(shù)，結果見表I。根據(jù)市售制劑(Taxol)、紫杉醇固體脂質納米粒和SA-R8修飾紫杉醇固體脂質納米粒大鼠口服給藥后血藥濃度-時間曲線下面積(AUCVt)，以市售制劑(Taxol)為參比，計算紫杉醇固體脂質納米粒(PTX-SLN)和SA-R8修 飾紫杉醇固體脂質納米粒(SA-R8-PTX-SLN)的相對生物利用度，PTX-SLN和SA-R8-PTX-SLN的相對生物利用度分別提高了 2. 35倍和8. 67倍。
權利要求
1.一種新型的口服復合納米載體，其特征在于它含有難吸收藥物、固體脂質材料、穩(wěn)定劑和脂質穿膜肽。
2.根據(jù)權利要求I所述的復合納米載體，其特征在于按質量比它含有0.I 30%的難吸收藥物，10 98%的固體脂質材料，0. I 60%的穩(wěn)定劑，0. 01 25%的脂質穿膜肽，0 20%抗氧化劑，0 95%凍干支撐劑，0 95%的水。
3.根據(jù)權利要求I和權利要求2所述的復合納米載體，其特征在于所述的難吸收藥物包括下列的一種或多種紫杉醇、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、長春新堿、9-羥基喜樹堿、藤黃酸。
4.根據(jù)權利要求I和權利要求2所述的復合納米載體，其特征在于所述的固體脂質材料選自各種長鏈脂肪酸以及脂肪酸的甘油酯的一種或多種。
5.根據(jù)權利要求I和權利要求2所述的復合納米載體，其特征在于所述的穩(wěn)定劑是磷脂和(或)表面活性劑，磷脂選自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂的一種或多種，表明活性劑選自泊洛沙姆188和吐溫80的一種或兩種。
6.根據(jù)權利要求I和權利要求2所述的復合納米載體，其特征在于所述的脂質穿膜肽為精氨酸(Arginine, R)的直鏈聚合物Rn(n = 5 16),它們的N端被脂肪酸修飾,脂肪酸優(yōu)選碳鏈為8 20碳原子的,更優(yōu)選的硬脂酸(StearicAcid, SA)。
7.根據(jù)權利要求I和權利要求2所述的復合納米載體，其特征在于可以制備難吸收藥物的口服藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂質穿膜肽和固體脂質納米粒構建的新型口服復合納米載體及其制備方法和用途。通過薄膜分散-超聲法制備載藥的固體脂質納米粒，然后采用穿膜肽和載藥固體脂質納米粒共孵育的方法，構建的新型口服復合納米載體。所述的復合納米載體利用固體脂質納米粒的在胃腸道內特殊的吸收途徑和穿膜肽的促吸收作用，有效解決口服難吸收藥物的吸收問題，提高藥物的口服生物利用度。
文檔編號A61K9/14GK102743338SQ20121014110
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權日2012年5月9日
發(fā)明者呂慧俠, 周建平, 姜天玥, 孫博, 張振海, 張銀龍 申請人:中國藥科大學