專利名稱：姜黃素-多糖類偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
姜黃素(curcumin)是從姜科植物的根莖中提取的一種黃酮類藥物，可溶于甲醇、乙醇、醋酸、丙酮和氯仿等有機溶劑和堿水中，而在中性至酸性水溶液中溶解度極低。姜黃素來源廣泛，價格低廉，高效低毒，具有著極大的藥用研究價值。除了具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物以及對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面藥理作用外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可能通過多種機制(下調(diào)MDRl、survivinmRNA表達和P_gp、survivin蛋白的表達，促進腫瘤細胞凋亡等)逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。另有文獻報道，姜黃素與其它藥物聯(lián)用時，能起到促進藥物吸收、提高療效、降低該藥物毒副作用等效果。如姜黃素與紫杉醇協(xié)同可抑制人卵巢癌細胞系OC3的增殖，二者聯(lián)合化療有增效減毒作用(劉冠嬡等， 紫杉醇和姜黃素聯(lián)用對人卵巢癌細胞系OC3的抑制作用，山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，42 (3)，325-328);姜黃素也可以通過上調(diào)HO-1的表達，降低bFGF的表達來發(fā)揮對環(huán)孢素A腎毒性的保護作用(劉慎微，付艷紅，姜黃素對大鼠環(huán)孢素A腎毒性的防治作用，中國藥師，2007，05，39-41)。在體外實驗中，用1、5、10 μ M姜黃素處理KB-Vl細胞(耐藥人宮頸癌細胞株)72h后，Western blot和RT-PCR分析結(jié)果顯示姜黃素能明顯降低細胞膜上的表達，并發(fā)現(xiàn)姜黃素處理組中P-糖蛋白底物羅丹明123在細胞內(nèi)的蓄積增加以及其外排減少，進一步證實姜黃素可抑制P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運功能。在SGC7901/VCR、K562/A02中發(fā)現(xiàn)姜黃素亦能調(diào)節(jié)P-糖蛋白的表達和功能，即下調(diào)P-糖蛋白的表達和抑制其功能，導(dǎo)致化療藥物在細胞內(nèi)的濃度增高，而證實姜黃素能逆轉(zhuǎn)多種腫瘤耐藥細胞的耐藥性，并呈濃度依賴性。何鑫等探討了姜黃素對P-糖蛋白底物他林洛爾人體藥物代謝動力學(xué)的影響及其與P-糖蛋白編碼基因MDRl基因多態(tài)性的關(guān)系，證實口服姜黃素能明顯促進他林洛爾的吸收，抑制他林洛爾的排泄，推測姜黃素對人體內(nèi)轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白具有抑制作用，且姜黃素對人體轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白的抑制與MDRl基因型無關(guān)(何鑫等，姜黃素對P-糖蛋白底物他林洛爾人體藥物代謝動力學(xué)的影響及其與P-糖蛋白編碼基因MDRl基因多態(tài)性的關(guān)系，Herald of Medicine,2007,26,144-145)。由于姜黃素本身結(jié)構(gòu)上具有多個活潑基團(如β_二酮結(jié)構(gòu))，導(dǎo)致其體內(nèi)外穩(wěn)定性均不佳，生物利用度很低。姜黃素對pH、溫度、濕度、光照均敏感，對姜黃素體內(nèi)外穩(wěn)定性及其生物轉(zhuǎn)化或降解產(chǎn)物的研究較多，結(jié)果也不盡相同。體外研究普遍認為姜黃素的降解產(chǎn)物主要為阿魏酸和阿魏酰甲烷，其降解反應(yīng)為一級動力學(xué)過程；姜黃素在PH 5 6下穩(wěn)定性較好，pH升高使其降解速度增加，而pH<5時雖然姜黃素比較穩(wěn)定，但溶解度很低，關(guān)于PH值對姜黃素穩(wěn)定性的影響的相關(guān)文獻報道較為混亂，不同的實驗條件及緩沖鹽體系對其t1/2值均有較大影響；姜黃素光敏性較強，室內(nèi)光線對其影響較小，但室外光照條件下會迅速降解，應(yīng)避光保存；部分表面活性劑(如SDS)能提高姜黃素的穩(wěn)定性，而亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉等抗氧劑則大大加快了姜黃素的降解速度。姜黃素的口服生物利用度低，大鼠口服給藥劑量為O.1 Ig · kg4時，P max均低于I μ g · mL—1，而在人身上進行實驗時，盡管口服藥物量高達12g，其P max也僅僅為50ng · mL—1左右。姜黃素口服后在腸道可生物轉(zhuǎn)化為葡糖苷醛酸和磺酸復(fù)合物，但其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的比例尚未明確。針對以上問題，有必要對姜黃素其進行結(jié)構(gòu)修飾以便提高其穩(wěn)定性和溶解度。席夫堿是指含有亞甲氨基(-RC = N-)的化合物，該類化合物可由活潑的羰基化合物與伯胺發(fā)生縮合反應(yīng)制得，具有結(jié)構(gòu)簡單，易于反應(yīng)等特點。且文獻報道氨基酸、縮氨脲、縮胺以及腙等類的SchifT堿及其衍生物與金屬形成的配合物具有抑菌、殺菌、抗腫瘤、抗病毒等多方面的生物活性。迄今席夫堿的合成不僅僅限于醛和簡單的胺，而逐步引入了各種具有生物功能的官能團，涉及到的活潑的羰基化合物及含有氨基(-NH2)的化合物越來越廣泛。
多糖是所有生命機體的重要組成部分，它是由單糖聚合成的線性或分支的聚合物，包括糖原、淀粉、氨基聚糖(如透明質(zhì)酸)和纖維素等。多糖具有優(yōu)良的生物相容性、易在生物體內(nèi)被吸收代謝，此外由于多糖主鏈結(jié)構(gòu)上存在大量的活性基團(如羧基和氨基等)，可以通過化學(xué)修飾改善其理化性質(zhì)。多糖高分子材料因其優(yōu)良的生物活性在藥物制劑領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。多糖-藥物偶聯(lián)物是指把小分子藥物通過共價鍵鏈接在多糖高分子載體上，作為側(cè)基的一部分。多糖-藥物偶聯(lián)物的優(yōu)點如下(I)對小分子藥物而言，能增加藥物的作用時間、提高藥物的選擇性、降低藥物的毒性、提高疏水性藥物溶解度等。(2)對多糖高分子而言，可以通過合理的化學(xué)修飾優(yōu)化其生物特性，以發(fā)揮更好的療效。如在透明質(zhì)酸分子上引入疏水基團可改善其易溶于水、吸收迅速和在組織中停留時間短等不足；在殼聚糖分子上接枝甘草次酸可以增加其肝靶向性等。兩親性聚合物在聚合物濃度超過臨界膠束濃度(CMC)后可自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系的聚合物膠束，大小在幾十到幾百納米范圍內(nèi)。通過對多糖骨架進行化學(xué)修飾得到的兩親性多糖類偶聯(lián)物作為難溶性藥物的載體，口服給藥時，有助于減少藥物對胃腸道的刺激性，增加吸收部位的藥物濃度，提高藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性，再加上膠束粒徑較小，可以通過EPR效應(yīng)和內(nèi)吞作用進入細胞，從而提高了疏水性藥物的口服生物利用度；注射給藥時，有助于避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的識別，延長體循環(huán)時間，也可偶聯(lián)靶向配體，實現(xiàn)藥物定位傳遞。藥物的吸收是指藥物從給藥部位向血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運的過程，主要是通過胃腸道以及肺泡、皮膚、鼻粘膜和角膜等部位的上皮細胞進行的，藥物的溶解性、解離度、溶出度、粘膜透過性、首過效應(yīng)以及胃腸道的生理因素等均對藥物的口服吸收有一定影響。為提高口服藥物的生物利用度而進行的吸收促進劑研究，是藥物制劑研究的熱點。促進劑的促吸收機理比較復(fù)雜，雖然口服吸收促進劑的研究已較為深入，但臨床應(yīng)用還在初級階段。傳統(tǒng)的吸收促進劑如各種表面活性劑(SDS、膽鹽、脂肪酸等)、氨基酸衍生物、螯合劑、環(huán)糊精等本身可能對人體存在不良反應(yīng)。秉承著“安全、高效”的選用原則，姜黃素和多糖在吸收促進劑研究領(lǐng)域都顯示了一定的應(yīng)用前景。綜上所述，本專利通過二胺類物質(zhì)為連接臂，其中一端氨基通過酰胺反應(yīng)與多糖上的羧基結(jié)合，另一端氨基通過簡單的希夫堿反應(yīng)將黃酮類藥物姜黃素接枝到多糖骨架上，生成優(yōu)良的高分子-藥物偶聯(lián)物，由于姜黃素為疏水性藥物，大大增強了多糖的兩親性，該偶聯(lián)物可在水性環(huán)境形成穩(wěn)定的膠束，具有以下特征(I)姜黃素與親水性多糖偶聯(lián)后，可明顯增加姜黃素的溶解度。(2)該偶聯(lián)物在水溶液中可自組裝形成納米膠束，增加了姜黃素在水性介質(zhì)中的穩(wěn)定性。(3)該偶聯(lián)物可添加至藥學(xué)活性或藥理活性分子或其制劑中，以促進其口服吸收，達到更好的治療效果。且利用姜黃素-多糖類偶聯(lián)物作為口服吸收促進劑的研究國內(nèi)外均未見文獻與專利報導(dǎo)。(4)該偶聯(lián)物也可以單獨用作高分子新藥，發(fā)揮抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多方面藥理作用。(5)該偶聯(lián)物還可用作注射、口服給藥的藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體，提高療效、降低該藥物毒副作用。由于姜黃素與多糖通過具有PH敏感的亞胺鍵連接，偶聯(lián)物在中性pH條件下穩(wěn)定，在酸性條件下易水解還原為姜黃素和多糖。而腫瘤細胞內(nèi)含體和溶酶體的酸堿度(pH 5 6)要明顯低于細胞外酸堿度(pH
6.2 6. 8)，因此當使用姜黃素-多糖類偶聯(lián)物包載抗腫瘤藥物可增加腫瘤靶向性，發(fā)揮減毒增效的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，通過二胺類連接臂將姜黃素接枝到大分子多糖上，一方面能夠改善姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性，同時增強了多糖的生物活性，得到相互增效的希夫堿衍生物，該偶聯(lián)物可以用作高分子新藥，也可用作其他具有藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑，還可用作注射或口服給藥的藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體。本發(fā)明使姜黃素和多糖的應(yīng)用具有更廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。本發(fā)明的另一個目的是提供上述偶聯(lián)物的制備方法。本發(fā)明還有另一個目的是提供上述偶聯(lián)物在制藥中的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明提供一種新型姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物是在多糖分子的羧基或經(jīng)過衍生化形成的羧基上，通過二胺類化合物為連接臂，引入姜黃素，所形成的藥物-多糖類偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)改善了姜黃素的穩(wěn)定性和溶解性。由于在親水性的多糖骨架上引入了疏水基團，增強了其兩親性，故該偶聯(lián)物能在水性介質(zhì)中自組裝為穩(wěn)定的納米膠束，不僅可以單獨用作大分子新藥，也可用作難溶性藥物的增溶載體或吸收促進劑，提高藥 物的生物利用度。所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，選自未分級肝素；低分子量肝素；脫硫酸化肝素；透明質(zhì)酸；軟骨素；多硫酸化軟骨素；海藻酸；羧基化殼聚糖及其衍生物包括羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-0，N-羧甲基殼聚糖；羧基化葡聚糖及其衍生物羧甲基葡聚糖；羧基化葡聚糖及其衍生物羧甲基香菇多糖。所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法，包括下列步驟將上述多糖溶于適當溶劑中，采用二胺類化合物為連接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑進行縮合反應(yīng)，得到游離一端氨基的多糖活性中間體；將姜黃素與得到的活性中間體通過希夫堿反應(yīng)生成姜黃素-多糖類偶聯(lián)物。所述的制備方法，其中適當溶劑選自水、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜或上述的混合溶劑。所述的制備方法，其中連接臂為對苯二胺、間苯二胺、鄰苯二胺、胱胺、碳原子數(shù)2 12的亞烷基二胺。所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，可單獨用作高分子新藥，也可用作藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑，還可用作注射或口服給藥的藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體。所述藥學(xué)活性或藥理活性分子選自紫杉烷類、喜樹堿類、黃酮類、長春新堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類、阿霉素類、維A酸類、環(huán)孢素類、二氫吡啶類、小蘗堿類抗腫瘤藥物、留體類或非甾體類抗炎藥物、心血管藥物、抗生素、抗真菌藥物、抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑中的任一物質(zhì)或其衍生物。該姜黃素-多糖類偶聯(lián)物制備載藥納米膠束的方法操作步驟如下姜黃素-多糖類偶聯(lián)物與水按重量比為3 50 1000的比例溶解，得到多糖類偶聯(lián)物納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機藥物用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后，與所述多糖類偶聯(lián)物納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑和小分子，凍干制得粒徑為10 IOOOnm的納米膠束。
該姜黃素-多糖類偶聯(lián)物在制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑的質(zhì)量濃度為O.1 90%，優(yōu)選為O.1 35%。具體方案如下在多糖分子鏈上引入疏水基團姜黃素，使其具有兩親性，在水介質(zhì)中可自組裝成納米膠束，相對疏水的姜黃素聚集成內(nèi)核，多糖分子親水鏈形成高度親水性外殼，具有穩(wěn)定膠束、有效躲避生物體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉和蛋白質(zhì)吸附的作用。因此這類姜黃素-多糖類偶聯(lián)物既是難溶藥物的優(yōu)良載體，又是一種良好的高分子前體藥物，還可用作其他藥學(xué)活性或藥理活性分子的吸收促進劑。該偶聯(lián)物可用于注射或口服給藥。該偶聯(lián)物作為藥物載體，粒徑在10 IOOOnm可控，表面光滑，均勻度好，再分散性好，載藥量和包封率高。該偶聯(lián)物作為口服吸收促進劑，水溶性好，毒副作用小，生物相容性好，具有明顯的促進藥物吸收的效果。姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的合成、膠束制備方法及作為口服吸收促進劑制備方法詳細說明如下一、姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的合成1、多糖活性中間體的制備將多糖溶于適當溶劑中，采用二胺類化合物為連接臂，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑進行縮合反應(yīng)，反應(yīng)時間為4 12h，室溫反應(yīng)至完全，反應(yīng)終止后加入丙酮沉淀產(chǎn)物，抽濾得沉淀，加水復(fù)溶，透析2 3d，冷凍干燥得到游離一端氨基的多糖活性中間體。合成路線見圖1。在上述多糖活性中間體的制備方法中，所述溶劑優(yōu)選為水、N, N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜或上述的混合溶劑；若多糖本身含有NH2，則為避免發(fā)生內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)，需將多糖與過量的二胺類化合物混合均勻后再加入EDC與NHS ;所述多糖、二胺類化合物、EDC、NHS的摩爾比優(yōu)選為1: 2 20 I 5 I 5。2、姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的合成方法1:將姜黃素溶于適當有機溶劑中，直接加入上述多糖活性中間體粉末，加少量催化劑催化，避光條件下，超聲回流2 12h，抽濾，濾餅用有機溶劑反復(fù)洗滌至濾液無色，以除去未反應(yīng)的姜黃素及其降解產(chǎn)物，烘干，得橙黃色固體。方法2 :將姜黃素和多糖活性中間體分別溶于適當混合溶劑中，避光、磁力攪拌、加熱條件下緩慢向多糖活性中間體溶液中滴加姜黃素，滴加時間為O. 5 6h，滴加終止后繼續(xù)反應(yīng)I 12h，反復(fù)過濾除去不溶性雜質(zhì)，于PBS緩沖液中透析6 24h，離心取上清液，凍干得橙黃色產(chǎn)物。方法I和方法2的合成路線見圖2，在上述姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法中方法I所述反應(yīng)溶劑優(yōu)選為甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲酰胺；所述的催化劑選自醋酸、鹽酸，調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH至酸性；方法I中，本應(yīng)將反應(yīng)粗產(chǎn)物以甲醇或乙醇為溶劑，在索氏提取器中加熱回流一定時間以充分除去未反應(yīng)的過量姜黃素。由于姜黃素穩(wěn)定性差，易降解，且具有熒光顯色特征，故將除雜過程優(yōu)選為反復(fù)洗滌產(chǎn)物至取濾液點板，熒光下不顯色；所述的用于洗滌的有機溶劑為無水甲醇、無水乙醇、無水乙醚、二氯甲烷中的一種或多種；所述多糖中間體和姜黃素的摩爾比優(yōu)選為I I 10;更優(yōu)選為1: 3 5。方法2所述反應(yīng)溶劑優(yōu)選為水和甲醇、水和乙醇、水和二氯甲烷或水和甲酰胺的混合溶劑；所述的PBS緩沖液pH范圍優(yōu)選為5. 5 7. 4 ;多糖中間體和姜黃素的摩爾比優(yōu)選為1:1 10，更優(yōu)選為1: 3 5。 二、姜黃素-多糖類偶聯(lián)物膠束的制備方法按每Iml水中溶解3 30mg的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的比例，將制得的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物溶于水中，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，制備成粒徑為10 IOOOnm的多糖類偶聯(lián)物膠束。三、以姜黃素-多糖類偶聯(lián)物作為載體制備含難溶性藥物的膠束姜黃素-多糖類偶聯(lián)物溶于水，將難溶性藥物如紫杉醇用適當溶劑溶解，與姜黃素-多糖類偶聯(lián)物水溶液混合，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，通過透析或超濾等方法出去有機溶劑及小分子，制得粒徑為10 IOOOnm的納米膠束。所謂適當溶劑，指藥學(xué)上使用的能溶解該藥物的溶劑。四、姜黃素-多糖類偶聯(lián)物作為口服吸收促進劑的制備方法避光條件下，將姜黃素-多糖類偶聯(lián)物與上述藥學(xué)活性或藥理活性分子或其制劑均勻混合，所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物在制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑的應(yīng)用中的質(zhì)量濃度為O.1 90%，優(yōu)選為O.1 35%。本發(fā)明的有益效果一、本發(fā)明以亞烷基二胺、對苯二胺、間苯二胺、鄰苯二胺或胱胺為連接臂，將黃酮類藥物姜黃素接枝到大分子羧基多糖上，不僅增加了多糖骨架的藥理活性，而且大大提高了疏水性藥物姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性，生成的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物有望成為一種高分子新藥、難溶性藥物的載體或其他藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑，合成條件溫和，反應(yīng)簡單，原料成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。二、本發(fā)明提供的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，不僅具有多糖分子良好的生物學(xué)特性，還能更好發(fā)揮姜黃素抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制P-糖蛋白活性、降低其他藥物毒副作用等功效。三、本發(fā)明提供的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物作為口服吸收促進劑具有生物可降解性和組織相容性好、價廉易得、無生物毒性等優(yōu)點。本發(fā)明提供的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物可用于口服或注射給藥，具有高度安全性，粒徑可控制在10 lOOOnm。


圖1 :多糖活性中間體的合成路線圖2 :姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的合成路線(R1-COOH為多糖，NH2-R2-NH2為亞烷基二胺、對苯二胺、間苯二胺、鄰苯二胺、胱胺)圖3:季銨化羧甲基殼聚糖-姜黃素偶聯(lián)物的粒徑圖譜圖4:姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的穩(wěn)定性考察圖5:姜黃素-羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物與簡單混合產(chǎn)物的穩(wěn)定性考察
圖6:包載抗腫瘤藥物的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的抗腫瘤活性考察(MTT法)圖7:包載紫杉醇的姜黃素-羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物與簡單混合產(chǎn)物的抗腫瘤活性考察(MTT法)圖8 :姜黃素-多糖類偶聯(lián)物對環(huán)孢素A的在體腸吸收的影響
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明加以進一步的說明，但下述實施例并不限制本專利的權(quán)利范圍。實施例1姜黃素-羧甲基殼聚糖的合成取O.1mol羧甲基殼聚糖加入IOml水中，磁力攪拌30min至完全溶解,用醋酸調(diào)節(jié)PH至6 7左右，再加入O. 5mol對苯二胺，混合均勻后再滴加O. 2moll-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和O. 3mol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)8h，透析2d，冷凍干燥得游離一端氨基的羧甲基殼聚糖中間體。取上述中間體分散于30ml甲醇中，加入O. 3mol姜黃素的甲醇溶液，超聲回流反應(yīng)2h，所得粗產(chǎn)物用無水乙醇、無水乙醚、二氯甲烷反復(fù)洗滌至濾液無色，真空干燥得純化后的姜黃素-羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物。實施例2姜黃素-肝素的合成取2mmol肝素溶于甲酰胺中，加入8mmol乙二胺，磁力攪拌2min,再加入3mmoll-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和4. 5mmol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮沉淀產(chǎn)物，抽濾得沉淀，加水復(fù)溶，透析2d，冷凍凍干得到游離一端氨基的肝素活性中間體。取上述所得肝素活性中間體溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50°C磁力攪拌下，緩慢滴加6mmol的姜黃素的甲醇溶液，滴加時間為1.5h，滴完后繼續(xù)反應(yīng)2h，取產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去甲醇，加少量水混勻后抽濾，除去未反應(yīng)的姜黃素及其降解產(chǎn)物，取濾液，3000r/min離心IOmin后取上清液，避光條件下于PBS緩沖液(pH = 6. 8)中透析8h，小心移取透析袋內(nèi)澄清液，凍干得最終產(chǎn)物姜黃素-肝素偶聯(lián)物。實施例3姜黃素-透明質(zhì)酸的合成取3mmol透明質(zhì)酸溶于四氫呋喃中，加入IOmmol間苯二胺,磁力攪拌5min,再加入4. 5mmoll-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和6mmol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮沉淀產(chǎn)物，抽濾得沉淀，加水復(fù)溶，透析2d，冷凍凍干得到游離一端氨基的透明質(zhì)酸活性中間體。取上述所得透明質(zhì)酸活性中間體溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50°C磁力攪拌下，緩慢滴加9mmol的姜黃素的甲醇溶液，滴加時間為2h，滴完后繼續(xù)反應(yīng)lh，取產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去甲醇，加少量水混勻后抽濾，除去未反應(yīng)的姜黃素及其降解產(chǎn)物，取濾液，3000r/min離心IOmin后取上清液，避光條件下于PBS緩沖液(pH =7.4)中透析6h，小心移取透析袋內(nèi)澄清液，凍干得最終產(chǎn)物姜黃素-透明質(zhì)酸偶聯(lián)物。實施例4姜黃素-羧甲基香菇多糖的合成取O. 2mol羧甲基香燕多糖加入15ml水中，磁力攪拌15min至完全溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)PH至5. 5左右，再加入Imol鄰苯二胺，混合均勻后再加入O. 2moll-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和O. 45mmol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)6h，透析2d，冷凍干燥得游離一端氨基的羧甲基香菇多糖中間體。取上述中間體分散于適量甲醇中，加入O. Smol的姜黃素的甲醇溶液，超聲回流反應(yīng)3h，粗產(chǎn)物用無水乙醇、無水乙醚、二氯甲烷反復(fù)洗滌至濾液無色，真空干燥得純化后的姜黃素-羧甲基香菇多糖類偶聯(lián)物。實施例5姜黃素-羧甲基葡聚糖的合成取O. 2mol羧甲基葡聚糖加入15ml水中，磁力攪拌30min至完全溶解,用醋酸調(diào)節(jié)PH至6 7左右，再加入O. 6mol丙二胺，混合均勻后再加入O. 2moll-乙基_ (3- 二甲基氨
基丙基)碳二亞胺(EDC)和O. 3mol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)12h，透析2d，冷凍干燥得游離一端氨基的羧甲基葡聚糖中間體。取上述中間體分散于適量甲醇中，加入O. 9mol的姜黃素的甲醇溶液，超聲回流反應(yīng)2. 5h，粗產(chǎn)物用無水甲醇、無水乙醚、二氯甲烷反復(fù)洗滌至濾液無色，真空干燥得純化后的姜黃素-羧甲基葡聚糖偶聯(lián)物。實施例6姜黃素-軟骨素的合成取2mmol軟骨素溶于甲酰胺中，加入8mmol胱胺，磁力攪拌2min,再加入3mmoll-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和4. 5mmol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮沉淀產(chǎn)物，抽濾得沉淀，加水復(fù)溶，透析2d，冷凍凍干得到游離一端氨基的軟骨素分子。取上述所得軟骨素活性中間體溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50°C磁力攪拌下，緩慢滴加6mmol的姜黃素的甲醇溶液，滴加時間為lh，滴完后繼續(xù)反應(yīng)5h，取產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去甲醇，加少量水混勻后抽濾，除去未反應(yīng)的姜黃素及其降解產(chǎn)物，取濾液，3000v離心IOmin后取上清液，避光條件下于PBS緩沖液(pH = 6. 8)中透析6h，小心移取透析袋內(nèi)澄清液，凍干得最終產(chǎn)物姜黃素-軟骨素偶聯(lián)物。實施例7姜黃素-海藻酸的合成取O.1mol海藻酸加入IOml的氫氧化鈉溶液中，磁力攪拌IOmin,調(diào)節(jié)PH至7 8左右，再加入O. 5mol 丁二胺，混合均勻后再加入O.1moll-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和O. 15mol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)8h，透析2d，冷凍干燥得游離一端氨基的海藻酸中間體。取上述中間體分散于適量甲醇中，加入O. 3mol的姜黃素的甲醇溶液，超聲回流反應(yīng)2h，粗產(chǎn)物用無水甲醇、無水乙醇、無水乙醚、二氯甲烷反復(fù)洗滌至濾液無色，真空干燥得純化后的姜黃素-海藻酸偶聯(lián)物。實施例8姜黃素-季銨化羧甲基殼聚糖的合成取O.1mol季銨化羧甲基殼聚糖加入IOml水中，磁力攪拌30min至完全溶解,用醋酸調(diào)節(jié)PH至5左右，再加入O. 3mol乙二胺，混合均勻后再滴加O. 12moll-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和O. 15mol羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)6h，透析2d，冷凍干燥得游離一端氨基的季銨化羧甲基殼聚糖中間體。取上述中間體分散于30ml甲醇中，加入O. 3mol姜黃素的甲醇溶液，超聲回流反應(yīng)2h，所得粗產(chǎn)物用無水乙醇、無水乙醚、二氯甲烷反復(fù)洗滌至濾液無色，真空干燥得純化后的姜黃素-季銨化羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物。實施例9姜黃素-多糖類偶聯(lián)物納米膠束的制備與CMC值測定
權(quán)利要求
1.一種姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，其特征在于該偶聯(lián)物是在多糖的羧基上，通過二胺類連接臂引入姜黃素，使其具有兩親性質(zhì)，在水性介質(zhì)中可自組裝為納米膠束，所述多糖為未分級肝素，低分子量肝素，脫硫酸化肝素，透明質(zhì)酸，軟骨素，多硫酸化軟骨素，海藻酸，羧甲基葡聚糖，羧甲基香菇多糖或羧基化的殼聚糖；所述二胺類連接臂為對苯二胺、間苯二胺、 鄰苯二胺、胱胺或碳原子數(shù)2 12的亞烷基二胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述姜黃素-多糖類偶聯(lián)物，其特征在于所述的羧基化的殼聚糖為羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、或N-辛基-0，N-羧甲基殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法，其特征包括下列步驟a.多糖活性中間體的制備方法將所述多糖溶于適當溶劑中，采用二胺類化合物為連接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑進行縮合反應(yīng)，得到游離一端氨基的多糖活性中間體；b.姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法制備方法1:將姜黃素溶于適當有機溶劑中，直接加入上述多糖活性中間體粉末，加催化劑催化，避光，超聲回流2 12h，抽濾，濾餅用有機溶劑反復(fù)洗滌至濾液無色，以除去未反應(yīng)的姜黃素及其降解產(chǎn)物，烘干，得橙黃色固體；制備方法2 :將姜黃素和多糖活性中間體分別溶于適當混合溶劑中，避光、磁力攪拌、 加熱條件下緩慢向多糖活性中間體溶液中滴加姜黃素，滴加時間為O. 5 6h，滴加終止后繼續(xù)反應(yīng)I 12h，反復(fù)過濾除去不溶性雜質(zhì)，于PBS緩沖液中透析6 24h，離心取上清液， 凍干得橙黃色產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于多糖活性中間體的制備方法中，所述的適當溶劑選自水、N, N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜或上述的混合溶劑；所述多糖、二胺類連接臂、EDC、NHS的摩爾比優(yōu)選為1: 2 20 I 5 I 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法I中，所述的適當有機溶劑選自甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲酰胺；所述的催化劑選自醋酸、鹽酸；所述的多糖活性中間體和姜黃素的摩爾比優(yōu)選為1:1 10，更優(yōu)選為1: 3 5;姜黃素-多糖類偶聯(lián)物的制備方法2中，所述的混合溶劑選自水和甲醇、 水和乙醇、水和二氯甲烷或水和甲酰胺的混合溶劑；所述的多糖活性中間體和姜黃素的摩爾比優(yōu)選為1:1 10，更優(yōu)選為1: 3 5。
6.權(quán)利要求1所述的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物在制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑中的應(yīng)用、或者在制備為高分子新藥中的應(yīng)用、或者在制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥學(xué)活性或藥理活性分子選自紫杉烷類、喜樹堿類、黃酮類、長春新堿類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類、維A酸類、環(huán)孢素類、二氫吡啶類、小蘗堿類抗腫瘤藥物、留體類或非留體類抗炎藥物、心血管藥物、抗生素、 抗真菌藥物、抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑中的任一物質(zhì)或其衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于制備的藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑為口服給藥，劑型選自片劑、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆粒劑、口服溶液劑；制備的高分子新藥為口服或注射給藥，劑型選自片劑、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆粒劑、口服溶液劑、注射劑、注射用凍干粉針；制備藥的學(xué)活性或藥理活性分子的載體為口服或注射給藥，劑型選自片劑、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆粒劑、口服溶液劑、注射劑、注射用凍干粉針。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體的方法為姜黃素-多糖類偶聯(lián)物與水按重量比為3 50 1000的比例溶解，得到多糖類偶聯(lián)物納米膠束；將藥學(xué)活性或藥理活性分子用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后，與所述多糖類偶聯(lián)物納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑和小分子，凍干制得粒徑為10 IOOOnm的納米膠束。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的的應(yīng)用，其特征在于姜黃素-多糖類偶聯(lián)物在制備藥學(xué)活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑的質(zhì)量濃度為O.1 90%，優(yōu)選為O.1 35%。
全文摘要
本發(fā)明涉及姜黃素-多糖類偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用。其制備方法為首先通過酰胺反應(yīng)將二胺類化合物的一端氨基接枝到多糖上，得到游離一端氨基的多糖大分子；隨后以希夫堿反應(yīng)在多糖骨架上引入了姜黃素。其特征包括1.通過對姜黃素的接枝改性，提高了其水溶性及體內(nèi)外穩(wěn)定性，生成的姜黃素-多糖類偶聯(lián)物可單獨用作高分子新藥。2.姜黃素-多糖類偶聯(lián)物具較強的口服吸收促進作用，安全性好，與其它藥物聯(lián)用時，能起到促進藥物吸收、提高療效、降低該納物毒副作用等效果。3.疏水性基團姜黃素的引入使多糖分子兩親性增加，姜黃素-多糖類偶聯(lián)物在水性介質(zhì)中能自組裝為納米膠束，可用作難溶性藥物的載體。本發(fā)明制備方法簡單，成本較低，適用于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號A61P29/00GK102988999SQ20121014111
公開日2013年3月27日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者周建平, 姚靜, 倪江, 楊暉 申請人:中國藥科大學(xué)