專利名稱：一種負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種負載基因活性物質的皮膚再生材料及其制備方法，具體說涉及一種負載季銨化殼聚糖/SiRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料及其制備方法。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，約占人體重量的16%。皮膚由表及里可依次分為表皮層、真皮層以及皮下組織三部分；其結構具有高度復雜性，包括多種細胞和膠原、弾性蛋白、糖蛋白或蛋白多糖等生物大分子，以及氨基酸、葡萄糖、維生素、無機鹽等小分子。由于日常生活中大面積暴露于外部壞境中，皮膚極易因燒傷、機械創(chuàng)傷和慢性疾病(如糖尿病)等導致缺損，嚴重影響人類生命和生存質量。目前，自體皮移植仍是臨床上治療皮膚缺損的最佳方法，然而對于大面積缺損患者往往存在供皮區(qū)不足和二次甚至多次手術的問題。近年來，基于組織工程和再生醫(yī)學原理的各類皮膚再生材料逐步發(fā)展起來，成為治療皮膚缺損的有效手段。膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架是ー類原位誘導真皮再生的皮膚再生材料，由膠原-殼聚糖三維多孔支架和硅橡膠薄膜組成。其中膠原-殼聚糖三維多孔支架起真皮再生模板作用，可有效誘導缺損組織處細胞遷移、増殖和分化，最終實現真皮組織的再生。硅橡膠薄膜則起臨時表皮層的作用，可有效防止水分喪失和抵御細菌入侵，對創(chuàng)面實施臨時保護。該雙層支架所采用原料為膠原和殼聚糖，均為生物相容性好、免疫原性低和可生物降解的材料。經證明，該皮膚再生材料可實現創(chuàng)傷和燒傷導致的全層皮膚缺損的修復與再生。然而，經該材料再生修復的皮膚組織仍然存在一定的瘢痕化問題，影響了再生皮膚組織的生理功能。瘢痕化是人體創(chuàng)傷修復過程中應激反應的產物，其本質是細胞外基質(ECM)的合成代謝與降解代謝的失衡，進而導致細胞外基質(主要為膠原)的過量沉積。瘢痕性修復雖能恢復創(chuàng)面的完整性，但并不能重建皮膚原有結構和功能，易引起皮膚組織畸形和功能障礙，也可導致局部皮膚潰爛和瘙癢等問題。皮膚修復過程的瘢痕化涉及多種細胞因子的調控，其中轉化生長因子β (TGF-β)是調控膠原、蛋白多糖等細胞外基質沉積，調節(jié)瘢痕形成的關鍵細胞因子。研究表明，適量的TGF-β有益于創(chuàng)面愈合，但是TGF-β，尤其是TGF-β I的過量表達卻可導致瘢痕化；因此，抑制皮膚修復過程中的TGF-β I表達水平，可減少瘢痕的形成。目前，抑制TGF-β I水平的途徑主要有TGF-i3 I抗體中和，6-磷酸甘露糖、核心蛋白聚糖等拮抗劑的應用，可溶性TGF-β I受體競爭TGF-β I結合位點，以及反義寡核苷酸干擾TGF-β I基因表達等。小干擾RNA(SiRNA)技術是近10年發(fā)展起來的ー種先進基因技術，它可在轉錄后水平和翻譯水平上阻斷靶基因的表達，廣泛應用于基因組學、抗腫瘤和抗病毒等領域的研究。采用siRNA技術調控TGF-β I水平，可避免TGF-β I抗體的免疫原性和易失活等問題。相對于反義寡核苷酸等其他基因調控手段，siRNA技術具有高效，特異性好以及持續(xù)時間長等優(yōu)點。siRNA的作用效果極大程度依賴于其傳遞載體，理想的siRNA載體可起到保護siRNA免受破壞和促進siRNA被細胞攝入的作用。其中，季銨化殼聚糖具有良好的生物相容性和傳遞效率，是ー類有效的siRNA載體材料。siRNA與其載體形成的復合粒子，可通過簡單快捷的物理吸附作用負載到膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架。膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架對siRNA起到儲存和緩釋的作用，最終通過siRNA在皮膚缺損創(chuàng)面的原位轉染來下調皮膚修復過程中瘢痕化相關因子(TGF-β I或其下游信號通路因子如Smad2蛋白和Smad3蛋白)的表達水平，在有效促進缺損創(chuàng)面再生修復的同時，抑制膠原的過度沉積，降低再生皮膚組織的瘢痕化程度。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料及其制備方法，該皮膚再生材料可廣泛應用于創(chuàng)傷和燒傷等全層皮膚缺損，在有效誘導缺損、皮膚再生修復的同時抑制再生皮膚的瘢痕化。I.本發(fā)明提供的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料，包括由膠原-殼聚糖三維多孔支架和硅橡膠薄膜構成的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架，在雙層支架中吸附有季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子，其中，siRNA與膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架的質量比為I :1000—10 :1000，季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子中季銨化殼聚糖與siRNA的質量比為1:1—50:1。上述的siRNA是抑制轉化生長因子β I (TGF-β I)的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。本發(fā)明的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料的制備方法，包括以下步驟
O用超純水分別配制濃度為I一5mg/mL的季銨化殼聚糖溶液和濃度為O. I一lmg/mL的siRNA溶液；將季銨化殼聚糖溶液和siRNA溶液等體積混合，渦旋振蕩均勻后靜置，制得季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子；
2)用質量濃度為O.5% — 3%的こ酸溶液分別配制質量濃度為O. 1% — O. 7%的膠原溶液和質量濃度為O. 1% — O. 7%的殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中使得殼聚糖和膠原的質量比為1:9一5:5，攪拌均勻及真空脫泡，得到膠原-殼聚糖混合溶液；將膠原-殼聚糖混合溶液注入模具中，在-10 oC一-80 °G溫度下冷凍并凍干，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；將膠原-殼聚糖三維多孔支架在質量濃度為O. 01% — 1%的戊ニ醛溶液中交聯(lián)I一48小時，反復清洗后，再次-10 oC一-80 °e溫度下冷凍并凍干；
3)將醫(yī)用膠黏劑以O.05—0. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度為O. 05—0. 2mm的硅橡膠薄膜表面，然后將步驟2)制備好的膠原-殼聚糖三維多孔支架黏貼于涂覆膠黏劑的硅橡膠薄膜表面上，獲得膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架；
4)將步驟I)的季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子滴加到膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架上，其中siRNA與膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架的質量比為1:1000—10:1000 ;室溫下孵化I一4小時，在-10 oC一-80 °e溫度下冷凍并凍干，得到負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料。上述的醫(yī)用膠黏劑是α -氰基丙烯酸酯類膠黏劑或有機硅膠黏劑。上述的SiRNA是抑制TGF-β I的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明制備的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料，其突出特點是采用天然大分子膠原蛋白作為主要原料、并添加組分殼聚糖提高交聯(lián)效率和改善降解性能；通過調控冷凍干燥的參數，得到具有可控孔徑和孔隙率的三維多孔支架作為真皮再生模板。選擇生物性相容性好、弾性好、透氣性高和透濕性可控的硅橡膠薄膜作為表皮層的模擬物，起到阻止細菌侵入和防止水分蒸發(fā)的作用，所制備的雙層支架具有良好的誘導缺損真皮再生修復的性能，可廣泛應用于創(chuàng)傷和燒傷創(chuàng)面的修復。針對再生修復創(chuàng)面的瘢痕化問題，采用生物相容性好、正電荷密度高的季銨化殼聚糖作為siRNA傳遞載體，制備穩(wěn)定性和沉默效率高的季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子；通過改變siRNA的種類和負載量，得到可以調控瘢痕化相關因子表達水平的皮膚再生材料。該皮膚再生材料組織相容性好，可誘導各種修復細胞的遷移、増殖、分化，有效促進肉芽組織的形成。同時，通過所攜帯的季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子在創(chuàng)面的原位轉染，可在長達四周的時間范圍內下調瘢痕化相關因子的表達，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，抑制細胞外基質(如I型膠原)的過度合成、分泌和沉積，從而抑制新生組織的瘢痕化。隨著新生組織的不斷形成，該材料逐漸被機體吸收，最終得到結構和功能與人體天然皮膚組織高度接近的再生皮膚組織。


圖I為季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的透射電鏡圖。圖2為膠原-殼聚糖三維多孔支架表面的掃描電鏡圖。圖3為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖三維多孔支架的掃描電鏡圖。圖4為人真皮成纖維細胞在負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼糖支架上培養(yǎng)7天的掃描電鏡圖。圖5為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生 材料植入創(chuàng)傷全層皮膚缺損不同時間的大體觀察圖，其中a為9天，b為18天，c為30天。圖6為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料植入創(chuàng)傷全層皮膚缺損不同時間的H&E染色圖，其中a為9天，b為18天，c為30天。圖7為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料植入創(chuàng)傷全層皮膚缺損不同時間的TGF-β I免疫組化染色圖，其中a為9天，b為18天，c為30天。圖8為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料植入全層皮膚缺損表面14天之后，再進行超薄表皮移植，12周后再生組織的H&E染色圖。圖9為負載了季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料植入全層皮膚缺損表面14天之后，再進行超薄表皮移植，12周后再生組織的Masson染色圖。
具體實施例方式下面結合實施實例對本發(fā)明作詳細說明。
實施例I :
用超純水分別配制濃度為2mg/mL的季銨化殼聚糖溶液和濃度為O. 2mg/mL的抑制Smad2蛋白的siRNA (Smad2-siRNA)溶液；將季銨化殼聚糖溶液和Smad2_siRNA溶液等體積混合，渦旋振蕩均勻后靜置，制得懸浮分散狀態(tài)的季銨化殼聚糖/Smad2-siRNA復合粒子，透射電鏡觀察復合粒子的形貌如圖I所示。用質量濃度為1%的こ酸溶液分別配制質量濃度為O. 7%的膠原溶液和質量濃度為O. 7%的殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中使得殼聚糖和膠原的質量比為5:5，攪拌均勻及真空脫泡，得到膠原-殼聚糖混合溶液；將膠原-殼聚糖混合溶液注入模具中，在_20°C溫度下冷凍并凍干，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；將膠原-殼聚糖三維多孔支架在質量濃度為O. 04%的戊ニ醛溶液中交聯(lián)12小吋，反復清洗后，再次-20 溫度下冷凍并凍干，其微觀結構如圖2所示。將有機硅膠黏劑以
O.05mg/cm2的量均勻涂覆在厚度為O. Imm的硅橡膠薄膜表面，然后將制備好的膠原-殼聚糖三維多孔支架黏貼于涂覆有機硅膠黏劑的硅橡膠薄膜表面上，獲得膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架；將季銨化殼聚糖/Smad2-siRNA復合粒子滴加到膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支 架上，其中Smad2-siRNA與支架的質量比為1:1000 ;室溫下孵化2小時，在-20°C溫度下冷凍并凍干，得到負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料，用掃描電鏡觀察如圖3所示，復合粒子通過物理吸附作用粘附在支架的孔壁上。在負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料上種植人真皮成纖維細胞，以添加了 10%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)7天之后，用中性福爾馬林固定，梯度脫水，超臨界干燥之后用掃描電鏡觀察，如圖4所示。人真皮成纖維細胞在負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料上較好地粘附并保持其形態(tài)，說明該皮膚再生材料具有良好的細胞相容性。實施例2
用超純水分別配制濃度為5mg/mL的季銨化殼聚糖溶液和濃度為O. 5mg/mL的抑制Smad3蛋白的siRNA(Smad3-siRNA)溶液；將季銨化殼聚糖溶液和Smad3_siRNA溶液等體積混合，渦旋振蕩均勻后靜置，制得懸浮分散狀態(tài)的季銨化殼聚糖/ Smad3-siRNA復合粒子。用質量濃度為3%的こ酸溶液分別配制質量濃度為O. 5 %的膠原溶液和質量濃度為O. 5%的殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中使得殼聚糖和膠原的質量比為1:9，攪拌均勻及真空脫泡，得到膠原-殼聚糖混合溶液；將膠原-殼聚糖混合溶液注入模具中，在-50 oC溫度下冷凍并凍干，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；將膠原-殼聚糖三維多孔支架在質量濃度為O. 25%的戊ニ醛溶液中交聯(lián)4小時，反復清洗后，再次-50 °e溫度下冷凍并凍干；將α -氰基丙烯酸酯類膠黏劑以O. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度為O. 2mm的硅橡膠薄膜表面，然后將制備好的膠原-殼聚糖三維多孔支架黏貼于涂覆α-氰基丙烯酸酯類膠黏劑的硅橡膠薄膜表面上，獲得膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架，紫外輻照滅菌2h。將季銨化殼聚糖/ Smad3-siRNA復合粒子滴加到滅菌后的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架上，其中Smad3-siRNA與支架的質量比為8:1000 ;室溫下孵化4小時，在-50 °G溫度下冷凍并凍干，得到負載季銨化殼聚糖/ Smad3-siRNA復合粒子的皮膚再生材料。在巴馬小型豬背上制備全層創(chuàng)傷缺損創(chuàng)面，移植負載季銨化殼聚糖/ Smad3-siRNA復合粒子的皮膚再生材料。從圖5可以看出，材料有效誘導了肉芽組織的形成，肉芽組織顏色紅潤，血管較豐富。從圖6的H&E染色圖可以看出，創(chuàng)面9天到18天，肉芽組織成纖維細胞浸潤豐富，微血管增多；創(chuàng)面30天時膠原已有沉積，但并非雜亂無規(guī)則的形態(tài)。圖7表明，肉芽組織中成纖維細胞的TGF-β I表達不高。實施例3
用超純水分別配制濃度為lmg/mL的季銨化殼聚糖溶液和濃度為O. lmg/mL的抑制轉化生長因子β 1-siRNA (TGF^ Ι-siRNA)溶液；將季銨化殼聚糖溶液和TGF0 Ι-siRNA溶液等體積混合，渦旋振蕩均勻后靜置，制得懸浮分散狀態(tài)的季銨化殼聚糖/TGFii Ι-siRNA復合粒子；用質量濃度為1%的こ酸溶液分別配制質量濃度為O. 3%的膠原溶液和質量濃度為 O.3%的殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中使得殼聚糖和膠原的質量比為3:7，攪拌均勻及真空脫泡，得到膠原-殼聚糖混合溶液；將膠原-殼聚糖混合溶液注入模具中，在-80 oC溫度下冷凍并凍干，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；將膠原-殼聚糖三維多孔支架在質量濃度為O. 5%的戊ニ醛溶液中交聯(lián)24小吋，反復清洗后，再次-80 oC溫度下冷凍并凍干；將有機硅膠黏劑以O. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度為O. 05mm的硅橡膠薄膜表面，然后將制備好的膠原-殼聚糖三維多孔支架黏貼于涂覆有機硅膠黏劑的硅橡膠薄膜表面上，獲得膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架，紫外輻照滅菌2h ;將季銨化殼聚糖/TGFi3 1-siRNA復合粒子滴加到滅菌的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架上，其中TGF β 1-siRNA與支架的質量比為10:1000 ;室溫下孵化4小時，在-80 °G溫度下冷凍并凍干，得到負載季銨化殼聚糖/TGF^ Ι-siRNA復合粒子的皮膚再生材料。在巴馬小型豬背上制備全層創(chuàng)傷缺損創(chuàng)面，移植負載季銨化殼聚糖/TGFii Ι-siRNA復合粒子的皮膚再生材料；14天之后，再進行超薄表皮移植。創(chuàng)傷12周之后，修復的皮膚組織H&E染色見圖8，表皮和真皮整合良好，細胞外基質的沉積情況接近正常皮膚。從圖9的Masson染色進ー步看出，修復組織的膠原沉積規(guī)則有序，呈現編織交錯的束狀結構，瘢痕化得到明顯抑制。
權利要求
1.ー種負載季銨化殼聚糖/SiRNA復合粒子的皮膚再生材料，其特征是包括由膠原-売聚糖三維多孔支架和硅橡膠薄膜構成的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架，在雙層支架中吸附有季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子，其中，siRNA與膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架的質量比為I :1000—10 :1000，季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子中季銨化殼聚糖與siRNA的質量比為 1:1—50:1。
2.根據權利要求I所述的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料，其特征是所說的siRNA是抑制轉化生長因子β I的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。
3.制備權利要求書I所述的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料的方法，其特征在于包括以下步驟 O用超純水分別配制濃度為I一5mg/mL的季銨化殼聚糖溶液和濃度為O. I一lmg/mL的siRNA溶液；將季銨化殼聚糖溶液和siRNA溶液等體積混合，渦旋振蕩均勻后靜置，制得季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子； 2)用質量濃度為O.5% — 3%的こ酸溶液分別配制質量濃度為O. 1% — O. 7%的膠原溶液和質量濃度為O. 1% — O. 7%的殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中使得殼聚糖和膠原的質量比為1:9一5:5，攪拌均勻及真空脫泡，得到膠原-殼聚糖混合溶液；將膠原-殼聚糖混合溶液注入模具中，在-10 0C一-80 °C溫度下冷凍并凍干，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；將膠原-殼聚糖三維多孔支架在質量濃度為O. 01% — 1%的戊ニ醛溶液中交聯(lián)I一48小時，反復清洗后，再次-10 0C一-80 °C溫度下冷凍并凍干； 3)將醫(yī)用膠黏劑以O.05—0. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度為O. 05—0. 2mm的硅橡膠薄膜表面，然后將步驟2)制備好的膠原-殼聚糖三維多孔支架黏貼于涂覆膠黏劑的硅橡膠薄膜表面上，獲得膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架； 4)將步驟I)的季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子滴加到膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架上，其中siRNA與膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架的質量比為1:1000—10:1000 ;室溫下孵化I一4小時，在-10 0C一-80 °C溫度下冷凍并凍干，得到負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料。
4.根據權利要求3所述的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料的制備方法，其特征是所說的醫(yī)用膠黏劑是α-氰基丙烯酸酯類膠黏劑或有機硅膠黏劑。
5.根據權利要求3所述的負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料的制備方法，其特征是所說的siRNA是抑制轉化生長因子β I的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種負載季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子的皮膚再生材料及其制備方法。選擇具有良好生物相容性和傳遞效率的季銨化殼聚糖作為siRNA載體材料，與可抑制瘢痕化相關因子表達的siRNA絡合形成季銨化殼聚糖/siRNA復合粒子；再將該復合粒子通過物理吸附作用負載到膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架，最終得到的皮膚再生材料可利用復合粒子在皮膚缺損創(chuàng)面的原位轉染來下調皮膚修復過程中瘢痕化相關因子的表達水平，在有效促進缺損皮膚再生修復的同時抑制膠原過度沉積和瘢痕化。本發(fā)明所制備的皮膚再生材料具有優(yōu)異的創(chuàng)面修復及減弱瘢痕的能力，可廣泛應用于全層皮膚缺損的修復與再生，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號A61L27/54GK102671243SQ201210143099
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權日2012年5月10日
發(fā)明者劉幸, 馬列, 高長有 申請人:浙江大學