專(zhuān)利名稱(chēng)：姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦缺血是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的三大疾病之一，是中老年人的常見(jiàn)病，多發(fā)病，以其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。近年來(lái)，其發(fā)病有年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率逐漸增高，是首位致殘?jiān)?，存活者?/4患者不同程度地喪失勞動(dòng)能力，中度致殘者占40%以上。腦梗死可出現(xiàn)神經(jīng)元的變性、壞死、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡或凋亡，目前尚無(wú)有效治療方法。 腦缺血后梗死的主要病理變化為能量缺乏、腦水腫、炎癥、自由基損傷、興奮性氨基酸毒性作用和凋亡級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)等，機(jī)制非常復(fù)雜、涉及許多相關(guān)因子和基因的改變。改善恢復(fù)腦血供及神經(jīng)保護(hù)是治療缺血性腦中風(fēng)的兩種重要策略，目前公認(rèn)的有效方法是溶栓治療，但受溶栓治療時(shí)間窗和治療條件所限，僅3%左右的患者能進(jìn)行該項(xiàng)治療，而且溶栓治療雖可以建立缺血區(qū)血流再灌注，但不能解決缺血引起的腦組織再灌注損傷。因此，尋找有效的神經(jīng)保護(hù)因子，對(duì)腦梗死損傷過(guò)程的主要環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，減輕缺血區(qū)的神經(jīng)損傷、恢復(fù)受損神經(jīng)功能一直是人們研究的熱點(diǎn)。因此目前急需ー種有效預(yù)防和治療腦缺血疾病的藥物。姜黃素是中藥姜黃中的主要成分，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，能夠?qū)喯醢返扔辛己玫谋Ｗo(hù)作用，還具有降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能，抗炎、抗氧化、利膽，可以抑制自由基的形成等。過(guò)去臨床上用姜黃素治療的疾病如艾滋病、腫瘤、慢性潰瘍、肝炎，以及降血脂、抑郁癥等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)ー種傳統(tǒng)藥物的新作用，即姜黃素能夠在早期預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的急危重病象。姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。所述腦缺血再灌注損傷為腦梗死，腦充血和腦水腫。治療腦缺血再灌注損傷的藥物為姜黃素注射劑；所述姜黃素注射劑的制備方法如下取姜黃素3g，3ml無(wú)水こ醇溶解，滴加入聚維酮溶液中，用IOml無(wú)水こ醇洗瓶，手動(dòng)攪拌，倒入250ml燒杯中攪拌充分,攪拌后凍干3-5h,得到姜黃素固體分散體，取900mg姜黃素固體分散體，加注射用生理鹽水5ml，得到20mg/ml的姜黃素注射劑，置于于棕色瓶中保存。所述姜黃素能降低腦缺血再灌注患者中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力和尿酸含量，改善腦缺血再灌注肝腎功能損傷。所述姜黃素能降低腦缺血再灌注患者中Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl_2的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
所述姜黃素能抑制腦缺血再灌注患者中損傷相關(guān)因子Cox-II、p-ERK、p-CPLA2的表達(dá)水平。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)姜黃素在預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷中能顯著改善腦組織病理?yè)p傷，神經(jīng)功能學(xué)狀態(tài)得到改善，并且改善腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肝腎功能損傷，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到抗腦梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，并且同時(shí)能夠改善自由基損傷，減小腦梗死體積。姜黃素來(lái)源廣，易于取得，且成本低，制作エ藝簡(jiǎn)單，注射劑劑型便于臨床給藥。


圖I腦組織肉眼觀察圖；
圖中，A-假手術(shù)組，B-對(duì)照組，C-姜黃素治療組。圖2各組小鼠腦缺血再灌注組織病理學(xué)HE染色(X 600)圖；圖中，A-假手術(shù)組，B-對(duì)照組，C-姜黃素治療組。圖3各組小鼠腦缺血再灌注腦組織切片免疫組化圖；圖中，A-CNSE ；D-F =Cox-II ;G_I :Bcl_2 ;A/D/G_ 假手術(shù)組；B/E/H_ 對(duì)照組；C/F/I-姜黃素給藥組。圖4各組小鼠腦缺血再灌注后腦組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力和血清中尿酸的含量；圖中，Sham-假手術(shù)組，K30-對(duì)照組，Cur-姜黃素治療組。圖5姜黃素調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷腦組織相關(guān)蛋白的表達(dá)水平圖；圖中，Sham-假手術(shù)組，K30-對(duì)照組，Cur-姜黃素治療組。圖6姜黃素調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷腦組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平圖；圖中，Sham-假手術(shù)組，K30-對(duì)照組，Cur-姜黃素治療組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明。實(shí)施例I姜黃素注射劑及小鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型制備(I)姜黃素注射劑的制備①聚維酮(PVP)姜黃素固體分散體質(zhì)量比(姜黃素PVP = I : 8)PVP 24g，40ml無(wú)水こ醇溶解，磁力攪拌姜黃素3g，3ml無(wú)水こ醇溶解，滴加入PVP溶液中，用IOml無(wú)水こ醇洗瓶，手動(dòng)攪拌，倒入250ml燒杯中大轉(zhuǎn)子攪拌充分,攪拌后凍干4h。②姜黃素固體分散體溶液稱(chēng)取900mg姜黃素固體分散體,加注射用生理鹽水5ml,即為姜黃素20mg/ml,于棕色瓶中，呈透明橘紅色，粘稠，取20mg/ml Iml+生理鹽水7ml即為2. 5mg/ml的應(yīng)用液。(2)制作小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型雄性昆明小鼠60只，稱(chēng)重約25g，其中分為假手術(shù)組A 20只，對(duì)照組B 20只，姜黃素治療組C 20只，1%戊巴比妥鈉(6mg/100g)麻醉小鼠，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外(ECA)和頸內(nèi)(ICA)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端穿線備用。頸總動(dòng)脈近分叉處剪ー小ロ，將栓線(直徑0. 14)由此插入頸總動(dòng)脈，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動(dòng)脈分叉處，栓線插入深度約(15 ±0. 5) mm (ECA與ICA分叉處為起點(diǎn))，假手術(shù)組僅將栓線插到5mm處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈與栓線，順序縫合好肌肉皮膚，栓線末端留于皮膚外以備抽線。栓塞2h后將栓線拉出ICA實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注24h。麻酔清醒后讓小鼠自由攝取水和食物，傷ロ做好消毒預(yù)防感染。(3)模型成功評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)采用Longa “5分法”對(duì)小鼠腦缺血再灌注模型的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。0分為無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分為對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直；2分為向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分為行走向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1-4分為有效模型。(4)腦梗死體積計(jì)算測(cè)定再灌注24h后麻酔小鼠，立即斷頭取腦，于-20°C速凍30min，從額極向枕極作厚度為2mm的冠狀切片，共5_6片，迅速置于2% TTC磷酸鹽緩沖液中，37°C避光染色40min,期間翻動(dòng)腦片3_4次使染色均勻。染色后正常腦組織呈紅色，而梗死灶呈白色。10%甲醛固定24h后數(shù)碼拍照輸入計(jì)算機(jī)，利用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)
4.0(北京航空航天大學(xué))進(jìn)行計(jì)算，以梗死區(qū)占缺血側(cè)大腦半球總體積的百分比作為統(tǒng)計(jì) 參數(shù)。(5)姜黃素對(duì)小鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能的影響TTC染色結(jié)果如圖1，假手術(shù)組腦片全部染色成紅色，對(duì)照組可見(jiàn)明顯的白色梗死灶，姜黃素治療組與對(duì)照組比較，梗死灶顯著縮小(P<0.05);再灌注24h，對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，而姜黃素給藥組神經(jīng)功能缺損癥狀較模型組有所改善，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)，見(jiàn)表I.表I神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及梗死灶體積
分組神經(jīng)功能學(xué)#分梗死灶體積％
假手術(shù)組00對(duì)照組2.99±0.850.45±0.16 姜黃素治療組1.43±0.72*0.22±0.15*注*P< 0. 05vs 對(duì)照組由以上結(jié)果提示，姜黃素注射劑能夠通過(guò)改善小鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能學(xué)狀態(tài)和降低小鼠腦梗死體積，改善腦缺血再灌注損傷。實(shí)施例2小鼠腦缺血再灌注各組腦組織病理學(xué)改變(1)冊(cè)染色缺血211再灌注2411后用I %戊巴比妥鈉(6mg/100g)麻醉小鼠，開(kāi)胸剪破右心耳，經(jīng)左心室依次灌注(含肝素0. 4% )0. 9%生理鹽水30ml，4%多聚甲醛30ml，立即取腦，在10%多聚甲醛溶液中后固定48h。常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，在額極厚5mm處取2mm厚冠狀切片進(jìn)行HE切片染色工作。光鏡觀察缺血側(cè)皮層腦組織的病理學(xué)改變。(2)HE染色結(jié)果，如圖2所示，光鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)分布正常；對(duì)照組細(xì)胞排列紊亂，梗死灶中心區(qū)可見(jiàn)明顯組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞脫失，細(xì)胞空泡樣變，梗死灶周?chē)窠?jīng)細(xì)胞缺血樣變明顯；姜黃素治療組缺血范圍及程度較模型組明顯縮小，梗死灶中心區(qū)神經(jīng)元脂肪變性和空泡樣變程度減輕，充血和腦水腫程度減輕。以上結(jié)果提示，姜黃素能夠減輕腦缺血再灌注損傷壞死。實(shí)施例3小鼠腦缺血再灌注后腦組織NSE、Cox-II、Bcl-2免疫組化
(I)免疫組化檢測(cè)NSE、Cox-II, Bcl-2表達(dá)根據(jù)HE染色結(jié)果判定缺血梗死灶部位進(jìn)行切片，將石蠟組織切片脫蠟，按免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行染色，應(yīng)用3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性30min，PBS洗5minX2次，蒸餾水洗5minX2次。枸櫞酸緩沖液(pH6. 0)92°C熱修復(fù)5min,靜置5min,再次熱修復(fù)5min, PBS洗5minX2次，蒸懼水洗5minX2次。I. 5%羊血清封閉置濕盒孵育Ih (37°C )，棄去不洗，滴加ー抗(兔抗鼠Cox-II(I 50)和Bcl-2(1 200)多克隆抗體)37°C孵育lh，PBS洗5minX2次。滴加ニ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔)37°C孵育lh，PBS洗5minX2次。滴加試劑SABC，37°C孵育lh, PBS洗5minX2次。加DAB顯色，蒸餾水洗滌，0. 2%蘇木素輕度復(fù)染lOmin，常規(guī)脫水，透明，樹(shù)脂封片，顯微鏡觀察。(2)如圖3(A_C)所示，神經(jīng)元NSE染色棕黃色，正常形態(tài)呈蝌蚪形，可見(jiàn)明顯的軸突。姜黃素給藥組神經(jīng)元排列整齊、胞漿染色均一；對(duì)照組缺血區(qū)NSE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體固縮、濃染，NSE表達(dá)較假手術(shù)組明顯減弱；姜黃素組缺血區(qū)NSE陽(yáng)性細(xì)胞較模型組明顯增多，細(xì)胞形態(tài)接近正常。如圖3(D-F)假手術(shù)組Cox-II陽(yáng)性神經(jīng)元散在于大腦皮 層，數(shù)量極少，表達(dá)量低；對(duì)照組Cox-II陽(yáng)性神經(jīng)元分布多位于腦梗死邊緣區(qū)，表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，在梗死邊緣區(qū)某些Cox-II免疫陽(yáng)性神經(jīng)元有正常神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征，免疫活性主要位于核周?chē)窠?jīng)元的胞體和突起，Cox-II表達(dá)也見(jiàn)于缺血邊緣呈皺縮、扭曲的損傷神經(jīng)元；姜黃素治療組Cox-II表達(dá)較模型組明顯降低，較假手術(shù)組無(wú)顯著差別。如圖3 (G-I)所示，假手術(shù)組可見(jiàn)有少量Bcl-2蛋白表達(dá)；對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組有所増加；姜黃素給藥組Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)ー步增加，明顯高于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，姜黃素通過(guò)上調(diào)腦組織中NSE、Bcl-2，下調(diào)腦組織中Cox-II的表達(dá)，保護(hù)腦缺血再灌注損傷。實(shí)施例4姜黃素對(duì)腦缺血再灌注小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力和尿酸含量的影響(I)小鼠缺血2h再灌注24h后,立即摘眼球取血,凍于_20°C備用。使用南京建成生物技術(shù)公司試劑盒檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力和尿酸含量。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)分布檢驗(yàn)，比較采用單因素方差分析，以P < 0. 05為差異有顯著性。(2)如圖4所示，對(duì)照組較假手術(shù)組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著升高(P < 0. 01)，姜黃素治療組較對(duì)照組有所降低(P < 0. 05)，但高于假手術(shù)組(P < 0. 01);對(duì)照組較模型組和姜黃素治療組血清尿酸含量明顯升高(P < 0. 01)，姜黃素治療組較對(duì)照組尿酸含量有所降低(P < 0. 01)。以上結(jié)果提示，姜黃素能夠改善腦缺血再灌注損傷后小鼠肝腎功能。實(shí)施例5腦缺血再灌注損傷后腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況(I)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)腦缺血2h再灌注24h后，斷頭取腦，放置于液氮中保存，待樣本量足夠，提取總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉室溫封閉lh，ー抗37°C緩慢搖動(dòng)lh，TBST緩沖液洗膜3次，IOmin/次，ニ抗37°C避光緩慢搖動(dòng)40min，TBST緩沖液洗膜3次，IOmin/次，曝光及洗片，掃描，軟件分析光密度值。(2)如圖5所示，缺血再灌注24h對(duì)照組腦組織p_ERK、p_cPLA2表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P < 0. 01)，姜黃素治療組能夠顯著降低p-ERK、p-cPLA2的表達(dá)(P < 0. 01)，但要高于假手術(shù)組(P < 0. 01);缺血再灌注24h對(duì)照組Cox-II表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，姜黃素治療組明顯降低Cox-II表達(dá)量，與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P>0.05);假手術(shù)組抗凋亡蛋白Bcl-2有少量表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)量較假手術(shù)組顯著増加(P < 0. 01)，姜黃素治療組顯著高于對(duì)照組(P < 0. 01);模型組促凋亡蛋白Caspase-3顯著高于假手術(shù)組(P< 0. 01)，姜黃素治療組顯著降低Caspase-3蛋白表達(dá)量(P < 0. 01)。以上結(jié)果提示，姜黃素通過(guò)降低Cox-II、Caspase-3、p-ERK、p_cPLA2的表達(dá),增加Bcl_2的表達(dá),保護(hù)缺血再灌注損傷，控制損傷進(jìn)ー步惡化。
實(shí)施例6RT-PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)凋亡相關(guān)基因bcl_2、caspase-3表達(dá)的影響(I)缺血2h再灌注24h斷頭取腦，放入液氮凍存。提取RNA并進(jìn)行RNA定性及定量。RT-PCR步驟按試劑盒說(shuō)明。取5ulPCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，參照Marker DL2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照,紫外燈下用Gel-ProImager Kit成像系統(tǒng)拍照,半定量分析產(chǎn)物的累積光密度值(IOD)，與內(nèi)參照P-actin比較的相對(duì)光密度值(Relative 0D)來(lái)評(píng)定表達(dá)水平。表2引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度
權(quán)利要求
1.姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述腦缺血再灌注損傷為腦梗死，腦充血和腦水腫。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于，治療腦缺血再灌注損傷的藥物為姜黃素注射劑；所述姜黃素注射劑的制備方法如下取姜黃素3g，3ml無(wú)水こ醇溶解，滴加入聚維酮溶液中，用IOml無(wú)水こ醇洗瓶，手動(dòng)攪拌，倒入250ml燒杯中攪拌充分,攪拌后凍干3-5h,得到姜黃素固體分散體,取900mg姜黃素固體分散體，加注射用生理鹽水5ml，得到20mg/ml的姜黃素注射劑，置于于棕色瓶中保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述姜黃素能降低腦缺血再灌注患者中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力和尿酸含量，改善腦缺血再灌注肝腎功能損傷。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述姜黃素能降低腦缺血再灌注患者中Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl_2的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述姜黃素能抑制腦缺血再灌注患者中損傷相關(guān)因子CoX-II、p-ERK和p-CPLA2的表達(dá)水平。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域的一種姜黃素在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明制備腦缺血再灌注損傷模型，將姜黃素-PVP固體分散體用注射用生理鹽水溶解后用于治療該疾病模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著改善腦組織損傷和腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的遠(yuǎn)端肝腎等重要器官的損傷，能夠調(diào)控與凋亡、炎癥、氧化相關(guān)的一些因子的表達(dá)水平，控制損傷進(jìn)一步惡化，保護(hù)腦組織和肝腎等重要器官。
文檔編號(hào)A61K31/12GK102652741SQ20121014916
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者廖杰, 薛輝, 鄧子輝, 顏光濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院