專利名稱：一種含有柚皮苷的黃酮類提取物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來自中藥原料藥的黃酮類提取物，尤其涉及來自枳實、枳殼原料藥中含有的柚皮苷；本發(fā)明還涉及這類提取物在治療骨質(zhì)疏松疾病中的應用以及含有該提取物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是一個世界范圍、越來越引起人們重視的健康問題。骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)為疼痛、骨折、彎腰駝背、呼吸功能下降等。一旦癥狀產(chǎn)生，造成體型改變，對愛美的人是一項打擊，加上疼痛、行動不便、骨折手術(shù)的醫(yī)療支付等，對個人、家庭及社會更是極大的負擔。目前醫(yī)學界還未有安全而有效的方法，幫助已疏松的骨骼恢復原狀。枳實、枳殼為《中華人民共和國藥典》2010版一部法定藥用原料，是蕓香科植物酸 橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥幼果及未成熟果實。功善理氣寬中、行滯消脹之功效。在有關(guān)積實、積殼化學成分研究的文獻中，報道主要含有黃酮類化合物橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、異柚皮苷、柚皮蕓香苷、新圣葉苷、野漆樹苷、忍冬苷等黃酮苷類成分，但抗骨質(zhì)疏松的藥理功效尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在對枳實、枳殼中的黃酮類提取物進行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)所得到含有柚皮苷的提取物在對骨質(zhì)疏松的治療中有效果，因而完成了本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明提供的中藥黃酮類提取物，尤其是中藥提取的含有柚皮苷與現(xiàn)有的藥物相比無毒副作用。本發(fā)明提供了一種來自中藥原料藥的黃酮類提取物，其中至少含有柚皮苷成分，該提取物中柚皮苷的含量以重量百分數(shù)計至少不低于60 %，優(yōu)選75 %，但不超過95%，該提取物可用于骨質(zhì)疏松的治療。本發(fā)明尤其提供了來自中藥枳實、枳殼的上述黃酮類提取物，進而提出了枳實、枳殼有效成分的新的醫(yī)藥用途。本發(fā)明還提供了來自枳實、枳殼原料藥的上述提取物的提取方法，以得到有效成分尤其是柚皮苷含量較高的提取物。在對上述黃酮類提取物的研究中，本發(fā)明還提供了以該提取物為有效成分的藥物組合物，可用于骨質(zhì)疏松的治療。根據(jù)本發(fā)明提供的中藥黃酮類提取物，其中至少含有柚皮苷，每克提取物中含有的總黃酮成分以柚皮苷計不少于900毫克。尤其是，每克提取物中含有柚皮苷不少于600毫克。本發(fā)明的提取物可以來自任何含有所述柚皮苷成分的原料藥，優(yōu)選來自枳實、枳殼原料藥中黃酮類有效成分。
通過對成分及藥物效果的試驗摸索，本發(fā)明尤其提供了應用大孔吸附樹脂的提取方法得到的枳實、枳殼提取物，具有較高的黃酮類有效成分含量，且保持了天然原料的成分。通過藥效學研究，證明本發(fā)明的上述提取物(或稱黃酮類有效部位)可用于骨質(zhì)疏松的治療。所以本發(fā)明還提供了用于治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其中包括治療有效量的上述中藥黃酮類提取物及藥劑學中可接受的藥物輔劑。本發(fā)明所稱“黃酮類”是指以黃酮為母核的不同取代基的化合物。根據(jù)前面所述，本發(fā)明的提取物來自中藥枳實、枳殼，除含有柚皮苷外，還可以包 括任何黃酮類有效成分，例如其有效成分還包括橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷、柚皮蕓香苷、新圣葉苷、野漆樹苷、忍冬苷等黃酮苷類等中的一種或數(shù)種。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，該提取物來自枳實、枳殼原料藥中黃酮類有效成分。本發(fā)明的提取物可以是通過任何可行的方法得到，優(yōu)選可以采用大孔吸附樹脂精制得到，使產(chǎn)物具有較高的純度和收率。本發(fā)明可采用原料生藥，也可采用加工后的飲片。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法，采用枳實、枳殼飲片或未加工的生藥為原料，如果是未加工的生藥，可進行清洗、晾曬和切片等加工作為前期處理，提取方法如下枳實、枳殼藥材破碎，有機溶媒(例如乙醇)提取，回收溶劑，濃縮，加水沉淀，濾過，濾液上大孔吸附樹脂，水洗脫，除去水溶性雜質(zhì)，再用有機溶媒(例如醇，優(yōu)選乙醇)梯度洗脫，收集10% -90%濃度洗脫下來的成分，優(yōu)選30% -70%濃度洗脫下來的成分，更優(yōu)選40% -60%濃度洗脫，分離富集得到以柚皮苷化合物為主的黃酮類成分。結(jié)構(gòu)鑒定柚皮苷(Naringin)白色絮狀結(jié)晶(EtOH)，mp :171. 5-172. 5°C，在聚酰胺薄膜上紫外燈下觀察為深紫色斑點，噴三氯化鋁試劑顯黃色斑點，紫外燈下為鮮黃色斑點，鹽酸鎂粉反應陽性。ESI-MS (m/z) :603 [M+Na] +。1H-NMR(CD3OD)SppmISAO^dJ = S-SHzjj' ,6/ ),6. 84(2H,d,J = 8. 5Hz,H-3' ,5' )，6· 20(1H，s，H-6)，6· 18(lH，d，J = 2. 1Hz，H_8)，5. 41 (1H，d，J = 11.0Hz，糖端基氫)，5· 26 (1H, d, J = 4. 6Hz，糖端基氫)，5· 13 (1Η, t, H_2)，I. 30 (3H, d, H_6"')。13C-NMR (CD30D) δ ppm : 197. I (C_4)，165. I (C_7)，163. 6 (C_9)，163. 3 (C_4 ')，157. 7(C-5), 129. 4 (C-1 ' )，127.7(C_2 '，6 ' )，114.9(C_3 '，5 ' ), 103. 5 (C-IO),101. 1(C-1 " ' )，98.0(C-1 " )，96. 4(C-8)，95. 4(C-6)，79. 3(C-2 " )，77. 8(C_2，5 " ) ,77. 6 (C-3 " ) ,76. 7 (C_4 " ' ), 72. 5 (C_3 " ' ), 70. 8 (C_2 " ' ) ,69. 8 (C_4 ")，68.6(C-5" ' ),60. 9 (C-6" ), 42. 6 (C_3), 16. 8 (C_6 "')。參考文獻，確定該化合物為柚皮苷，其分子式為C27H32014。除以上所述，實施本發(fā)明方法的過程中所涉及的其它操作，例如提取液的揮發(fā)，可以采用加溫揮發(fā)，也可以直接常溫自然揮發(fā)或其它可行的方法，提取和揮干過程的具體操作屬于本領(lǐng)域的基本技能，而涉及到的中藥飲片加工、粉碎、過篩和萃取等，均可采用本領(lǐng)域常規(guī)操作或其它可行的操作，本發(fā)明沒有特別限定。得到的提取物可以通過任何常規(guī)的檢測分析方法得知其是否符合要求，如薄層色譜法、紫外分光光度法以及其他如《中國藥典》2010年版一部附錄所收載的分析方法，以上屬于本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明亦沒有特別限定。從枳實、枳殼藥材中分離精制的總黃酮及其主要成分柚皮苷，藥效學試驗表明其具有升高血清中鈣的含量，降低堿性磷酸酶濃度的作用，因此作為枳實、枳殼的有效部位和有效成分之一?？傊景l(fā)明人在對枳實、枳殼的研究中意外地發(fā)現(xiàn)，上述黃酮類有效部位對骨質(zhì)疏松的治療有效，進一步藥效試驗證實了枳實、枳殼中黃酮類有效部位可用于治療骨質(zhì)疏松。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了該黃酮類提取物在制備治療骨質(zhì)疏松疾病的藥物中的用途。在上述研究基礎上，本發(fā)明還提供了可用于治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，包括治療有效量的中藥黃酮類提取物及藥劑學中可接受的藥物輔劑，其中黃酮類提取物在組合物中重量比至少不低于30%，優(yōu)選不低于50%，更優(yōu)選75%以上，不超過95%。
上述藥物組合物包括藥學可接受的任何劑型，如注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑和口服液等，上述藥物輔劑也包括藥學可接受的任何輔料，以及各劑型的制備工藝均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，在此不加贅述。


圖I為柚皮苷化合物的結(jié)構(gòu)圖；圖2為柚皮苷化合物的ESI-MS光譜圖；圖3為柚皮苷化合物的1H-NMR光譜圖；圖4為柚皮苷化合物的13C-NMR光譜圖
具體實施例方式關(guān)于本發(fā)明的具體實施和治療效果，將結(jié)合優(yōu)選實施例及附圖進行詳細闡述，需要說明的是本發(fā)明所采用的術(shù)語“黃酮類提取物”、“黃酮類有效部位”及“總有效部位”的含義是相同的。枳實、枳殼中柚皮苷等黃酮類有效成分的提取I.大孔吸附樹脂的處理I. I預處理取AB-8型大孔吸附樹脂，用丙酮加熱回流洗脫，洗脫至洗脫液蒸干后無殘留物。I. 2裝柱以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇沖柱，不時檢查流出液，至與水混合不呈白色混濁為止(乙醇液水=I 5)。然后以大量的蒸餾水洗去乙醇，備用。I. 3再生樹脂使用一次后，一般用95%的乙醇洗脫至無色時，樹脂柱即已再生，然后以大量水洗去乙醇，即可進行下一次的分離。經(jīng)反復使用后，吸附樹脂顏色變深，吸附效果下降時，可用O. I % O. 5% NaOH和HCl進行酸堿交替處理或浸泡適當?shù)臅r間，至樹脂接近原顏色為宜，繼續(xù)用水洗至中性即可再用。2.藥材的提取取藥材枳實、枳殼粉碎成粗粉，用50%乙醇回流提取3次(8倍量，2小時；6倍量，I小時；6倍量，I小時)，濾過，合并濾液，低溫減壓回收乙醇至無醇味，以水調(diào)節(jié)至每毫升藥液相當于I. Og生藥，放置12小時，濾過，濾液備用。
3.含柚皮苷黃酮類成分的制備3. I洗脫溶媒的定性選擇取提取液加到已處理好的AB-8型大孔吸附樹脂柱(50g)上，依次用蒸餾水、10^^30^^50^^70^^90%乙醇梯度洗脫，分段收集，減壓回收乙醇加以濃縮，聚酰胺薄層色譜及其HPLC色譜定性檢查柚皮苷等黃酮類成分。結(jié)果顯示10%、70%、90%中含有黃酮較少，同時結(jié)合藥效學實驗結(jié)果，30%、50%乙醇洗脫的藥效結(jié)果較好，因此確定提取液在AB-8型大孔吸附樹脂吸附后，水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，50 %乙醇洗脫富集枳實、枳殼中黃酮類成分。3. 250%乙醇洗脫量的確定取樣品溶液50ml上樹脂柱(50g)，靜置后，先用蒸餾水洗脫至無色，再用50%乙醇洗脫，每50ml為一份，每份稍加濃縮，薄層色譜法定性檢測柚皮苷，結(jié)果顯示第7份時檢測不出柚皮苷，故確定洗脫溶媒用量為350mL。3. 3結(jié)論以柚皮苷為指標評價AB-8型大孔吸附樹脂富集枳實、枳殼中有效部位黃酮類成分的富集量，結(jié)果表明大孔吸附樹脂ImL最大吸附量為Ig枳實、枳殼提取物，水洗除雜后需要7倍的50%乙醇進行洗脫為佳。對雌性去勢小鼠骨質(zhì)疏松癥的藥理學實驗研究I.試驗材料試驗用藥含柚皮苷提取物由北京師范大學教育部資源藥物工程研究中心提供提供，血清鈣、磷、堿性磷酸酶試劑盒由中生北控科技有限公司生產(chǎn)。雌二醇放免藥盒由北京市福瑞生物工程公司生產(chǎn)，批號20070601。健康小鼠，昆明種，體重20±lg，120只，雌性，飼養(yǎng)在20_22°C的室溫環(huán)境中，10只一籠，自由攝取飼料及水，動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。合格證號京動許字SOXK(京)2007-0002。試驗前在中心動物室適應性飼養(yǎng)一周，合格證號SYXK (京)2006-0002。2.試驗方法與結(jié)果取120只小鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，在腋中線與距脊柱外側(cè)約Icm交叉處，剪去鼠毛，以75%乙醇消毒，切開皮膚肌肉，分離脂肪團，便見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管結(jié)扎，然后摘除卵巢?？p合切口，外部敷以青霉素粉。同法摘除另一側(cè)卵巢。卵巢切除后飼養(yǎng)30天(代謝完體內(nèi)雌激素)，去掉死亡及狀態(tài)不好動物，剩余隨機分為7組，去卵巢模型組，柚皮苷50、25mg/kg組,每組10只,連續(xù)給藥30天。末次藥后45min摘除眼球取血,離心后取血清，采用半自動生化分析儀檢測血清Ca (鈣)、P (磷)、ALP (堿性磷酸酶)，IOOul血清
送放免室測雌二醇含量。結(jié)果見表。
權(quán)利要求
1.黃酮類提取物，其特征在于所述提取物至少含有柚皮苷，每克提取物中含有的總黃酮成分以柚皮苷計不少于900毫克。
2.如權(quán)利要求I所述的黃酮類提取物，其中，每克提取物中含有柚皮苷不少于600毫克。
3.如權(quán)利要求2所述的黃酮類提取物,其中含有的柚皮苷來自積實、積殼、原料藥。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的黃酮類提取物的制備方法，依次為醇提水沉、大孔吸附樹脂吸附，水洗除雜、30 % 70 %醇洗脫，濃縮、干燥。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其中用50%的乙醇洗脫。
6.如權(quán)利要求1-3任一項所述的黃酮類提取物在制備治療骨質(zhì)疏松疾病的藥物中的應用。
7.藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1-3任一項中的黃酮類提取物及藥劑學中可接受的藥物輔劑。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中黃酮類提取物的重量比例至少不低于50%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來自中藥原料藥的黃酮類提取物，其中含有柚皮苷，本發(fā)明涉及這類提取物在治療骨質(zhì)疏松中的應用。本發(fā)明還提供了來自枳實、枳殼原料藥中柚皮苷的提取方法，并提供了利用該柚皮苷的藥物組合物。本發(fā)明的提取方法簡單實用，提純效果良好，組合物療效確切，在治療骨質(zhì)疏松癥方面具有全新的用途。
文檔編號A61P19/10GK102716233SQ201210156209
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者劉子沐, 史培軍, 張海鳴, 杜樹山, 王成芳, 費超, 陳然 申請人:北京師范大學