專(zhuān)利名稱(chēng)：一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一類(lèi)細(xì)胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期活動(dòng)之后，可以產(chǎn)生兩個(gè)與分裂前性質(zhì)相同的造血干細(xì)胞，同時(shí)又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細(xì)胞具有向各系血細(xì)胞 分化的能力。造血干細(xì)胞移植目前廣泛應(yīng)用于惡性血液病(如急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等)、非惡性難治性血液病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)遺傳性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海貧血等)和某些實(shí)體瘤治療。造血干細(xì)胞移植是指對(duì)病人進(jìn)行全身照射、化療和免疫抑制預(yù)處理后，將正常供體或自體的造血干細(xì)胞經(jīng)血管輸注給病人，使重建正常的造血和免疫功能。一般來(lái)說(shuō)，造血干細(xì)胞存在于三個(gè)部位，分別是骨髓、外周血和臍帶血，根據(jù)其來(lái)源分別稱(chēng)之為骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞。隨著醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)里含有大量的造血干細(xì)胞，與上述三種來(lái)源的造血干細(xì)胞相t匕，胎盤(pán)中所含造血干細(xì)胞的數(shù)量很高，而且移植胎盤(pán)造血干細(xì)胞的配型要求不需要很?chē)?yán)格，且移植后反應(yīng)較輕且不需要采用藥物。此外，作為胎盤(pán)造血干細(xì)胞來(lái)源-胎盤(pán)，來(lái)源廣泛，孕婦生產(chǎn)后往往成為廢棄物，其采集不會(huì)引起母親和新生兒任何不適的感覺(jué)或產(chǎn)生任何不良的影響。諸多優(yōu)點(diǎn)使胎盤(pán)造血干細(xì)胞有望取代骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞用于造血干細(xì)胞移植中。目前從胎盤(pán)分離制備造血干細(xì)胞的技術(shù)還不成熟，現(xiàn)有技術(shù)中有采用研磨法和酶法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞的報(bào)道。但是，研磨法較為粗糙，細(xì)胞不能從組織中完全分離，數(shù)量少，而且研磨的方法對(duì)細(xì)胞有傷害，影響活力。而酶法多是采用單一酶來(lái)進(jìn)行酶解制備，其中絕大部分為IV型膠原酶，如申請(qǐng)?zhí)枮?1131190. 8的中國(guó)專(zhuān)利“從胎盤(pán)組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法”，其中記載了利用單一膠原酶制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞的方案，但并未公開(kāi)造血干細(xì)胞數(shù)量和活力。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑，使得所述制備方法能夠提高所制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量和活力。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟步驟I、將胎盤(pán)預(yù)處理后，用IV型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，分別收集第一濾液和第一濾渣，所述IV型膠原酶消化液中IV型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 02-0. 2%，所述II型膠原酶消化液中II型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 01-0. 1% ；步驟2、將所述第一濾渣用I型膠原酶消化液和步驟I所述II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，分別收集第二濾液和第二濾渣，所述I型膠原酶消化液中I型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 02-0. 2% ；步驟3、合并第一濾液和第二濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將得到的重懸液加至人淋巴細(xì)胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液并離心，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞。其中，作為優(yōu)選，所述胎盤(pán)與IV型膠原酶消化液的體積比為6:1，所述胎盤(pán)與II型 膠原酶消化液的體積比為6:1，所述胎盤(pán)與I型膠原酶消化液的體積比為6:1。本發(fā)明所述IV型膠原酶消化液、I型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液均優(yōu)選用DMEM/F12 (gibco)培養(yǎng)液溶解配制，除此之外也可用本領(lǐng)域其他常規(guī)培養(yǎng)液溶解配制。本發(fā)明所用胎盤(pán)由某醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)通常采用單一的膠原酶(主要是IV型膠原酶)來(lái)進(jìn)行酶解消化胎盤(pán)，進(jìn)而制備出胎盤(pán)造血干細(xì)胞，但是單一的膠原酶無(wú)法充分酶解消化胎盤(pán)的各種組織，使得制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量較少，而且活力也不高。因此，本發(fā)明采用IV型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合、I型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合進(jìn)行兩次消化胎盤(pán)組織，利用不同類(lèi)型膠原酶的特性，高度消化組織，釋放出更多的造血干細(xì)胞。膠原酶主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，當(dāng)擬消化的組織內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，可采用膠原酶解離細(xì)胞法，而胎盤(pán)正屬于這一類(lèi)組織。I型膠原酶用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離，用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞；IV型膠原酶包含至少7種蛋白酶成分，它能消化多種組織；II型膠原酶適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織細(xì)胞的分離。各種膠原酶對(duì)膠原的酶切位點(diǎn)不同，選擇恰當(dāng)類(lèi)型的膠原酶聯(lián)合起來(lái)消化胎盤(pán)組織效果會(huì)提高。作為優(yōu)選，所述消化在37°C恒溫條件下消化20_60mino在本發(fā)明所述制備方法的起始階段，需要對(duì)胎盤(pán)進(jìn)行預(yù)處理，這一措施屬于本領(lǐng)域公知，即對(duì)胎盤(pán)進(jìn)行消毒、除去胎盤(pán)包膜以及洗滌的步驟，在酶解消化胎盤(pán)之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員均知曉這些預(yù)處理步驟。為了能夠提高酶解消化的效果，本發(fā)明還可以將胎盤(pán)剪成l-2mm3的小塊。在本發(fā)明所述制備方法中，所有洗滌和重懸均優(yōu)選為采用生理鹽水洗滌和重懸。另外，在步驟I和步驟2中，所述過(guò)濾均優(yōu)選為采用50-300目的篩網(wǎng)過(guò)濾。為了進(jìn)一步提高最后獲得的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量，作為優(yōu)選，在步驟I之后、步驟2之前還包括以下步驟將所述第一濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第一濾液。同時(shí)，在步驟2之后、步驟3之前還包括以下步驟將所述第二濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第二濾液。
上述對(duì)濾渣的重復(fù)洗滌可以最大程度上避免殘留在未消化胎盤(pán)組織(即濾渣)上的細(xì)胞損失。在本發(fā)明所述制備方法步驟3中，需要利用人淋巴細(xì)胞分離液對(duì)兩次的濾液進(jìn)行分離，在這之前優(yōu)選用500-1000g離心力對(duì)合并的濾液離心，然后棄上清重懸沉淀。在密度梯度離心時(shí)，由于人淋巴細(xì)胞分離液密度小于紅細(xì)胞、大于單個(gè)核細(xì)胞，離心后處于中間的白膜層就是單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞液，其中包含有造血干細(xì)胞，所述密度梯度離心的離心力優(yōu)選為500-800g，離心時(shí)間優(yōu)選為10-20min。白膜層細(xì)胞液處于中間一層，在分離過(guò)程中難免帶有一些人淋巴細(xì)胞分離液，而且白膜層細(xì)胞液較為粘稠，因此離心的時(shí)候需要較大的離心力。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述白膜層細(xì)胞液的離心具體為將所述白膜層細(xì)胞液先用400_700g的離心力離心5_10min,棄上清重懸沉淀,接著將重懸液用300-500g的離心力離心5-10min。此外，本發(fā)明還提供一種由本發(fā)明所述制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。在與研磨法、單一膠原酶法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的對(duì)比試驗(yàn)中，本發(fā)明制備方法制備的造血干細(xì)胞活力明顯高于其余兩種方法制備的造血干細(xì)胞的活力，而且在造血干細(xì)胞數(shù)量上也較高。本發(fā)明還提供一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑，由本發(fā)明所述胎盤(pán)造血干細(xì)胞和含質(zhì)量百分比為10-30%血清白蛋白的生理鹽水組成，所述注射劑可根據(jù)不同細(xì)胞數(shù)來(lái)決定含血清白蛋白的生理鹽水的添加量，做成不同規(guī)格的產(chǎn)品。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明采用IV型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合、I型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合，利用不同類(lèi)型膠原酶的特性充分消化胎盤(pán)制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞，由此提高了所制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量和活力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射 齊U。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，取l_2ml胎盤(pán)采集液做無(wú)菌檢測(cè)，然后將胎盤(pán)包膜除去剪取胎盤(pán)組織，將剪碎的胎盤(pán)組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤(pán)組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤(pán)組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到試劑瓶?jī)?nèi)，按胎盤(pán)與膠原酶體積比6:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 1%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 05%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化45min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶?jī)?nèi)，同樣按胎盤(pán)與膠原酶體積比6:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 1%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 05%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化30min。
消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中。合并第一濾液和第二濾液，以800g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細(xì)胞(沉淀部分)。將收集的細(xì)胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液中，650g密度梯度離心15min，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液。將收集的白膜層細(xì)胞液先用400g的離心力離心5min，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞(沉淀部分)。將最后得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。實(shí)施例2 :細(xì)胞數(shù)量和活力的對(duì)比用與實(shí)施例I相同來(lái)源、體積的胎盤(pán)分別用現(xiàn)有的研磨法、單一膠原酶法來(lái)制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞，其中涉及到重懸、洗滌、離心等步驟的地方均與實(shí)施例I中一致，在單一膠原酶法中，所采用的單一膠原酶消化液的量和膠原酶質(zhì)量百分比均與實(shí)施例I中對(duì)應(yīng)的膠原酶消化液的量和膠原酶質(zhì)量百分比相同，最后對(duì)這幾種方法制備出的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量和活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表I。表I細(xì)胞數(shù)量和活力
IV型膠原酶 II型膠原酶 I型膠原酶研磨法實(shí)施例I法
法法法
造血干細(xì)胞
3.21 X IO6 6.34 X IO6 4.32 x IO6 5.21 乂 IO6 2.50 x IO7
數(shù)量(個(gè))______
造血干細(xì)跑
65°/o83%78%80%92%
活力(％) _____由上表可以看出，采用本發(fā)明多種膠原酶聯(lián)合消化法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的數(shù)量均高于其他幾種方法制備的細(xì)胞數(shù)量，而且在細(xì)胞活力上也比較高。
實(shí)施例3 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，取l_2ml胎盤(pán)采集液做無(wú)菌檢測(cè)，然后將胎盤(pán)包膜除去剪取胎盤(pán)組織，將剪碎的胎盤(pán)組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤(pán)組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤(pán)組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到試劑瓶?jī)?nèi)，按胎盤(pán)與膠原酶體積比10:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 2%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 1%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化35min。 消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶?jī)?nèi)，同樣按胎盤(pán)與膠原酶體積比10:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 2%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 1%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化25min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以IOOOg離心力離心lOmin，棄去上清，收集細(xì)胞(沉淀部分)。將收集的細(xì)胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液中，500g密度梯度離心20min，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液。將收集的白膜層細(xì)胞液先用700g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用500g的離心力離心5min，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞(沉淀部分)。將最后得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)施例制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量在IO7數(shù)量級(jí)，活力高于92%，而其他制備方法的細(xì)胞數(shù)量在IO6數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活力低于85%。實(shí)施例4 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，取l_2ml胎盤(pán)采集液做無(wú)菌檢測(cè)，然后將胎盤(pán)包膜除去剪取胎盤(pán)組織，將剪碎的胎盤(pán)組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤(pán)組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤(pán)組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到試劑瓶?jī)?nèi)，按胎盤(pán)與膠原酶體積比3:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 02%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 01%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化60min。
消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶?jī)?nèi)，同樣按胎盤(pán)與膠原酶體積比3:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 02%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 01%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化40min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50 -300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以600g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細(xì)胞(沉淀部分)。將收集的細(xì)胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液中，600g密度梯度離心18min，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液。將收集的白膜層細(xì)胞液先用600g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用400g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞(沉淀部分)。將最后得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)施例制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量在IO7數(shù)量級(jí)，活力高于92%，而其他制備方法的細(xì)胞數(shù)量在IO6數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活力低于85%。實(shí)施例5 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，取l_2ml胎盤(pán)采集液做無(wú)菌檢測(cè)，然后將胎盤(pán)包膜除去剪取胎盤(pán)組織，將剪碎的胎盤(pán)組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤(pán)組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤(pán)組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到試劑瓶?jī)?nèi)，按胎盤(pán)與膠原酶體積比7:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 15%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 07%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化40min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶?jī)?nèi)，同樣按胎盤(pán)與膠原酶體積比7:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 15%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 07%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化30min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以500g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細(xì)胞(沉淀部分)。將收集的細(xì)胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液中，700g密度梯度離心14min，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液。將收集的白膜層細(xì)胞液先用550g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用400g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞(沉淀部分)。將最后得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)施例制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量在IO7數(shù)量級(jí)，活力高于92%，而其他制備方法的細(xì)胞數(shù)量在IO6數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活力低于85%。實(shí)施例6 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞
選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測(cè)陰性且無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤(pán)，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。術(shù)前準(zhǔn)備無(wú)菌聚苯乙烯儲(chǔ)液瓶作為運(yùn)送瓶，內(nèi)裝市售細(xì)胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時(shí)內(nèi)送到制備處分離制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，取l_2ml胎盤(pán)采集液做無(wú)菌檢測(cè)，然后將胎盤(pán)包膜除去剪取胎盤(pán)組織，將剪碎的胎盤(pán)組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤(pán)組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤(pán)組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到試劑瓶?jī)?nèi)，按胎盤(pán)與膠原酶體積比4:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 06%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 03%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化50min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶?jī)?nèi)，同樣按胎盤(pán)與膠原酶體積比4:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 06%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 03%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化35min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以750g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細(xì)胞(沉淀部分)。將收集的細(xì)胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液中，800g密度梯度離心lOmin，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液。將收集的白膜層細(xì)胞液先用500g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞(沉淀部分)。將最后得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽(yáng)性，⑶45陰性細(xì)胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細(xì)胞。按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)施例制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量在IO7數(shù)量級(jí)，活力高于92%，而其他制備方法的細(xì)胞數(shù)量在IO6數(shù)量級(jí)，細(xì)胞活力低于85%。實(shí)施例7 :胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑的制備
用含20% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實(shí)施例I制備的造血干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4 X IO7個(gè)/mL分裝到細(xì)胞保存袋內(nèi)，制成胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑。實(shí)施例8 :胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑的制備用含30% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實(shí)施例4制備的造血干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2 X IO7個(gè)/mL分裝到細(xì)胞保存袋內(nèi)，制成胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑。實(shí)施例9 :胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑的制備用含10% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實(shí)施例6制備的造血干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3 X IO7個(gè)/mL分裝到細(xì)胞保存袋內(nèi)，制成胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑。
以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、將胎盤(pán)預(yù)處理后，用IV型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，分別收集第一濾液和第一濾渣，所述IV型膠原酶消化液中IV型膠原酶質(zhì)量百分比為0.02-0. 2%，所述II型膠原酶消化液中II型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 01-0. 1% ； 步驟2、將所述第一濾渣用I型膠原酶消化液和步驟I所述II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，分別收集第二濾液和第二濾渣，所述I型膠原酶消化液中I型膠原酶質(zhì)量百分比為 0. 02-0. 2% ； 步驟3、合并第一濾液和第二濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將得到的重懸液加至人淋巴細(xì)胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液并離心，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤(pán)與IV型膠原酶消化液的體積比為6:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤(pán)與II型膠原酶消化液的體積比為6:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤(pán)與I型膠原酶消化液的體積比為6:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，在步驟I之后、步驟2之前還包括以下步驟 將所述第一濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第一濾液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，在步驟2之后、步驟3之前還包括以下步驟 將所述第二濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第二濾液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述白膜層細(xì)胞液的離心具體為 將所述白膜層細(xì)胞液先用400-700g的離心力離心5-10min，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300_500g的離心力離心5-10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述消化為在37°C恒溫條件下消化20-60min。
9.權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述制備方法制備的胎盤(pán)造血干細(xì)胞。
10.一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑，其特征在于，由權(quán)利要求9所述胎盤(pán)造血干細(xì)胞和含質(zhì)量百分比為10-30%人血白蛋白的生理鹽水組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種胎盤(pán)造血干細(xì)胞及其制備方法和胎盤(pán)造血干細(xì)胞注射劑。該制備方法將胎盤(pán)預(yù)處理后，用Ⅳ型膠原酶消化液和Ⅱ型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，分別收集第一濾液和第一濾渣；將所述第一濾渣用Ⅰ型膠原酶消化液和步驟1所述Ⅱ型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過(guò)濾，收集第二濾液；合并兩次濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將重懸液加至人淋巴細(xì)胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細(xì)胞液并離心，棄上清后即得胎盤(pán)造血干細(xì)胞。本發(fā)明采用Ⅳ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合，利用不同膠原酶的特性充分消化胎盤(pán)制備造血干細(xì)胞，提高了所制備的造血干細(xì)胞的數(shù)量和活力。
文檔編號(hào)A61K35/50GK102660499SQ20121016240
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者呂康濤, 李春波 申請(qǐng)人:鄭州賽英科干細(xì)胞技術(shù)有限公司