專利名稱：非小細胞肺癌中miR-10a基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非小細胞非癌中miRNA基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微 RNA( microRNA，miRNA )功能調(diào)控是當前生命科學的重要前沿。微RNA是一類長度為21-22 nt的非編碼RNA分子，其通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默調(diào)控靶基因的活性。通過對miRNA生物學功能及其調(diào)控的靶基因的研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用，miRNA很有可能成為癌癥治療新的途徑。miRNA與靶基因mRNA的非編碼序列(3' -UTR或5' -UTR)存在著一對多的關(guān)系。miRNA通常是在細胞核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，初產(chǎn)物為pri一miRNA, pri一miRNA被核酸酶RNase III Drosha和其輔助因子Drasha加工成為發(fā)卡型前體miRNA(pre—miRNA),pre一miRNA被轉(zhuǎn)運蛋白Exportin 5從細胞核輸出到細胞質(zhì)，之后被Dicer酶復合物剪切成為短的miRNA雙鏈，在解旋酶的幫助下miRNA雙鏈被解離，成熟的miRNA和RNA誘導的沉默復合體(RISC)結(jié)合。miRNA與RISC的復合體通過堿基配對可與靶基因mRNA 3' - UTR中的互補序列相結(jié)合，隨即依據(jù)miRNA與其靶基因序列的互補性高低，或是抑制蛋白質(zhì)翻譯延伸，或是引發(fā)mRNA降解，從而負調(diào)控靶基因的表達。肺癌是導致全球癌癥死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬，并且每年新增病例120萬。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常見的癌癥,其中約80%的肺癌是非小細胞肺癌(non- small cell lung cancer, NSCLC)，其5年存活率僅為15%，主要原因是缺乏有效的針對肺癌的早期診斷和治療手段。miRNA通過調(diào)控靶基因mRNA的翻譯，在肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。miRNA可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進程相關(guān)的標記物，有助于疾病的準確診斷及個性化治療。這一切設(shè)想的實現(xiàn)必須建立在miRNA靶基因功能研究工作的基礎(chǔ)上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種非小細胞肺癌中miR-lOa基因在抑制癌細胞的增殖中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于提供一種miR-lOa基因在促進癌細胞的凋亡中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供一種miR-lOa基因在下調(diào)H1299細胞系中非小細胞肺癌旁組織的表達中應(yīng)用。本發(fā)明首先分別從正常肺組織和非小細胞肺癌的肺組織中提取RNA。通過反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建二者的cDNA文庫，利用solexa測序技術(shù)，得到二者的miRNA表達圖譜。第二步，分析得到的數(shù)據(jù)，鑒定出二者有顯著表達差異的miRNA，并從中選擇了miR-10ao第三步，利用qRT-PCR的技術(shù)檢測多種非小細胞肺癌細胞系中的miR-lOa的表達量變化，并從中選擇一種miR-10a表達下調(diào)的非小細胞肺癌細胞系,在此細胞系中過表達miR-lOa以檢測其功能。
第四步，利用流式細胞儀技術(shù)和MTS技術(shù)，分別檢測過表達HiiR-IOa后H1299細胞的凋亡和增殖情況的變化。第五步,通過Targetscan軟件預測miR-lOa的祀基因，并將其m RNA的3' -UTR連接pGL-3載體。將miR-lOa與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293T細胞48h后檢測熒光。第六步，在H1299細胞中過表達miR-10a，檢測MAP3K7編碼的蛋白含量變化。H1299細胞系中miR-lOa基因通過與其靶基因MAP3K7的mRNA的:V -UTR互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA。結(jié)合生理生化試驗，確定了在H1299細胞系中miR-lOa與MAP3K7有相互作用。這種相互作用影響了 H1299細胞的增殖、凋亡等生命活動。本實驗通過軟件預測、solexa測序分析，并構(gòu)建載體，在HEK293T細胞中利用熒光素酶報告基因分析驗證了 MAP3K7是miR-lOa的靶基因，并在H1299細胞中利用過表達和western-blot的技術(shù),進一步驗證了該發(fā)現(xiàn)。所公開的為在H1299細胞系中MAP3K7是miR-lOa的靶基因的首次報道，該發(fā)明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，以及提供藥物靶點方面提供了一定的應(yīng)用價值?！?br>

圖I solexa測序結(jié)果
圖2 H1299細胞中miR-lOa的相對表達含量 圖3過表達miR-lOa后促進H1299細胞凋亡 圖4過表達miR-lOa后抑制H1299的增殖 圖5 MAP3K7是miR-lOa的靶基因。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于闡述本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一根據(jù)solexa測序結(jié)果,確定miR-10a抑制非小細胞肺癌生長
本發(fā)明所用到的k-ras基因突變小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化細胞所季宏斌教授課題組提供。將正常小鼠的肺組織和患有非小細胞肺癌的小鼠的肺組織取樣，用TRIZOL法裂解組織，加入氯仿，待蛋白與核酸分層，離心之后吸取上清并加入異丙醇沉淀。再次離心后以乙醇洗滌沉淀，晾干，獲得總RNA。利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建兩種組織的cDNA文庫，以oligo dt為引物進行反轉(zhuǎn)錄,通過變性反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄2步獲得后續(xù)實驗的cDNA。將樣品利用solexa方法測序(Solexa測序由華大基因公司完成)，參見圖I和圖2。利用得到的數(shù)據(jù)，分析后發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌肺組織中miR-lOa的表達顯著的下調(diào)，參見表1，說明miR-lOa具有抑制非小細胞肺癌的作用。表I miR-lOa的表達豐度及變化___
miRNANon-tumorlungtissuesNSCLC Foldchange(Log2)
權(quán)利要求
1.一種非小細胞肺癌中miR-lOa基因在抑制癌細胞的增殖中的應(yīng)用。
2.一種非小細胞肺癌中miR-lOa基因在促進癌細胞的凋亡中的應(yīng)用。
3.一種非小細胞肺癌中miR-lOa基因在下調(diào)H1299細胞系中非小細胞肺癌旁組織的表達中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非小細胞非癌中miRNA基因的應(yīng)用。H1299細胞系中miR-10a的一種靶基因，miR-10a通過與靶基因mRNA的3′-UTR互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA。結(jié)合生理生化試驗，確定了在H1299細胞系中miR-10a與MAP3K7有相互作用。這種相互作用影響了H1299細胞的增殖、凋亡等生命活動。本實驗通過軟件預測、solexa測序分析，并構(gòu)建載體，在HEK293T細胞中利用熒光素酶報告基因分析驗證了MAP3K7是miR-10a的靶基因，并在H1299細胞中利用過表達和western-blot的技術(shù)，進一步驗證了該發(fā)現(xiàn)。所公開的為在H1299細胞系中MAP3K7是miR-10a的靶基因的首次報道，該發(fā)明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，以及提供藥物靶點方面提供了一定的應(yīng)用價值。
文檔編號A61P35/00GK102743765SQ201210162999
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者侯品品, 王德韜, 金由辛, 韋嘉勵, 馬中良 申請人:上海大學