專利名稱：一種重組質(zhì)粒及其制備的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組質(zhì)粒及其制備的嗜水氣單胞菌胞外蛋白 酶重組蛋白亞單位疫苗。
背景技術(shù)：
基因克隆技術(shù)已有40多年的良好應(yīng)用，它包括把來自不同生物的基因同有自主 復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)， 從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。亞單位疫苗具有許多特點(diǎn)(1)亞單位疫苗較穩(wěn)定、費(fèi)用低、容易進(jìn)行生產(chǎn)和使 用；(2)是一類新型疫苗，是將致病菌主要的保護(hù)性免疫原存在的組分制成的疫苗。(3)去 除病原體中與激發(fā)保護(hù)性免疫無關(guān)甚或有害的成分，有效地增強(qiáng)了疫苗的免疫原性并且減 少了副作用。嗜水氣單胞菌(Ah)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要威脅之一，它是人、畜及水生動(dòng)物共 患的條件致病菌。該菌廣泛存在于水環(huán)境中，是多種水產(chǎn)動(dòng)物的主要致病菌，亦可引發(fā)人類 的腹瀉或敗血癥等，對食物安全具有威脅，并且是抑制病人免疫系統(tǒng)功能和肝功能。該菌 的致病性與其眾多的毒力因子密切相關(guān)，其中胞外蛋白酶為最常見的毒力因子之一，它具 有吞噬作用，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，與Ah的致病性和機(jī)體的免疫保護(hù)作用密切相 關(guān)，一直是研究嗜水氣單胞菌疫苗的焦點(diǎn)。而利用Ah的毒力基因胞外蛋白酶制備的重組亞 單位疫苗，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種能夠有效控制嗜水氣單胞菌感染的重組亞單位疫苗，可 為嗜水氣單胞菌的防控提供有力的支持。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3，該重組質(zhì)粒以pET32a為出發(fā)質(zhì)粒，其Kpn I和EcoR I酶切位點(diǎn)之間插入嗜水氣單胞菌的epr3基因，EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)間插入嗜水氣單 胞菌的印r2基因，其中所述的印r3基因GenBank登錄號(hào)為EU275147. I,epr2基因GenBank 登錄號(hào)為CP000462. 1。所述的重組質(zhì)粒pET32a-epr2_3優(yōu)選通過如下方法制備得到(1 )epr2和印r3基因的克隆以保藏號(hào)為CGMCC N0. 3220的嗜水氣單胞菌J-1株 的DNA為模板，分別以引物Epr2-l/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3_2通過PCR擴(kuò)增，得到印r2 基因和印r3基因，將其分別插入pMD-18T質(zhì)粒，得到pMD_18T_印r2和pMD_18T_印r3 ；(2)重組質(zhì)粒 pET32a-epr3 的構(gòu)建利用 Kpn I 和 EcoR I 對 pMD_18T_印r3 和 pET32a分別進(jìn)行雙酶切，將獲得的epr3基因酶切產(chǎn)物插入pET32a的Kpn I和EcoR I酶切 位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pET32a-epr3 ；
(3)重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3的構(gòu)建利用EcoR I和Sal I對pMD_18T_印r2和 pET32a-epr3分別進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物印r2基因插入重組質(zhì)粒pET32a_印r3的EcoR I 和Sal I酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3。含有所述的重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3的宿主。所述的宿主優(yōu)選細(xì)菌或細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選大腸桿菌BL21?！N嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2_3,所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶 重組蛋白由所述的含有重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3的重組大腸桿菌BL21所分泌。所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2_3，優(yōu)選將含有重組質(zhì)粒 pET32a-印r2-3的重組大腸桿菌BL21接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后加入0. 1M IPTG誘導(dǎo) 蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)后離心獲得菌體，超聲破碎后離心獲得上清和包涵體，對包涵體進(jìn)行變 性溶解，再分別取兩者以His親和層析柱純化重組蛋白，收集所得即為重組蛋白Epr2-3。所述的重組質(zhì)粒pET32a-epr2_3在制備嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單 位疫苗中的應(yīng)用。所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2_3在制備嗜水氣單胞菌胞外蛋白 酶重組蛋白亞單位疫苗中的應(yīng)用。一種嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗，含有所述的嗜水氣單胞菌胞 外蛋白酶重組蛋白Epr2-3及佐劑。所述的佐劑優(yōu)選弗氏完全佐劑或DC-Chol佐劑。有益效果本發(fā)明首次成功構(gòu)建了表達(dá)Ah胞外蛋白酶的重組亞單位疫苗，它突破了 Ah常規(guī) 滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具弱毒疫苗的復(fù)制性和滅活疫苗的安全性，容易通過安 全性評價(jià)。試驗(yàn)證明，本發(fā)明的構(gòu)建表達(dá)Ah重組亞單位疫苗所產(chǎn)生了針對Ah的抗體，且其抗 體滴度顯著高于滅活疫苗所產(chǎn)生的。嗜水氣單胞菌的血清型眾多，滅活疫苗的免疫效果存在局限性。而胞外蛋白酶 Epr2、Epr3是不同血清型亞型Ah中最常見的毒力因子和保護(hù)性抗原。將胞外蛋白酶基因 印r2、epr3串聯(lián)表達(dá)得到重組蛋白Epr2_3，能夠作為致病性嗜水氣單胞菌不同血清型共同 的保護(hù)性抗原，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。該亞單位疫苗生產(chǎn)工藝簡單，保存和運(yùn)輸 條件要求不高，且對動(dòng)物無任何不良影響，不會(huì)造成細(xì)菌的擴(kuò)散，是一種理想的基因工程亞 單位疫苗，在Ah的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1串聯(lián)表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a_epr2_3結(jié)構(gòu)示意圖Ori為啟動(dòng)子，Amp為載體pET32a上抗生素基因，epr2、epr3為目的基因，Kpnl、 EcoRI、SalI為酶切位點(diǎn)。圖2串聯(lián)表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3酶切檢測1 DL5000DNA Marker 2 :pET32a_印r2_3 酶切產(chǎn)物 3 pET32a-epr2-34 DL10000DNA Marker圖3重組蛋白Epr2_3的SDS蛋白電泳1 :蛋白Marker MP1022 :轉(zhuǎn)化pET32a的大腸桿菌3 :轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3的大腸桿圍圖4western blot鑒定重組蛋白Epr2_3的反應(yīng)原性M :預(yù)染蛋白Marker 1 :轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET32a_epr2_3的大腸桿菌2 :轉(zhuǎn)化pET32a 的大腸桿菌圖5間接ELISA測定免疫小鼠血清的抗體滴度可以看出重組蛋白Epr2_3免疫的小鼠血清抗體效價(jià)明顯高于其他組，能更好的 刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。圖6重組蛋白與不同佐劑配合測定免疫原性弗氏完全佐劑和DC-Chol配合重組蛋白Epr2_3的疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率高達(dá) 95%，遠(yuǎn)高于滅活組的65%。生物材料保藏信息嗜水氣單胞菌J-1株，分類命名為嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila,該菌株 已于2009年8月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地 址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏號(hào)為CGMCC N0. 3220。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1基因工程體——表達(dá)嗜水氣單胞菌(Ah)胞外蛋白酶(EPR)的重組大腸桿 菌E. coli的構(gòu)建1. epr2、epr3基因的擴(kuò)增、克隆、鑒定1. 1PCR引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)Ah標(biāo)準(zhǔn)毒株J-1的基因序列設(shè)計(jì)兩對針對印r2 (GenBank CP000462. 1)和 epr3 (GenBank EU275147. 1)的特異性引物，在引物的5’端分別漢有限制性內(nèi)切酶酶切位 點(diǎn)。因?yàn)橛缮虾nvitrogen生物公司合成。Epr2-1 5' -CCG GAA TTC ATG ACA CTC TTG CTC ACC ACC C-3' (SEQ ID No. 1)，Epr2-2 5' -GTC GAC CTA GGA GGC GGG CAG CC-3' (SEQ ID No. 2)，Epr3-1 5' -GGT ACC ATG AAA GCG ACT CCC ATT GCC C-3' (SEQ ID No. 3)，Epr3-2 5' -CCG GAA TTC TCA GTT TTC GCT CGG CGT ATT CTC-3' (SEQ ID No. 4)1. 2PCR取2*TaqPCR Mix 12. 5 u l,epr2-12u l,epr2-22u 1，嗜水氣單胞菌 J_1 株(CGMCC NO. 3220)菌液4 u 1，用無菌超純水補(bǔ)至總體積25 yl。在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)為 95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后72°C 延伸5min。對印r3-l的操作方法同上，循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 2% (g/ ml)瓊脂糖凝膠電泳。1. 3PCR產(chǎn)物回收與純化PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，用 DNA快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段。具體操作步驟按Geneaid公司凝膠回收 試劑盒的說明書進(jìn)行。1. 4PCR產(chǎn)物的酶切純化酶切反應(yīng)總體積為50iU，PCR后，印r2回收片段41iU，10XT buffer 5u 1,EcoRI2u l,SalI2u 1. 37°C作用3. Oh，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒對酶切后產(chǎn)物 進(jìn)行回收，方法同上。印r3回收片段41iU，10XT buffer 5 yl，KpnI2 yl，EcoRI2 yl，其 余操作同印r2。1. 5pMD-18T和pET32a的酶切純化酶切反應(yīng)總體積為50 u 1，分別對pMD-18T和pET32a兩質(zhì)粒進(jìn)行酶切純化，質(zhì)粒 41u l,10XTbuffeer 5u 1, EcoRI 2u 1, SalI2u 1D 37°C作用 3. 0h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳回收試劑盒對酶切后產(chǎn)物進(jìn)行回收，方法同上。以同樣的方法用Kpnl和EcoRI對兩質(zhì) 粒進(jìn)行酶切并回收產(chǎn)物。1. 6目的片段印r2、epr3與pET32a的連接epr3的酶切回收PCR產(chǎn)物6. 0 y L，載體pMD_18T酶切回收產(chǎn)物2. 0 y L，10XT4 連接酶緩沖液l.OiiL，T4DNA連接酶l.OiiL，混勻各產(chǎn)物后在16°C連接過夜，獲得 PMD-18T-印r3，以相同方法獲得pMD-18T-印r2。將兩連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a。提 取pMD-18T-印r3，并對pMD_18T_印r3用EcoRI和Kpnl進(jìn)行酶切，方法同上，再將酶切所獲 得的目的片段克隆進(jìn)經(jīng)pET32a表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)化E. coli BL21，獲得pET32a_印r_3.對 其進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序。接著提取之前獲得的pMD-18T-印r2，并對pMD_18T_印r2用 EcoRI和Sail進(jìn)行酶切，方法同上，將酶切所得目的片段克隆入pET32a-印r-3，然后轉(zhuǎn)化 E.coli BL21，最終獲得重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3 (圖1)。1. 7大腸桿菌DH5 a和BL21感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化pET32a-epr2-3轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，得到轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3的重組 大腸桿菌。上述步驟中使用的DH5 a和BL21感受態(tài)細(xì)菌的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過程詳見 分子克隆。1. 8重組質(zhì)粒的提取和鑒定用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3并用PCR和雙酶切鑒定，在PCR 和雙酶切鑒定(圖2)中都可以見到目的條帶。1. 9目的基因印r2_3序列分析測序工作由invitrogen公司協(xié)助完成。用NCBI BLAST將所測得的序列與 GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的 epr2 (GenBank CP000462. 1)和印r3 (GenBank EU275147. 1)進(jìn)行同 源性比較，表明了我們所克隆入的基因與嗜水氣單胞菌J-1株基因的堿基序列完全一致， 而且克隆入的基因完全符合載體閱讀框要求。實(shí)施例2.重組蛋白的表達(dá)、鑒定和純化2. 1重組蛋白Epr2_3的表達(dá)實(shí)施例1中經(jīng)鑒定呈陽性的重組大腸桿菌菌液接種于5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)14-16h。取新鮮菌液重新接種于200mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm 振蕩培養(yǎng)4h，至0D600=0. 6 ;加入0. 1M IPTG至終濃度lmmol/L，連續(xù)振蕩培養(yǎng)4h ;取出菌 液至1. 5 u L離心管中，4°C 13000rpm離心2min,離心后的菌體用40 u LPBS (ph=7. 2)重懸, 并加入10iiL 5XSDS上樣緩沖液；加熱煮沸至100°C 10min，13000rpm離心2min。取10 y L 裂解物進(jìn)行SDS電泳，先80V電泳30min，然后120V。電泳以后考馬斯亮藍(lán)G250染色2h，然 后每一小時(shí)脫色一次，一共3次。采用Biorad2000對蛋白膠進(jìn)行拍照，可見到目的條帶(圖 3),與標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker作對比，可判定其大小。
2. 2重組蛋白Epr2_3的純化2. 1中培養(yǎng)所得的陽性菌體4°C振蕩培養(yǎng)10min，PBS重懸并保存于_80°C。凍存的 菌體在用PBS重懸前需凍融3次，然后用300W功率進(jìn)行5s的超聲波破碎，間隔15s，進(jìn)行60 個(gè)循環(huán)。超聲波過后，4°C下4000 Xg離心lOmin,可見溶解有epr2_3蛋白的上清液及不溶 的包涵體。包涵體在4°C下變性液中反應(yīng)2h，并4°C下12000Xg離心15min。用20mL PBS 緩沖液重懸，然后用超聲波破碎儀破碎后再離心。分別取上清和包涵體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳進(jìn)行檢測，并以His親和層析柱純化重組蛋白，并以BIO-RAD (Smart Spec TM3000)測 定收集蛋白的濃度。2. 3. western blot鑒定重組蛋白Epr2_3的反應(yīng)原性純化后的重組蛋白Epr2-3進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE膠切開， 標(biāo)記后放入膜轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡30min ;取略小的PVDF膜，甲醇浸15s后放入膜轉(zhuǎn)印緩沖 液中浸泡15min ;取略小的濾紙2張放入膜轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡數(shù)分鐘。依次將濾紙、PVDF 膜、SDS-PAGE膠、濾紙重疊置于半干轉(zhuǎn)印槽上，趕掉氣泡后調(diào)整電流至0. 8mA/cm2,轉(zhuǎn)印2h。 轉(zhuǎn)印完畢后PVDF膜用5%脫脂奶封閉，置37°C搖床中50rpm過夜。將膜放入含1 :1000稀 釋的含一抗(鼠源Ah J-1株全菌血清)的封閉液中置37°C搖床中50rpm作用lh ;將膜取出 用TBST洗三遍，每次5min ;再將膜放入含1 :10000稀釋的含酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG)的封閉液中，同樣條件作用lh ;再用TBST洗三遍，每次5min ;將膜放入沉淀型TMB單 組份底物顯色液中，室溫避光作用lOmin。設(shè)置的陰性對照組為空載體pET32a轉(zhuǎn)化到BL21 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)所得產(chǎn)物。結(jié)果(圖4)表明目的蛋白Epr2-3有較高效率的表達(dá)，而在陰性對 照和空白對照中則沒有目的蛋白出現(xiàn)。實(shí)施例3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3. 1用嗜水氣單胞菌J-1株測定ICR小鼠的半數(shù)致死量80只四周齡大的ICR雌鼠被隨機(jī)分成8組，每組10只。將嗜水氣單胞菌J_1株 (CGMCC N0. 3220)接種至LB液體培養(yǎng)基中并且在28°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。收集菌體 并將其用lOmMPBS (ph=7. 2)溶液中稀釋至濃度為2. 5X 103CFU/ml。1-7組小鼠用0. 2mL細(xì) 菌注射，記錄死亡數(shù)。第8組注射PBS作為空白對照組。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。結(jié)果見表1。表權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3，其特征在于該重組質(zhì)粒以pET32a為出發(fā)質(zhì)粒，其Kpn I和EcoR I酶切位點(diǎn)之間插入嗜水氣單胞菌的印r3基因，EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)間插 入嗜水氣單胞菌的印r2基因，其中所述的印r3基因GenBank登錄號(hào)為EU275147. 1，epr2 基因GenBank登錄號(hào)為CP000462. 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET32a-epr2-3,其特征在于該質(zhì)粒通過如下方法 制備得到(1)epr2和epr3基因的克隆以保藏號(hào)為CGMCCN0. 3220的嗜水氣單胞菌J-1株的DNA 為模板，分別以引物Epr2-l/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3_2通過PCR擴(kuò)增，得到印r2基因 和印r3基因，將其分別插入pMD-18T質(zhì)粒，得到pMD_18T_印r2和pMD_18T_印r3 ；(2)重組質(zhì)粒pET32a-印r3的構(gòu)建利用KpnI和EcoRI對pMD_18T_印r3和pET32a分 別進(jìn)行雙酶切，將獲得的epr3基因酶切產(chǎn)物插入pET32a的Kpn I和EcoRI酶切位點(diǎn)之間， 得到重組質(zhì)粒pET32a-epr3 ；(3)重組質(zhì)粒pET32a-epr2-3 的構(gòu)建利用 EcoRI 和 Sail 對 pMD-18T-epr2 和 pET32a-epr3分別進(jìn)行雙酶切，將獲得的酶切產(chǎn)物印r2基因插入重組質(zhì)粒pET32a_印r3的 EcoR I and Sal I酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pET32a_印r2_3。
3.含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3的宿主。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主，其特征在于所述的宿主為細(xì)菌或細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌 BL21。
5.—種嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3,其特征在于所述的嗜水氣單胞菌 胞外蛋白酶重組蛋白由權(quán)利要求4所述的含有重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3的重組大腸桿菌 BL21所分泌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3，其特征在于將含 有重組質(zhì)粒pET32a-印r2-3的重組大腸桿菌BL21接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后加入0. 1 MIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)后離心獲得菌體，超聲破碎后離心獲得上清和包涵體，對包 涵體進(jìn)行變性溶解，再分別取兩者以His親和層析柱純化重組蛋白，收集所得即為重組蛋 白。
7.權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET32a-epr2-3在制備嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋 白亞單位疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3在制備嗜水氣單胞菌 胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗中的應(yīng)用。
9.一種嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求5所 述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3及佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗，其特征在 于所述的佐劑為弗氏完全佐劑或DC-Chol佐劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組質(zhì)粒及其制備的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗。重組質(zhì)粒pET32a-epr2-3，該重組質(zhì)粒以pET32a為出發(fā)質(zhì)粒，其Kpn I和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入嗜水氣單胞菌的epr3基因，EcoR I and Sal I酶切位點(diǎn)間插入嗜水氣單胞菌的epr2基因。所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗包含將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pET32a-epr2-3的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)所獲得的重組蛋白epr2-3與佐劑。實(shí)驗(yàn)證明該亞單位疫苗具有較高的安全性，生產(chǎn)工藝簡單，保存和運(yùn)輸條件要求不高，并且能夠刺激機(jī)體全方面的免疫應(yīng)答，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102719466SQ201210164228
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者吳蕾, 姚火春, 潘子豪, 蔣亞楠 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)