專利名稱：一種制備半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向于肝臟的藥物的制備方法，尤其涉及一種用于治療肝癌的靶向藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，目前肝癌的首選治療是肝移植，但價(jià)格昂貴，供體短缺，導(dǎo)致大多數(shù)患者在等待供肝過程中死亡。化療是治療腫瘤的又一主要手段，但是現(xiàn)有抗癌藥物，生物利用率低，在殺傷肝癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也有較大毒副作用，并嚴(yán)重抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致患者常死于化療藥物的并發(fā)癥，因此，治療過程中，患者普遍有明顯的惡心嘔吐等副作用，給患者帶來不適感。 5-氟尿嘧啶(5-FU，又稱氟尿嘧啶)屬細(xì)胞周期特異性藥物，它在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏っ撗鹾塑账?，并與胸腺嘧啶核苷合成酶特異結(jié)合，起到干擾RNA、DNA及蛋白質(zhì)生物合成的作用，因此，5-FU具有抗瘤譜廣，療效顯著等特點(diǎn)，臨床上主要用于肝癌，胃癌、胰腺癌、乳腺癌等的治療。如專利CN100337631C公開的氟尿嘧啶注射乳劑、CN1957922A公開的載有5-FU和增效劑的緩釋注射劑、專利CN1666747A公開的含5-FU的果糖注射液、以及專利CN1318430C公開的三(5-氟尿嘧啶)稀土配合物，均可用于治療肝癌，并取得了較好的療效。然而，由于腫瘤組織與正常組織之間核酸合成代謝的拮抗作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，導(dǎo)致5-FU的特異選擇性小，對(duì)增殖快的正常組織也有影響，較常見的有骨髓抑制及胃腸道反應(yīng)等毒副作用。同時(shí)，5-FU還具有體內(nèi)代謝快、有效期短的弱點(diǎn)，需要大劑量長(zhǎng)時(shí)間靜脈滴注給藥來達(dá)到體內(nèi)的有效濃度及作用維持時(shí)間。另外，5-FU的吸收不規(guī)則，若體內(nèi)濃度過高時(shí)會(huì)發(fā)生毒副反應(yīng)，給病人帶來很大痛苦。這些缺陷使得5-FU在臨床應(yīng)用上受到較大限制。1906年Ehrilich首先提出靶向給藥的概念，后來發(fā)展為靶向給藥系統(tǒng)和靶向治療。肝癌的靶向治療，主要通過兩種機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)肝癌藥物的靶向傳輸被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向。被動(dòng)靶向是通過對(duì)納米載體的理化性質(zhì)(大小、形狀、親水性、表面電荷和囊壁孔徑等)，進(jìn)行控制和修飾，可調(diào)控其在體內(nèi)的分布和藥物釋放特性，或選用對(duì)機(jī)體各種組織和病變親和力不同，使納米粒達(dá)到靶向運(yùn)輸目的[3]。主動(dòng)靶向是將配體、結(jié)合位點(diǎn)或抗體等特異性的靶向分子偶聯(lián)至納米粒子表面而使藥物定向分布到靶組織。隨著生物醫(yī)藥與納米技術(shù)相互融合集成，誕生了納米生物醫(yī)藥技術(shù)。其中靶向納米藥物載體技術(shù)由于其特異性強(qiáng)、效果顯著，避免了對(duì)正常組織的損傷，同時(shí)保護(hù)藥物不被降解，為人類提高現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物利用度，降低毒副作用提供了理想的解決方案
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備具有肝臟靶向性的、治療肝癌的藥物的方法，即制備半乳糖基殼聚糖/5-氟尿喃唳納米粒的方法。本發(fā)明所述制備半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒的方法，步驟包括步驟1，提供半乳糖基殼聚糖(GC)納米材料，將GC納米材料溶于有機(jī)酸，并調(diào)節(jié)pH值至5 6. 5，加水至GC質(zhì)量濃度為0. 01 0. 05% ;所述有機(jī)酸為Cl C5的脂肪酸，可以是一元羧酸或多元羧酸，或其混合物。步驟2，將5-FU硫酸鹽溶液與步驟2中制備的GC溶液混合，混懸，得到GC/5-FU納米顆粒。其中步驟I中所述有機(jī)酸優(yōu)選為C2 C4的脂肪酸，如乙酸、丙酸等。步驟I中優(yōu)選調(diào)節(jié)pH值至5 6，更優(yōu)選為調(diào)節(jié)至5. 5 6，如5. 7、5. 8、5. 9。調(diào)節(jié)PH值所用堿優(yōu)選為Na0H、K0H、氨水、或其中任意幾種的混合物。更優(yōu)選地，調(diào)節(jié)pH值時(shí)，還可以加入有機(jī)酸羧酸鹽，如乙酸鈉、乙酸鉀、或其中任意幾種的混合物。步驟2中，所述5-FU硫酸鹽溶液中，硫酸鹽優(yōu)選為硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、或其中任意幾種的混合物。步驟2中，5-FU與GC質(zhì)量比優(yōu)選為5 20 I，更優(yōu)選為5 15 I，更優(yōu)選為7 13 1，如 8 1、9 UlO 1、11 1、12 I。步驟2中，5-FU與GC混合后的溶液中，5-FU濃度優(yōu)選為I 5mg/ml、更優(yōu)選為
I.5 3mg/ml、更優(yōu)選為I. 5 2. 5mg/ml、最優(yōu)選為I. 5 2mg/ml。步驟2中，所述懸混優(yōu)選為在漩渦振蕩器上進(jìn)行，轉(zhuǎn)速優(yōu)選為2500rpm ;懸混時(shí)間優(yōu)選為20s lmin，更優(yōu)選為20s 50s，更優(yōu)選為20s 40s，如30s、35s。根據(jù)本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，步驟I中，半乳糖基殼聚糖納米材料制備方法優(yōu)選為乳糖酸溶于酸性緩沖液，在偶聯(lián)劑存在的條件下，與殼聚糖反應(yīng)，制備得到GC納米材料。其中，所述偶聯(lián)劑如碳二亞胺，所述碳二亞胺可以是來自碳二亞胺鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽等，優(yōu)選的碳二亞胺如I-乙基-3 (3- 二甲氨丙基)碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、或其鹽(如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽等)、或其衍生物(如乙二醇雙(琥珀酰亞胺基丁二酸)、N-(馬來酰亞胺烷酰氧基)琥珀酰亞胺酯)，可以是其中的任意一種或幾種的混合物。所述緩沖溶液優(yōu)選為四甲基乙二胺(TEMED，或TMEDA)酸性緩沖液，pH值優(yōu)選為3 6，更優(yōu)選為3 5，更優(yōu)選為4 5，更優(yōu)選為4. 5 5，如4. 6,4. 7,4. 8,4. 9。所述四甲基乙二胺酸性緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH值所用的酸可以是有機(jī)酸、無機(jī)酸，或其混合物，并優(yōu)選為無機(jī)酸、或無機(jī)酸與有機(jī)酸的混合物。應(yīng)當(dāng)理解的是，這里述的酸包括酸式鹽在內(nèi)。所述無機(jī)酸如鹽酸、硫酸、硝酸、硫酸氫鹽、磷酸、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、氫溴酸等，可以是其中的任意一種或幾種的組合。所述鹽優(yōu)選為鈉鹽、鉀鹽、或其混合物。其中，乳糖酸與殼聚糖重量比優(yōu)選為0. 5 2 1，更優(yōu)選為I 2 I。 其中，偶聯(lián)劑與殼聚糖重量比優(yōu)選為0.01 0.5 I。根據(jù)本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施例，其中，步驟I中，將GC納米材料、乙酸鈉溶于乙酸的方法為將GC納米材料溶于乙酸，放置10 20h，加入乙酸鈉，殼聚糖終濃度為2mM。根據(jù)本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施例，其中，步驟2中，懸混后，將產(chǎn)物放置一段時(shí)間，以促進(jìn)顆粒的形成，放置時(shí)間優(yōu)選為20min Ih,更優(yōu)選為20min 50min,如25min、30min、35min、40min、45mino本發(fā)明還提供了一種上述方法制備的具有肝臟靶向性的負(fù)載5-FU的GC納米顆粒。本發(fā)明上述納米顆粒的平均粒徑優(yōu)選為30 40nm。本發(fā)明還提供了所述負(fù)載5-FU的GC納米顆粒在治療肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種制備具有肝臟靶向性的GC/5-FU的方法，藥物包封率大于80%，載藥率大于15%，Zeta電勢(shì)在10 IlmV之間，所制備的藥物具有良好的緩釋效果，體外實(shí)驗(yàn)表明對(duì)肝癌細(xì)胞具有較其它藥物更強(qiáng)的殺傷作用，體內(nèi)分別檢測(cè)表明，肝癌組織中5-FU濃度較肝臟和其它正常組織明顯提高，即具有良好的肝癌細(xì)胞靶向性。


圖I為本發(fā)明所述方法制備的半乳糖基殼聚糖/5-FU納米顆粒SEM照片；圖2為本發(fā)明所述方法制備的半乳糖基殼聚糖/5-FU納米顆粒粒徑分布圖；圖3為GC/5-FU在模擬體液(37°C，pH=7. 4)的體外釋放曲線；圖4 為 5-FU 和 GC/5-FU 對(duì) SW480 和 SMMC-7721 的 IC50 對(duì)比；圖5A為尾靜脈分別注射5-FU、CS/5-FU、GC/5-FU后不同組織中5-FU水平；圖5B為肝癌與各組織中5-FU濃度比值；圖6A為GC/5-FU、5-FU、GC治療后腫瘤重量對(duì)比；圖6B為GC/5_FU、5_FU、GC治療后小鼠存活率對(duì)比；圖7為GC/5-FU、5_FU、GC治療后肝癌組織凋亡指數(shù)對(duì)比；其中*代表如GC或control組比，P〈0. 01 ; * *代表與5-FU組相比P〈0. 01。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I乳糖酸I. 5g溶于25ml TEMED/HC1緩沖液(pH值4. 7)中，然后加入0. 07gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.3g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)Ug殼聚糖，室溫下反應(yīng)72h，冷凍干燥，制備得到半乳糖基殼聚糖(GC)納米材料。GC納米材料用乙酸溶解，過夜，加入乙酸鈉，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 7，加入水至GC濃度為0. 02%，無菌微孔過濾器進(jìn)行過濾除菌。按照5-FU與GC質(zhì)量比為10 :1，取溶于4. 5ml硫酸鈉溶液(濃度50nM)，配成5ml溶液，與制備的GC溶液混合，置于漩渦振蕩器上(2500rpm)混懸30s，產(chǎn)物室溫放置30min，以進(jìn)一步促進(jìn)顆粒形成，得到負(fù)載5-FU的GC納米顆粒(GC/5-FU納米顆粒)。經(jīng)過測(cè)試和計(jì)算，本實(shí)施例制備的GC/5-FU納米顆粒載藥率(納米粒中5_FU重量含量)達(dá)16. I %，包封率(納米粒中5-FU占制備過程中投入藥物總重量的比)達(dá)81. 82%，Zeta 電勢(shì)為 +10. 34mV0實(shí)施例2、
乳糖酸I. 2g溶于25ml TEMED/HC1緩沖液(pH值4. 7)中，然后加入0. 05gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.4g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)Ug殼聚糖，室溫下反應(yīng)70h，冷凍干燥，制備得到半乳糖基殼聚糖(GC)納米材料。GC納米材料用乙酸溶解，過夜，加入乙酸鈉，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 7，加入水至GC濃度為0. 02%，無菌微孔過濾器進(jìn)行過濾除菌。按照5-FU與GC質(zhì)量比為8 1，取溶于4. 5ml硫酸鈉溶液(濃度50nM)，配成5ml溶液，與制備的GC溶液混合，置于漩渦振蕩器上(2500rpm)混懸30s，產(chǎn)物室溫放置30min，以進(jìn)一步促進(jìn)顆粒形成，得到負(fù)載5-FU的GC納米顆粒(GC/5-FU納米顆粒)。經(jīng)過測(cè)試和計(jì)算，本實(shí)施例制備的GC/5-FU納米顆粒載藥率達(dá)15. 4%，包封率達(dá)82. 02%, Zeta 電勢(shì)為 +10. 30mV。 實(shí)施例3乳糖酸2. Ig溶于25ml TEMED/HC1緩沖液(pH值4. 7)中，然后加入0. 08gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0. 3g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)、1. Ig殼聚糖，室溫下反應(yīng)70h，冷凍干燥，制備得到半乳糖基殼聚糖(GC)納米材料。GC納米材料用乙酸溶解，過夜，加入乙酸鉀，用KOH調(diào)節(jié)pH值至5. 7，加入水至GC濃度為0. 02%，無菌微孔過濾器進(jìn)行過濾除菌。按照5-FU與GC質(zhì)量比為15 1，取溶于4. 5ml硫酸鉀溶液(濃度50nM)，配成5ml溶液，與制備的GC溶液混合，置于漩渦振蕩器上(2500rpm)混懸30s，產(chǎn)物室溫放置30min，以進(jìn)一步促進(jìn)顆粒形成，得到負(fù)載5-FU的GC納米顆粒(GC/5-FU納米顆粒)。經(jīng)過測(cè)試和計(jì)算，本實(shí)施例制備的GC/5-FU納米顆粒載藥率達(dá)16. 4%，包封率達(dá)80. 75%, Zeta 電勢(shì)為 +10. 32mV。以實(shí)施例I中得到的GC/5-FU為例，進(jìn)行性能檢測(cè)，方法如下GC/5-FU納米粒特征圖I顯示了 SEM觀察本發(fā)明制備的GC/5-FU的照片，圖2為本發(fā)明制備的GC/5-FU粒徑分布圖,可以看出，本發(fā)明制備的GC/5-FU納米顆粒平均粒徑(35. 1±4. 5) mm,呈正態(tài)分布，納米顆粒為規(guī)則的球形，表面光滑，大小均勻，納米間無粘連?，F(xiàn)已知大多數(shù)正常組織的血管內(nèi)皮的孔徑為2nm，毛細(xì)血管后微靜脈的孔徑為6nm,而不連續(xù)的腫瘤血管的孔徑為100 780nm,本組納米粒的粒徑控制在35. Inm左右,這樣不僅可以使載藥納米顆粒進(jìn)入腫瘤間隙，還可以避免納米顆粒進(jìn)入正常組織。GC/5-FU納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)稱取GC/5-FU納米粒20mg裝入透析袋內(nèi)，加入少量pH值為7. 4的模擬體液(SBF)形成混懸液，然后置于15ml SBF液中，于37°C水平恒溫振蕩器(頻率為60rpm)內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)透析;分別于0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和IOd后，取出透析液，同時(shí)補(bǔ)充15ml新鮮SBF維持原體積不變，于波長(zhǎng)265nm測(cè)定吸光度值，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線計(jì)算不同時(shí)間納米微粒釋放5-FU的量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其濃度和累積釋放量，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值，以累積釋藥百分率對(duì)時(shí)間作圖，繪制載藥納米粒的釋放曲線(見圖3)。5-FU在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率(Q)計(jì)算公式為
f-1Q(%) 二(Vb x G + X Z c)x 100%. M—1. X-1
n=l
式中Ct為各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得釋放介質(zhì)中的5-FU濃度(11^/1111)肩為投入的6(/54。米粒的質(zhì)量(mg)，V0為釋放介質(zhì)的總體積(ml)，V為每次取樣體積(ml)，X為測(cè)得GC/5-FU納米粒的載藥量(％)。從圖3中可以看出，第I天出現(xiàn)突釋，而第2 第7天逐漸釋放，7天后緩慢釋放，10天累計(jì)釋放率95. 7%，說明本發(fā)明制備的GC/5-FU具有良好的緩釋效果，并且藥物釋放時(shí)間長(zhǎng)。GC/5-FU納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果SW480和SMMC-7721均溶于含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2中常規(guī)培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成I X IO5個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以190 u I/孔接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24h后，分別加入IOiU不同濃度的5-FU和GC/5-FU納米粒，分別培養(yǎng)至I、
2、3、4、5、6、7、8、9和IOd后，每孔加入30 y g噻唑藍(lán)(MTT)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入200 u I 二甲基亞砜，振蕩IOmin后用Bio-Rad自動(dòng)微板讀數(shù)儀測(cè)定490nm的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。每個(gè)濃度組選取24、48、72h共3個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTT檢測(cè)，觀測(cè)5-FU和GC/5-FU對(duì)兩種細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制情況。并采用Bliss法I IOd計(jì)算出IC50值。根據(jù)5-FU和GC/5-FU在I IOd內(nèi)不同時(shí)相點(diǎn)對(duì)SW480與SMMC-7721的IC50，繪制時(shí)間依賴性殺傷效應(yīng)曲線(圖4)，從圖4可以看出，5-Fu的時(shí)間依賴性殺傷效應(yīng)主要在I 6d，但7d后時(shí)間依賴性殺傷效應(yīng)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期；GC/5-FU-SMMC-7721和GC/5-FU-SW480的時(shí)間依賴性殺傷效應(yīng)則從I IOd呈持續(xù)增加趨勢(shì)，并且6d后，GC/5-FU-SW480的IC50值小于5-FU-SW480和5-FU-SMMC-7721。說明本發(fā)明制備的GC/5-FU納米粒具有對(duì)腫瘤細(xì)胞持久殺傷效果。GC/5-FU納米粒抑制小鼠肝癌移棺樽型的療效觀察用小鼠肝癌細(xì)胞株(H22)建立小鼠肝癌皮下模型。將小鼠處死后解剖出腫瘤組織，挑選生長(zhǎng)旺盛新鮮的腫瘤組織，制成6X IO7個(gè)/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。20%烏垃坦腹腔麻醉后，正中切口，用Iml注射器注射50 u I腫瘤細(xì)胞懸液注入肝左葉被膜下，稍等2min至無滲出，逐層關(guān)腹。GC/5-FU納米粒體內(nèi)靶向件取血清0. 5mL分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)液配成5-FU濃度分別為0. 1,0. 2,0. 5、I. 0,5. O、20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)血清，以5-FU濃度為x軸，測(cè)得5-FU的峰面積為Y軸，進(jìn)行線性回歸。原位肝癌移植模型成模后，隨機(jī)分三組，每組5只動(dòng)物模型，予以尾靜脈分別注射劑量 200 ill (含 0. 371mg5-Fu)的 5-FU、CS/5_FU、GC/5_FU 后，30min 后處死小鼠，取動(dòng)物模型的肝癌，肝臟，脾臟，腎臟，肺，肌肉，心臟和小腸組織以生理鹽水洗凈(血液除外)、濾紙吸干、取適當(dāng)精確稱取0. 5 I. 0g，轉(zhuǎn)移到組織勻漿器，制成組織勻漿，定量吸取0. 5ml (血樣則取血清)，按預(yù)處理項(xiàng)下操作，測(cè)得各組織的5-FU的濃度。圖5A和圖5B給出了不同組織中5_FU水平，可見肝癌組織中5_FU水平最高，正常肝臟次之；肝癌組織中5-FU水平是正常肝臟的8. 69倍、是腎臟的23. 35倍、血漿的85. 15倍，可見本發(fā)明制備的GC/5-FU具有良好的肝癌靶向性。
GC/5-FU納米粒治療小鼠原位肝癌移植模型的療效觀察待小鼠原位肝癌移植模型成模后第5天，肝癌組織約4 6mm (見圖1)，將實(shí)驗(yàn)分為4組對(duì)照組(control)、納米粒組(GC)、5-Fu組(5_Fu)和5_Fu納米粒(GC/5-FU)。Control組用生理鹽水靜脈注射，劑量200 yl。GC組用空納米尾靜脈注射200 ill。5-Fu 組進(jìn)行靜脈注射，劑量 200 U I (含 0. 371mg5_Fu)。GC/5-Fu組予以GC/5-FU納米粒進(jìn)行靜脈注射，劑量200 U I (含0. 371mg5_Fu)。成模后第6天開始連續(xù)尾靜脈注射5天。成模后第15天處死部分小鼠(每組10只)，觀察各小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況、各腫瘤的平均重量。而其余各組小鼠(每組約15只)，進(jìn)行生存分析。從圖6A 可以看出，GC/5-Fu 的瘤重為(0. 4361 ±0. 1153) g，5_Fu 組為(0. 7932±0. 1283)g，GC 為(I. 3989±0. 2125)g，和 control 組為(I. 5801±0. ·2821)g，4 組瘤重之間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 01) ；GC/5-FU組和5-FU組的瘤重明顯小于GC組及control組,差異有統(tǒng)學(xué)意義(p〈0. 01) ;GC/5_FU的瘤重又顯著小于5_Fu組(p〈0. 01)。從圖6B可以看出，control組的中位生存時(shí)間為12d，GC組為13d，5-FU為17d，而GC/5-FU組最高為30d。GC/5-FU組的生存時(shí)間最長(zhǎng)(P〈0. 01)。流氏技術(shù)檢測(cè)小鼠移植性肝癌H22細(xì)胞增殖周期及凋亡從每組所取出的瘤塊中各取I 2mm3研磨制成細(xì)胞懸液，用0. lmol/L的PBS洗3次，體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定細(xì)胞沉淀，碘化丙啶染液(含質(zhì)量濃度為50mg/L)，I. 0%的TritonX-IOO和質(zhì)量濃度為10mg/L的RNaseA，4°C避光染色30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。按如下公式計(jì)算增殖指數(shù)(PI)= (S+G2/M) / (Go/Gi+S+^/M)GC/5-FU組和5-FU組的G0-G1期細(xì)胞較control組和GC組明顯增高，而增殖指數(shù)明顯降低；control組，GC組，5-FU和GC/5-FU組的凋亡指數(shù)依次升高(P〈0. 01);且GC/5-FU組的凋亡指數(shù)較5-FU組明顯增強(qiáng)(P〈0. 01)，說明本發(fā)明制備的GC/5-FU能夠促進(jìn)5-FU進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)5-FU對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)肝癌的凋亡取4iim厚肝癌的組織切片，經(jīng)4%多聚甲醛固定，蛋白酶K (0. 02mg/L)室溫消化30min后。在3% H2O2室溫下浸泡5min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。將切片置于平衡緩沖液中20min，含TDT酶(I 20)的標(biāo)記混合液加到切片上，37°C溫育I. 5h。洗滌，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37°C環(huán)境下放置30min，洗滌后，用DAB顯色。反應(yīng)混合液中加入雙蒸水代替TDT作陰性對(duì)照。結(jié)果判定背景無色，細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或棕褐色著色者為凋亡細(xì)胞。每例選擇10個(gè)以上高倍視野，DMR+Q550病理圖像分析儀(Laica公司，德國(guó))計(jì)數(shù)至少1000個(gè)癌細(xì)胞,計(jì)算出凋亡細(xì)胞的百分率，即凋亡指數(shù)(apoptotic index,Al)。從圖7可以看出，contro I組，GC組，5-FU和GC/5-FU組的凋亡指數(shù)依次升高(P〈0. 01) ;GC/5-FU 組的平均 Al 為 21. 34%，較 5-FU 組的 14. 74% 明顯增高(P〈0. 05)。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒的方法，其特征在于，步驟包括 步驟1，提供半乳糖基殼聚糖納米材料，將GC納米材料溶于有機(jī)酸,并調(diào)節(jié)pH值至5飛.5，加水至GC質(zhì)量濃度為O. ΟΓΟ. 05% ;所述有機(jī)酸為CfC5的脂肪酸，可以是一元羧酸或多元羧酸，或其混合物； 步驟2，將5-FU硫酸鹽溶液與步驟2中制備的GC溶液混合，混懸，得到GC/5-FU納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I中調(diào)節(jié)pH值至5飛。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)pH值所用堿為NaOH、KOH、氨水、或其中任意幾種的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)pH值時(shí)，還加入有機(jī)酸羧酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述5-FU硫酸鹽溶液中，硫酸鹽為硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、或其中任意幾種的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中，5-FU與半乳糖基殼聚糖納米材料質(zhì)量比為5 20 :1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，懸混后，將懸混產(chǎn)物放置一段時(shí)間，以促進(jìn)顆粒的形成。
8.—種如權(quán)利要求I所述方法制備的具有肝臟靶向性的負(fù)載5-FU的半乳糖基殼聚糖納米顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的負(fù)載5-FU的半乳糖基殼聚糖納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒平均粒徑為30 40nm。
10.一種如權(quán)利要求8所述負(fù)載5-FU的半乳糖基殼聚糖納米顆粒在治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備GC/5-FU納米粒的方法，將GC納米材料溶于有機(jī)酸，與5-FU硫酸鹽溶液混合，懸混得到GC/5-FU納米顆粒。所述制備的GC/5-FU納米顆粒具有較高的載藥率、和包封率，并且納米顆粒為球形，表面光滑，無團(tuán)聚現(xiàn)象；合適的粒徑能夠是載藥納米顆粒進(jìn)入腫瘤間隙，而避免進(jìn)入正常組織，使其具有更好的靶向性。
文檔編號(hào)A61K31/513GK102670517SQ20121017563
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者程明榮 申請(qǐng)人:程明榮