專利名稱：楤白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重影響人類健康的四大慢性非傳染性疾病之一，處于引起人類死亡疾病的第二位。目前人們對絕大多數(shù)腫瘤的治療都缺少有效地治療手段，常見的放療、化療、手術(shù)等手段通?；蛘叨靖弊饔幂^大或者療效有限。因此迫切需要尋找療效好、副作用小的抗腫瘤藥物，其中，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性物質(zhì)是一條較好的途徑。秦巴山區(qū)是我國天然藥物資源最為豐富的區(qū)域之一，其中一些從秦巴地區(qū)太白山某些中草藥提取的有效成分已被《美國藥典》錄入或用于臨床腫瘤的治療之中，因此近年來太白山傳統(tǒng)中草藥成為新藥研究的重點領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用，惚白皮總皂苷是一種植物提取物，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著，是一種新的抗腫瘤藥物。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用。惚白皮總皂苷用于抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。所述的于抗腫瘤藥物為口服給藥。所述的抗腫瘤藥物為抗實體腫瘤或抗非實體腫瘤的藥物。所述的抗實體腫瘤的藥物為抗肝癌、抗黑色素瘤和/或抗肉瘤的藥物；所述的抗非實體腫瘤的藥物為抗白血病的藥物。惚白皮總皂苷在制備抗腫瘤的化療藥物的輔助藥物中的應(yīng)用。所述的輔助藥物是增強(qiáng)化療藥物的療效或減輕其毒副反應(yīng)的藥物。環(huán)磷酰胺配合使用的應(yīng)用，用于增強(qiáng)其它抗腫瘤藥物的療效或減輕其它抗腫瘤藥物的毒副反應(yīng)。惚白皮總皂苷與環(huán)磷酰胺配合使用在抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。一種口服的具有抗腫瘤作用的中藥提取物，其藥用成分為惚白皮總皂苷，添加或不添加輔料后制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、乳劑、乳膏劑或軟膏劑，其中惚白皮總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1% 100%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著。惚白皮總皂苷對小鼠S180肉瘤、H22肝癌、小鼠白血病有一定的抑制作用，其中B16和FBL3的IC50為O. 0774g/L, O. 199g/L，在O. 025g/mL到3. 2g/mL濃度范圍內(nèi)對H22細(xì)胞抑制率均在80%以上。在體研究結(jié)果顯示灌胃給予小鼠惚白皮總皂苷IOOmg · kg^\200mg · kg'300mg · kg'對小鼠S180肉瘤的抑制率分別為16. 9%,37. 1%、27· 0% ;相同劑量下對H22肝癌的抑制率分別為23. 7%、10%、13. 4%。進(jìn)一步，提出惚白皮總皂苷與環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥的配合使用，惚白皮總皂苷對環(huán)磷酰胺的抑瘤作用表現(xiàn)出一定增強(qiáng)效果，從而達(dá)到增強(qiáng)其它抗腫瘤藥物療效、減少其它抗腫瘤藥用量或減輕其它抗腫瘤藥物毒副反應(yīng)的目的。


圖IDDP作用48h后對H22、B16和FBL3腫瘤細(xì)胞的抑制作用；圖2為惚白皮總皂苷不同時間點對FBL3細(xì)胞的抑制作用；圖3為惚白皮總皂苷對H22、B16和FBL3腫瘤細(xì)胞的抑制作用；圖4-1 圖4-3為H22細(xì)胞不同處理的細(xì)胞觀察圖(IOX 10);圖4_1為正常組，圖
4-2為惚白皮總皂苷O.025g/L組，圖4-3為DDP組；圖5-1 圖5-3為B16細(xì)胞不同處理的細(xì)胞觀察圖(10X10);圖5-1為正常組，圖
5-2為惚白皮總皂苷O.lg/L組，圖5-3為DDP加藥48h ；圖6-1 圖6-3為FBL3細(xì)胞不同處理的細(xì)胞觀察圖(10X 10);圖6-1為正常組，圖6-2為惚白皮總皂苷O. 2g/L組，圖6-3為DDP組。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。I.材料與儀器I. I藥物飛天蜈蚣七根皮提取物惚白皮總皂苷，用前以去離子水配置成適當(dāng)濃度。惚白皮總皂苷的提取為惚木的根皮經(jīng)乙醇-水溶液浸潰后加熱回流提取，提取液上樣于D-101樹脂柱，用水洗脫至流出液無色后再用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯萃取液干燥后得到惚白皮總皂苷。惚白皮總皂苷抗腫瘤疾病方面有效成分為皂苷類，含齊墩果酸和糖生成的皂甙。用紫外分光光度法以齊墩果酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷為對照，測定惚白皮總皂苷以齊墩果酸-3-0-β -D-吡喃葡萄糖醛酸苷計不得少于30%。具體的提取為取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經(jīng)過沖洗、干燥后粉碎成粗粉，加乙醇-水溶液8000ml (乙醇濃度為70%，浸潰時間8 12小時，浸潰后回流提取兩次溫度為80 90°C，每次2小時，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10(60°C測)，得到濃縮液 2000ml ；濃縮液加水1000ml，攪拌均勻，靜止24小時，抽濾；濾液上D-101樹脂柱，先用水洗脫至無色后棄去，再用乙醇溶液50% 80%梯度洗脫，50%乙醇洗脫液棄去，合并60% 80%梯度洗脫液；洗脫液回收乙醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧干燥或真空干燥；取藥物干燥粉，加水適量溶解均勻后加乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，進(jìn)行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為O. 09Mpa，濃縮至溶液相對密度O. 90-0. 95 (50°C測)，即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。
I. 2 動物昆明小鼠，18 22g，均購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。動物合格證號=SCXK(K)2007-001。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂顆粒飼料。I. 3細(xì)胞株細(xì)胞株S180肉瘤細(xì)胞株，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院分子中心實驗室贈予；H22和FBL3由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所實驗室贈予；B16細(xì)胞株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科國家重點學(xué)科實驗室贈予。
具體使用均為上述細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞。I. 4藥品與試劑注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號11020121。注射用順鉬(DDP)齊魯制藥有限公司，批號003006100。DMEM培養(yǎng)基賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號NWG0451 ；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；MTT,上海桑尼生物科技有限公司；DMS0科昊生物工程有限責(zé)任公司。I. 5統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(I±s)表示，組間均數(shù)的兩兩比較采用t檢驗。2、惚白皮總皂苷的抗腫瘤效果2. IMTT法檢測惚白皮總皂苷對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用分別取對數(shù)生長期、CO2孵箱37°C培養(yǎng)的H22，F(xiàn)BL3和B16細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為5000個/孔，接種于96孔板，每孔加IOOul的細(xì)胞懸液。H22為懸浮細(xì)胞，而FBL3和B16則需貼壁生長。因此H22在接種后立即每孔加藥(惚白皮總皂苷或陽性對照藥DDP)20ul，然后使總體積為200ul，F(xiàn)BL3和B16培養(yǎng)24h待貼壁細(xì)胞后加藥(惚白皮總皂苷或陽性對照藥DDP)。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，惚白皮總皂苷的終濃度分別為0. 025g/L、0. 05g/L、0. lg/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L、l. 6g/L、3. 2g/L。同時設(shè)置對照組(不加藥)、調(diào)零組(加培養(yǎng)基和溶媒)和陽性藥順鉬(DDP)組。加藥后CO2孵箱37°C繼續(xù)培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)48h后，每孔加MTT 20ul繼續(xù)培養(yǎng)4h，懸浮細(xì)胞2000r離心lOmin，棄去上清，每空加入150ulDMS0，在搖床上震蕩lOmin，在酶標(biāo)儀450nm波長下檢測各孔的OD值，按下列公式計算抑制率。細(xì)胞增值抑制率％= [I- (OD給難-OD調(diào)零組)/ (OD對照組-OD調(diào)零組)]X 100%如圖I所示，在培養(yǎng)48h后，陽性對照藥順鉬則對H22、B16和FBL3細(xì)胞的抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；在25 lOOumol/L范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞生長抑制越明顯。當(dāng)惚白皮總皂苷在0. 025g/L 3. 2g/L濃度范圍內(nèi)，作用于FBL3細(xì)胞24h后，如圖2所示，藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用隨濃度的升高有升高的趨勢，但量效關(guān)系并不十分明顯；當(dāng)藥物作用48h后，藥物作用表現(xiàn)出了明顯的量效關(guān)系，藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用呈現(xiàn)明顯的S型曲線，也表明藥物作用48h后作用明顯。因此在后續(xù)檢測時選擇培養(yǎng)48h作為觀察時間點。在O. 025g/L 3. 2g/L濃度范圍內(nèi)，加入惚白皮總皂苷與H22細(xì)胞共同培養(yǎng)48h后，其表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用，抑制率均在80%以上；與此同時，在O. 05g/L O. 4g/L濃度范圍內(nèi)，惚白皮總皂苷對B16細(xì)胞的抑制作用則呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，腫瘤抑制率明顯上升，從O上升至80%以上，計算IC50為O. 199g/L ;在O. 025g/L O. 2g/L濃度范圍內(nèi)，對B16細(xì)胞抑制率有明顯上升，從O上升至80%以上，IC5tl為O. 0774g/L，見圖3。2. 2腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化的觀察在加入藥物48h后，分別于倒置顯微鏡下觀察不同時期細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。H22細(xì)胞的觀察如圖4-1 圖4_3所示，H22細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，對照組細(xì)胞形態(tài)完整，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間界限清晰(圖4-1)。在陽性對照組，H22細(xì)胞碎片增多，發(fā)生死亡(圖
4-3)。惚白皮總皂苷組在藥物作用48h后，細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形狀，胞漿濃縮，核膜核仁破碎，出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片，顯示對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用(圖4-2)。B16細(xì)胞的觀察如圖5-1 圖5-3所示，對照組細(xì)胞形態(tài)完整，貼壁生長旺盛(圖
5-1)。在陽性對照組，B16細(xì)胞核固縮，細(xì)胞變圓破裂(圖5-3)。在惚白皮總皂苷藥物作用48h后，B16細(xì)胞數(shù)量減少，活力下降，貼壁細(xì)胞變圓浮起，胞漿內(nèi)空泡增加，細(xì)胞形態(tài)的完整性受到破壞，逐漸變圓脫落，形成大量的細(xì)胞碎片，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用(圖5-2)。如圖6-1 圖6-2所示，F(xiàn)BL3細(xì)胞的在加藥(圖6-2)或不加藥(圖6-1)培養(yǎng)48h后觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，在藥物作用后，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞活力下降，貼壁細(xì)胞由不規(guī)則形狀變圓浮起，形態(tài)完整性收到破壞，形成大量細(xì)胞碎片，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用。在陽性對照組，F(xiàn)BL3細(xì)胞細(xì)胞核固縮，細(xì)胞破碎發(fā)生死亡(圖6-3)。2. 3惚白皮總皂苷對小鼠移植性小鼠S180肉瘤生長的抑制作用選擇腫瘤生長旺盛且無破潰、腹腔接種S180后7 8d的昆明小鼠，脫臼處死，酒精消毒皮膚，無菌條件下在超凈臺內(nèi)吸取腫瘤腹水，以生理鹽水稀釋，O. 4%臺盼藍(lán)(Sigma公司)染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)在95%以上，使成IX IO7個/mL，無菌條件下，昆明小鼠60只，18 22g，鼠右前肢腋下接種S180肉瘤細(xì)胞懸液O. 2mL。接種腫瘤細(xì)胞前用75%乙醇消毒接種部位的皮膚，接種后將小鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別為模型組，陽性對照組(CTX，30mg · kg—1)，惚白皮總皂苷高、中、低劑量(300mg · kg'200mg · kg'IOOmg · kg-1)組。藥物配置成適當(dāng)濃度，灌胃 ig (O. 2ml/10g)或腹腔注射ip (O. 2ml/10g)給藥，每日I次，連續(xù)給藥10天。末次藥后24h，稱體重，脫臼處
死動物，解剖剝離瘤塊，稱重，計算抑瘤率。
抑瘤率—對照組平均瘤重-治療組平均瘤重
—對照組平均瘤重X100 %。結(jié)果表明，在50mg ^kg4IOOmg *kg_1劑量范圍均表現(xiàn)出一定的抑瘤效果統(tǒng)計結(jié)果表明，200mg kg—1惚白皮總皂苷表現(xiàn)出一定的抑瘤效果，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0. 05)，抑瘤率37. 1% (見表I)。IOOmg · kg-1和300mg · kg-1組也表現(xiàn)出了一定的抑瘤效果，但無統(tǒng)計學(xué)意義。陽性對照組CTX則表現(xiàn)出非常顯著的抑瘤效果(P〈0. 01)，抑瘤率49. 4%。表I.惚白皮總皂苷對小鼠移植S180實體瘤的治療作用([士 s )
權(quán)利要求
1.惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用。
2.惚白皮總皂苷用于抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的于抗腫瘤藥物為口服給藥。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物為抗實體腫瘤或抗非實體腫瘤的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗實體腫瘤的藥物為抗肝癌、抗黑色素瘤和/或抗肉瘤的藥物；所述的抗非實體腫瘤的藥物為抗白血病的藥物。
6.惚白皮總皂苷在制備抗腫瘤的化療藥物的輔助藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的輔助藥物是增強(qiáng)化療藥物的療效或減輕其毒副反應(yīng)的藥物。
8.環(huán)磷酰胺配合使用的應(yīng)用，其特征在于，用于增強(qiáng)其它抗腫瘤藥物的療效或減輕其它抗腫瘤藥物的毒副反應(yīng)。
9.惚白皮總皂苷與環(huán)磷酰胺配合使用在抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。
10.一種口服的具有抗腫瘤作用的中藥提取物，其藥用成分為惚白皮總皂苷，添加或不添加輔料后制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、乳劑、乳膏劑或軟膏齊U，其中惚白皮總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 100%。
全文摘要
本發(fā)明公開了楤白皮總皂苷的抗腫瘤的應(yīng)用，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著。楤白皮總皂苷對小鼠S180肉瘤、H22肝癌、小鼠白血病有一定的抑制作用，其中B16和FBL3的IC50為0.0774g/L，0.199g/L，在0.025g/mL到3.2g/mL濃度范圍內(nèi)對H22細(xì)胞抑制率均在80%以上。灌胃給予小鼠楤白皮總皂苷100mg·kg-1、200mg·kg-1、300mg·kg-1，對小鼠S180肉瘤的抑制率分別為16.9%、37.1%、27.0%；相同劑量下對H22肝癌的抑制率分別為23.7%、10%、13.4%。
文檔編號A61K31/675GK102824386SQ20121017880
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者封衛(wèi)毅, 鄭巧偉, 肖志強(qiáng), 楊建剛, 倪亞會, 孟祥海 申請人:陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心