專利名稱：一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎簡(jiǎn)稱鴨肝炎，是危害雛鴨最嚴(yán)重的疫病之一，主要危害20日齡以內(nèi)的雛鴨，雛鴨日齡越小，死亡率越高，最高死亡率可達(dá)90%-95%，并且所有的抗菌素對(duì)本病無效。1945年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)本病，并命名為I型鴨病毒性肝炎，1965年在英國(guó)發(fā)現(xiàn)了鴨病毒性肝炎II型，1969年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)了鴨病毒性肝炎III型。鴨病毒性肝炎病毒I型屬于小RNA病毒科，呈球形或類球形，直徑在20-40匪，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力強(qiáng)，在自然環(huán)境中可較長(zhǎng)時(shí)間存活。鴨肝炎I型引起雛鴨的嚴(yán)重死亡，死亡率高達(dá)90%，中成鴨一般不發(fā)病，病雛鴨的特征是意識(shí)紊亂，頻頻抽搐，肝臟呈斑點(diǎn)狀出 血，膽囊腫大，膽汁顏色變淡。DVH病毒II型屬于星狀病毒，DVH-III屬于小RNA病毒。DVH病毒三種血清型之間無交叉保護(hù)作用。目前，I型呈世界性分布，并曾報(bào)道在印度、埃及和美國(guó)發(fā)現(xiàn)I型鴨肝炎病毒的變異株。II型和III型鴨病毒性肝炎分別局限于英國(guó)和美國(guó)，未發(fā)現(xiàn)變異毒株。鴨病毒性肝炎早在1958年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代初期起本病在我國(guó)再次流行，此后，各地疫情此起彼伏，疫情能夠被鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以來，本病在某些地區(qū)出現(xiàn)較嚴(yán)重的流行，其疫情不能被標(biāo)準(zhǔn)鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制，懷疑有I型鴨病毒性肝炎病毒變異株出現(xiàn)。鴨病毒性肝炎易造成地區(qū)性爆發(fā)從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要防治手段包括抗病毒藥、中西藥及制劑、卵黃抗體及其他生物制劑等，其中卵黃抗體是最有效的治療鴨病毒病的方法。雞卵黃抗體IgY是雞的一種免疫球蛋白IgY在功能上相當(dāng)于哺乳動(dòng)物IgG，但結(jié)構(gòu)上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。雞卵黃抗體具有很多優(yōu)越性。
(I)由于鳥類與哺乳類動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)的差距，鳥類更適于生產(chǎn)抗哺乳動(dòng)物抗原的特異性抗體。卵黃抗體不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，不與抗哺乳動(dòng)物抗原的抗體發(fā)生反應(yīng)，不與哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的Fe受體結(jié)合，這在免疫診斷中具有重要意義。(2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過程中保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，雞IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4°C條件下存放5年或室溫條件下存放6個(gè)月對(duì)抗體活性無明顯影響。(3)卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長(zhǎng)期維持在相當(dāng)于甚至超過血清抗體濃度的水平上。I只產(chǎn)蛋雞(以平均每周產(chǎn)蛋5-6枚，平均每枚雞蛋蛋黃大約15mL計(jì)算)所產(chǎn)蛋生產(chǎn)的抗體量相當(dāng)于90-100mL血清或180-200mL血液中抗體的量，例如I只兔子I個(gè)月可提取IgG約200mg，而I個(gè)月I只蛋雞可從蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物的采血不僅對(duì)動(dòng)物本身是極大的應(yīng)激，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實(shí)際的，而利用蛋雞生產(chǎn)抗體要方便的多?？偟膩碇v，卵黃抗體對(duì)動(dòng)物沒有毒副作用，用高免卵黃抗體治療動(dòng)物疾病不但避免了高免血清價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而且可以避免高免血清在治療過程中引起的副作用，是一種很有前途的新型免疫球蛋白制劑。因此，卵黃抗體在禽畜疾病診斷、治療和預(yù)防的應(yīng)用越來越多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉，該凍干粉的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間長(zhǎng)、溶解快、抗體效價(jià)高、生物活性良好，而且本產(chǎn)品的抗體純度高于市場(chǎng)現(xiàn)有產(chǎn)品。本發(fā)明的目的同時(shí)在于提供一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉，包括以下重量百分?jǐn)?shù)的各組分鴨病毒性肝炎卵黃抗體85-88%、辛酸0. 8-1. 0%、硫柳汞0. 01-0. 02%、甲醛0. 2-0. 3%,4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。 一種所述鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法為分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體凍干粉。所述的鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟為I)分離毒株制備疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液,將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗(yàn)，驗(yàn)證得弱毒株JSNJ62株；2)免疫健康鴨群制得高免蛋免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒103 2ELD50/0. 1M1)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔5天時(shí)間，以后免疫加I倍量，免疫三次，第二次免疫后開始檢測(cè)抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；3)水稀釋法酸化處理分離高免蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65 0C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為
4.9-5. 2的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；4)辛酸處理；向步驟3)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的0. 8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min，20000rpm/min，留取上清液，靜置；5)用0. 45 y m的濾膜對(duì)步驟4)所得上清液過濾，用于截流分子量大于200KD的大分子物質(zhì)，再經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾，留濾液，經(jīng)超濾裝置濃縮，使使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5mL/500羽份為止；6)向步驟5)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為0. 2-0. 3%，硫柳汞為 0. 01-0. 02% ；7)再加入輔料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇；8)預(yù)凍將濃縮后的卵黃抗體放置_80°C，充分冷凍；9)將步驟7)所得卵黃抗體溶液凍干，凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。
本發(fā)明免疫采用是健康的鴨作為免疫對(duì)象，這可以增加針對(duì)性，可以使抗體效價(jià)快速達(dá)到I :256，提高工作效率，應(yīng)用同種動(dòng)物產(chǎn)生多元抗體針對(duì)鴨種預(yù)防免疫范圍廣、強(qiáng)度大。通過鴨強(qiáng)化免疫后制成的卵黃抗體對(duì)鴨病毒性肝炎病見效快、療效顯著，而且針對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)對(duì)鴨的這種病具有很好的預(yù)防效果。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。實(shí)施例I.本實(shí)施例鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉，包括以下組分鴨病毒性肝炎卵黃抗體85. 99%、辛酸0. 8%、硫柳汞0. 01%、甲醛0. 2%、葡萄糖5%、山梨醇2%、甘氨酸3%、甘
露醇3%。本實(shí)施例鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟為I)免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒1032ELD5(l/0. IMl)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔5天時(shí)間，以后免疫加I倍量，免疫三次，第二次免疫后開始檢測(cè)抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；2)收集高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、晾干，分離卵黃，打碎，加入等體積的無菌水，攪拌混勻，直到顏色發(fā)白為止，得到卵黃溶液；3)將上述的卵黃液放入60°C水浴鍋內(nèi)加熱30min，期間要間斷性的攪拌，使其受熱均勻；4)加熱后加入原卵黃液體積的6倍預(yù)冷pH為4. 8鹽酸水溶液，混勻，靜置，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；5)將步驟4)得到的上清液中按體積加入辛酸0.8%，混勻，靜置，棄除上浮雜質(zhì)，留取下清液，離心10min,20000rpm/min,取上清液；6)將步驟5)上清液經(jīng)過0. 45 y m濾膜過濾，得到濾液，經(jīng)過超濾裝置截流分子量大于50KD的物質(zhì)，采用循環(huán)方式濃縮至使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5mL/500羽份為止；7)濃縮液按體積加入甲醛量為0. 2%，硫柳汞量為0. 01% ；8)配制過程中，加入輔料為葡萄糖5%、山梨醇2%、甘氨酸3%、甘露醇3%物質(zhì)；9)預(yù)冷，根據(jù)凍干曲線程序?qū)⑴渲坪玫狞S抗體濃縮液放置_80°C進(jìn)行預(yù)凍，這一步必須將產(chǎn)品凍的徹底；10)按照凍干曲線設(shè)定凍干程序，凍干曲線程序是-40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。為了檢測(cè)卵黃抗體在常溫下的放置時(shí)抗體效價(jià)變化，以此來確定本產(chǎn)品的保質(zhì)期，做了以下試驗(yàn)將本品保存在37°C培養(yǎng)箱中，保存24個(gè)月，分別I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用瓊脂擴(kuò)散(AGP)法，測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣品的卵黃抗體效價(jià)變化，結(jié)果見表I。表I.常溫放置凍干粉不同時(shí)間段效價(jià)的變化
權(quán)利要求
1.一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉，其特征在于包括以下重量百分?jǐn)?shù)的各組分鴨病毒性肝炎卵黃抗體85-88%、辛酸0. 8-1. 0%、硫柳汞0. 01-0. 02%、甲醛0. 2-0. 3%、4_5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2_3%甘氨酸、2_3%甘露醇。
2.一種如權(quán)利要求I所述鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法，其特征在于分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體凍干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法，其特征在于具體步驟為 1)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I.5mL (含毒103_2ELD5tlA). IM1)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量，免疫三次，第二次免疫后開始檢測(cè)抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用； 2)水稀釋法酸化處理分離高免蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白， 得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 9-5. 2的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，放置4°C環(huán)境中靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液； 3)辛酸處理；向步驟2)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的0.8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min,20000rpm/min,留取上清液,靜置； 4)用0.45mm的濾膜對(duì)步驟3)所得上清液過濾，用于截流分子量大于200KD的大分子物質(zhì)，再經(jīng)0. 22mm濾膜過濾，留濾液，經(jīng)超濾裝置濃縮，使使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5 mL/500羽份為止； 5)向步驟4)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為0.2-0. 3%，硫柳汞為 0. 01-0. 02% ； 6)再加入輔料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇； 7)預(yù)凍將濃縮后的卵黃抗體放置_80°C，充分冷凍； 8)將步驟7)所得卵黃抗體溶液凍干，凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉，包括以下組分鴨病毒性肝炎卵黃抗體85-88%、辛酸0.8-1.0%、硫柳汞0.01-0.02%、甲醛0.2-0.3%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。該凍干粉的優(yōu)點(diǎn)保存時(shí)間長(zhǎng)、溶解快、抗體效價(jià)高、生物活性良好，最重要是本產(chǎn)品的抗體純度高于市場(chǎng)現(xiàn)在產(chǎn)品。本發(fā)明同時(shí)公開了一種鴨病毒性肝炎卵黃抗體凍干粉的制備方法，包括以下步驟在經(jīng)常發(fā)病地區(qū)自行分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干等得到鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體凍干粉。本申請(qǐng)制備方法中在酸化水處理時(shí)應(yīng)用了巴氏消毒的溫度加熱卵黃液，不僅達(dá)到消毒的作用同時(shí)可以提高抗體的回收率和酸化處理時(shí)溶液的澄清度，制得的卵黃抗體的優(yōu)勢(shì)特征過生物活性高、抗體保存時(shí)間、效價(jià)降低速度減緩等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102716484SQ20121017977
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者吳紅云, 徐進(jìn), 李建正, 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司