專(zhuān)利名稱(chēng)：含有豬圓環(huán)病毒2型抗原與副豬嗜血桿菌抗原的疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬用疫苗組合物，具體涉及一種同時(shí)抵抗豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌(HPS)感染的疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。PMWS的臨床特征有消瘦、皮膚蒼白、呼吸困難、腹瀉、黃疽等。病理變化可見(jiàn)全身淋巴結(jié)腫大，特別是腹股溝淋巴結(jié)腫大可達(dá)5 10倍；肺主要呈彌 散性、間質(zhì)性肺炎變化，質(zhì)地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑駁狀外觀；腎的變化較多，可見(jiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)散在大小不一的白色壞死灶，由于水腫而導(dǎo)致其呈現(xiàn)蠟樣外觀；脾輕度腫大；大多病豬的肝有不同程度的萎縮、纖維化。除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2相關(guān)的豬病，死亡率達(dá)10% 30%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌病又稱(chēng)多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱(chēng)Glasser氏病。該病是由副豬嗜血桿菌引起。副豬嗜血桿菌只感染豬，可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見(jiàn)于5 8周齡的豬，發(fā)病率一般在10% 15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%臨床癥狀取決于炎癥部位，包括發(fā)熱、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺、站立困難甚至癱瘓、僵豬或死亡。母豬發(fā)病可流產(chǎn)，公豬有跛行。哺乳母豬的跛行可能導(dǎo)致母性的極端弱化。死亡時(shí)體表發(fā)紫，肚子大，有大量黃色腹水，腸系膜上有大量纖維素滲出，尤其肝臟整個(gè)被包住，肺的間質(zhì)水腫。大量文獻(xiàn)報(bào)道，豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染非常普遍(魯杏華等，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，(03): 46 48 ;賈松濤等，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，(08): 99 100;等等)。因此,需要能同時(shí)抵抗PCV2感染以及副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物。鮑春興等〃淺析疫苗免疫失敗的原因及對(duì)策〃(畜牧獸醫(yī)科技信息2010，(02)8 12)，報(bào)道兩種疫苗接種的間隔時(shí)間不夠，或有些養(yǎng)殖戶因防疫任務(wù)繁瑣，為了省事，把兩種疫苗同時(shí)接種，疫苗進(jìn)入機(jī)體后，疫苗抗原之間可能產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，造成免疫失敗。為了避免免疫失敗，豬場(chǎng)一般采取PCV2疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗的分別免疫的策略，二種疫苗免疫的時(shí)間間隔15天以上，以避免兩種抗原之間的干擾，這就造成多次重復(fù)注射，加大了動(dòng)物應(yīng)激并且提高了防疫成本，防疫效果也不確切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)大量的篩選研究，意外發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌的抗原制備的疫苗組合物，二種抗原相互并不會(huì)相互干擾或影響；相反地，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌的抗原組合物和疫苗組合物不僅能夠產(chǎn)生更佳的保護(hù)性免疫應(yīng)答的同時(shí)，還意外發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌增強(qiáng)了豬圓環(huán)病毒2型抗原(PCV2)的免疫效果，特別是與副豬嗜血桿菌組合的情況下，即使PCV2抗原量減半仍能維持PCV2的免疫效果。因此本發(fā)明的第一方面在于提供預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原和副豬嗜血桿菌抗原感染的疫苗組合物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌感染的抗原組合物，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種副豬嗜血桿菌抗原。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型抗原是指含有至少一種PCV2抗原形式的任何組合物，所述抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗PCV2感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位或其他成分。PCV2抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原如梅里亞公司(Merial)的Circovac ;輝瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn魯PCV2 ;哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)；福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亞單位疫苗(如勃林格 殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的 Ingelvac CircoFLEX馨)優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原，其中優(yōu)選使用PCV2 SH株，保藏號(hào)為CGMCC No. 23890，公開(kāi)于專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101240264A。因PCV2基因組大小為1767bp或1768bp，不同毒株之間核苷酸序列同源性較高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登錄號(hào)為AY686763)、PCV2LG株(GenBank登錄號(hào)為HM038034)、PCV2 DBN-SX07-2 (GenBank登錄號(hào)為HM641752)的抗原組合物或疫苗組合物均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗中每劑量或每頭份(2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量至少為105_ 5TCID5tl更優(yōu)選4. 5 X IO5 0TCID50 106_ tlTCID5tl ;再優(yōu)選每劑量或每頭份(2ml)含 PCV2 病毒 9X 105 CITCID5。。優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒2型抗原為含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位或其他成份，更優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2亞單位抗原，最優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV20RF2蛋白。其中，本發(fā)明PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選序列表SEQNO1. DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上的、優(yōu)選80%以上的、更優(yōu)選90%以上的氨基酸序列的蛋白，為能達(dá)到本發(fā)明目的的蛋白序列。本發(fā)明對(duì)PCV2 0RF2蛋白沒(méi)有特別的限制，只要其具有保留對(duì)PCV2的免疫原性，任何PCV2 0RF2蛋白都可用作本文所述PCV2 0RF2DNA和/或多肽的來(lái)源。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述PCV2 0RF2蛋白生物的含量為O. 5 20yg/頭份，更優(yōu)選5 10yg/頭份副豬嗜血桿菌抗原是指含有至少一種副豬嗜血桿菌抗原形式的任何組合物，所述副豬嗜血桿菌抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答。副豬嗜血桿菌為包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的I 15個(gè)血清型。優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原是完整的副豬嗜血桿菌，優(yōu)選為滅活形式，更優(yōu)選，所述副豬嗜血桿菌抗原是滅活的血清型為4型和5型的混合抗原；最優(yōu)選為滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株，和滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。其中，副豬嗜血桿菌血清4型JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4, Strain JS)保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2011172;副豬嗜血桿菌血清 5 型 ZJ 株(Haemophilus parasuisSerotype 5, Strain ZJ)的保藏號(hào)為:CCTCC Ν0:Μ 2011173;保藏日期均為2011年5月18日，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位均為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)。本發(fā)明的副豬嗜血桿菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1 ;海博萊公司(Hipra)的Hiprasuis-Glasser ;武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司的副豬嗜血桿菌滅活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當(dāng)變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時(shí)，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無(wú)法百分之百相同，其基本的生理功能并不會(huì)有所改變。因此，目前國(guó)際上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來(lái)進(jìn)行比對(duì)而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本發(fā)明所使用的副豬嗜血桿菌抗原并不限定于本發(fā)明所使用的野外分離株，
16s rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)(包含約50個(gè)功能域)因此，本發(fā)明包括與副豬嗜血桿菌兩株菌株(JS株、ZJ株)16SrRNA的同源性在80%上以上的菌株，更優(yōu)選與JS株或ZJ株16SrRNA同源性在至少90%以上，優(yōu)選地至少95%以上，更優(yōu)選地至少95% 99%以上的副豬嗜血桿菌菌株，即不改變副豬嗜血桿菌兩株菌株(JS株、ZJ株)16S rRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)簡(jiǎn)單的篩選或誘變本發(fā)明的副豬嗜血桿菌，獲得與本發(fā)明副豬嗜血桿菌16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌為JS株，保藏號(hào)為CCTCC No. M2011172。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前前含量為IX IO9CFU/頭份 8X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量為2 X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量I X IO9CFU/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌為ZJ株，保藏號(hào)為CCTCC No. M2011173。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量為IX IO9CFU/頭份 8X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量為I X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量2 X IO9CFU/頭份。本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及疫苗組合物的佐劑，優(yōu)選為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、Montanide Gel、蜂膠、ISA206、ISA760VG、氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種的一種或幾種組合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，含有PCV2106· tlTCID5tl/頭份，血清4型副豬嗜血桿菌4 X IO9CFU/頭份，含血清5型副豬嗜血桿菌4X IO9CFU/頭份，疫苗佐劑為10% (V/V) Montanide Gel佐劑。疫苗組合物還可以包含其它豬的病原體的附加抗原。附加抗原優(yōu)選豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的抗原、豬肺炎支原體抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒(SIV)抗原及它們的組合。由上可見(jiàn)，本發(fā)明中預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物，不僅未產(chǎn)生兩種抗原成份的相互免疫干擾，而且還意外發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌增強(qiáng)了豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述PCV2抗原為PCV2 0RF2蛋白。所述的副豬嗜血桿菌抗原為滅活的全菌抗原。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述PCV20RF2蛋白生物的含量為O. 5 20 μ g/頭份，更優(yōu)選5 10yg/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌滅活抗原為副豬嗜血桿菌JS株的滅活抗原和副豬嗜血桿菌ZJ株的滅活抗原。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌JS株滅活抗原的含量為
IX 109^8X109CFU/頭份和副豬嗜血桿菌ZJ株滅活抗原的含量為IX IO9 8 X IO9CFU/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述疫苗佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述疫苗佐劑為卡波姆、殼聚糖的一種或兩種。作為本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式在于提供另一種預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，其中，含有滅活的PCV2全病毒和滅活的血清4型及5型副豬嗜血桿菌，疫苗佐劑和其它賦形劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述PCV2病毒為PCV2SH株。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗中每劑量或每頭份(2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量2. 2 X 105_ 0TCID50 106_ 0TCID50 ;更優(yōu)地為每劑量或每頭份(2ml)含PCV2病毒4. 5 X 105· 0TCID50優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌為JS株，保藏號(hào)為CCTCC No. M2011172。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量為I X IO9CFU/頭份 4 X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量為I X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量2 X IO9CFU/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌為ZJ株，保藏號(hào)為CCTCCNo. M2011173o
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量為IX IO9CFU/頭份 4X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量為
IX IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量2 X IO9CFU/頭份。本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及疫苗組合物的佐劑，優(yōu)選為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、GEL、蜂膠、ISA206、ISA760VG的一種或幾種組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，含有PCV29 X 105_tlTCID5tl/頭份，血清4型副豬嗜血桿菌2 X IO9CFU/頭份，含血清5型副豬嗜血桿菌2 X IO9CFU/頭份，疫苗佐劑為10%V/V GEL佐劑。本發(fā)明賦形劑是指補(bǔ)充疫苗體積的液體，包括但不限于生理鹽水、PBS液。 本發(fā)明第二方面的疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟培養(yǎng)副豬嗜血桿菌4型和5型菌株，并滅活、濃縮；培養(yǎng)PCV2，并滅活、濃縮；將三種抗原成分按比例混合，輔以佐劑制備成疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物的制備方法，所述濃縮方法為超濾法，濃縮3倍。優(yōu)選地，本發(fā)明所述制備方法中，滅活方法為甲醛滅活法；更優(yōu)地，本發(fā)明的甲醛溶液的終濃度為O.1 O. 3% (v/v)，滅活時(shí)間為24 48h。優(yōu)選地，本發(fā)明所述制備方法中，三種抗原的混合比例為等量體積混合。本發(fā)明的菌株信息如下分類(lèi)命名副豬嗜血桿菌血清4型JS (Haemophilus parasuis JS),保藏號(hào)為CCTCCΝ0:Μ 2011172;保藏日期2011年5月18日，保藏地址中國(guó)武漢,武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物中心；保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)。副豬嗜血桿菌病血清5型ZJ株分類(lèi)命名副豬嗜血桿菌血清5型ZJ (Haemophilus parasuis ZJ),保藏號(hào)為CCTCCΝ0:Μ 2011173;保藏日期2011年5月18日，保藏地址中國(guó)武漢,武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物中心保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)。由上可見(jiàn)，本發(fā)明至少有以下優(yōu)點(diǎn)I)發(fā)明人解決了現(xiàn)有技術(shù)的困難，改變了對(duì)聯(lián)苗的認(rèn)識(shí)偏見(jiàn)首次將豬圓環(huán)病毒2型抗原和副豬嗜血桿菌抗原聯(lián)合使用，而在本發(fā)明之前，一直被認(rèn)為這兩種抗原會(huì)相互干擾；2)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌抗原組合物及使用該組合物制備的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物，不僅不會(huì)產(chǎn)生兩種抗原成份的相互免疫干擾，而且還意外發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌抗原增強(qiáng)了豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果，而且如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所證明的，在存在副豬嗜血桿菌抗原的情況下，即使PCV2抗原量減半仍能維持PCV2的免疫效果，而這出乎獸藥領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料的。3)發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)上述預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物與豬圓環(huán)病毒2型或副豬嗜血桿菌的單價(jià)疫苗的效力相比，在對(duì)豬注射免疫過(guò)程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)出人預(yù)料地小，因此，本發(fā)明的疫苗組合物安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。4)發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)上述預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物不僅可以是滅活的PCV2病毒抗原與滅活的副豬嗜血桿菌抗原組成的疫苗組合物，還可以是PCV2亞單位蛋白為抗原與滅活的副豬嗜血桿菌抗原組成的疫苗組合物，即PCV2 0RF2蛋白為抗原與滅活的副豬嗜血桿菌抗原組成的疫苗組合物；4)此外，本發(fā)明預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，制備方法簡(jiǎn)單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的分次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上二種疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠并被用戶接受，具有商業(yè)上成功的基礎(chǔ) 。


圖1為本發(fā)明的PCV2-0RF2目的片段大??；圖2為本發(fā)明的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖3為本發(fā)明的的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白Western blotting圖；圖4為本發(fā)明的實(shí)施例1所述的疫苗組合物的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例中所選用的豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)毒株為PCV2SH株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏號(hào)為CGMCC No. 23890。此毒株在中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)CN101240264公開(kāi)。本發(fā)明的實(shí)施例中所選用的血清4型副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)菌株為副豬嗜血桿菌JS株，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號(hào)為CCTCC No.M2011172。本發(fā)明的實(shí)施例中所選用的血清5型副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)菌株為副豬嗜血桿菌ZJ株，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號(hào)為CCTCC No.M2011173。本發(fā)明的實(shí)施例中，PCV2SH株的生產(chǎn)用毒的制備簡(jiǎn)便，效價(jià)較高為IO6 tlTCID5ci/ml以上，PCV2SH株的含量為IO6tlTCID5c/頭份疫苗(Iml )。本發(fā)明還試驗(yàn)了含量低于IO6 0TCID50/頭份的疫苗組合物，但試驗(yàn)證明至少需要達(dá)到IO5 5TCID5tl/頭份才能具有較佳的免疫效果。本發(fā)明的滅活劑為甲醛溶液，其使用的終濃度為0.1 0. 3% (v/v)，滅活時(shí)間為24 48h。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中使用了終濃度0.2%體積的甲醛滅活PCV2 SH株，滅活時(shí)間為18小時(shí)；使用了終濃度為0. 3%體積的甲醛溶液滅活副豬嗜血桿菌菌株JS株、ZJ株，滅活時(shí)間為24小時(shí)。本發(fā)明的實(shí)施例中使用了密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作3倍濃縮，如后續(xù)實(shí)施例證明，該方法和濃度可以使最后獲得疫苗組合物獲得較佳的疫苗效果；本發(fā)明還可以使用其他的超濾方法，如纖維素超濾法和多次超濾等方法。發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量，與“劑量”是等同的。優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒2型抗原為含有PCV2的免疫原性氨基酸序列，更優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2亞單位抗原，最優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV20RF2蛋白。其中，本發(fā)明PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選序列表SEQN01.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或與其同源75%以上的蛋白。本發(fā)明對(duì)PCV2 0RF2蛋白沒(méi)有特別的限制，只要其具有保留對(duì)PCV2的免疫原性，任何PCV2 0RF2蛋白都可用作本文所述PCV2 0RF2 DNA和/或多肽的來(lái)源。本發(fā)明實(shí)施例中使用的其他優(yōu)選的PCV2 0RF2蛋白的優(yōu)選例可以舉出 W02006-072065 公開(kāi)的 SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 4、SEQ IDNO. 6、SEQ ID NO. 9，其教導(dǎo)和內(nèi)容全部引入本文作參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可以在上述序列進(jìn)行多達(dá)6-10%的序列同源性的變動(dòng)，但仍保留其蛋白的抗原性，因而可用于本發(fā)明的組合抗原與疫苗組合物中表達(dá)出抗原性。經(jīng)修飾的抗原與多核苷酸序列SEQID N0:3或 SEQ ID N0:4編碼的PCV2 0RF2蛋白相比，能賦予至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%的保護(hù)性免疫力，就認(rèn)為該經(jīng)修飾的抗原仍保留了抗原性。本發(fā)明實(shí)施例中豬圓環(huán)病毒2型抗原成分量PCV2 0RF2蛋白為O.1 60微克/頭份、優(yōu)選O. 5 20微克頭份；更優(yōu)選5 10微克/劑量、最優(yōu)選8微克/頭份本發(fā)明實(shí)施例中“副豬嗜血桿菌抗原”是指含有至少一種副豬嗜血桿菌的抗原形式的任何抗原組合物，所述抗原當(dāng)對(duì)豬給藥時(shí)，可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原是完整的副豬嗜血桿菌病毒，優(yōu)選為滅活形式，更優(yōu)選，血清型為4型和5型的混合抗原，最優(yōu)選為副豬嗜血桿菌4型菌株為JS株，副豬嗜血桿菌5型菌株為ZJ株。本發(fā)明實(shí)施例中的副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和后續(xù)實(shí)施例試驗(yàn)例證明，這兩株副豬嗜血桿菌滅活抗原與PCV2 0RF2相互配合可以對(duì)我國(guó)目前流行的副豬嗜血桿菌病和豬圓環(huán)病的聯(lián)合發(fā)病有很好的預(yù)防和治療效果，特別是可以解決現(xiàn)有疫苗治療效果不佳，多次注射成本太高、程序繁復(fù)的問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例中的副豬嗜血桿菌抗原量為副豬嗜血桿菌4型含量至少為
2X IO9CFU/頭份，更優(yōu)選至少4 X IO9CFU/頭份；最優(yōu)選8 X IO9CFU/頭份；副豬嗜血桿菌5型含量至少為2 X IO9CFU/頭份，更優(yōu)選至少4X IO9CFU/頭份；最優(yōu)選8 X IO9CFU/頭份。本發(fā)明實(shí)施例中的所用“佐劑”可包括氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷如Quil A、Q ;含有直鏈烷基的酸或醇的酯，更具體是植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，具體是異硬脂酸酯。將油與乳化劑聯(lián)用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選非離子性表面活性劑，具體是山梨聚糖、二縮甘露醇(如油酸脫水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯(任選乙氧基化)，以及聚氧丙烯.聚氧乙烯嵌段共聚物，具體是普朗尼克產(chǎn)品，尤其是L121。本發(fā)明實(shí)施例還使用了佐劑的另一個(gè)例子是選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物的化合物。佐劑化合物宜為交聯(lián)的、尤其是與糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。這些化合物稱(chēng)為卡波姆(carbomer)。其它合適佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA) >SAF-M (Chiron, EmeryviIIe CA)、單憐酸基脂質(zhì) A、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì).胺佐劑、大腸桿菌(E. coli)的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素、IMS1314或胞
壁酸~■妝等等。本發(fā)明實(shí)施例的佐劑優(yōu)選每劑量(頭份)加入約100微克 10毫克量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約500微克-5毫克量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約750微克-2. 5毫克量的佐劑。最優(yōu)選每劑量加入約I毫克量的佐劑在另一個(gè)技術(shù)方案中，二聯(lián)物佐劑還可以加入是多糖，多糖包括但不限于黃芪多糖、刺五加多糖、香菇多糖、殼聚糖、環(huán)糊精、糊精以及SL-糊精，優(yōu)選殼聚糖其中殼聚糖加入量，優(yōu)選O.1-1Omg/劑量(頭份)，更優(yōu)選O.1 5mg/劑量,最優(yōu)選Img/劑量。下面以具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物的制備和檢驗(yàn)1.1生產(chǎn)用菌(毒)種的制備豬圓環(huán)病毒2型SH的制備將毒種PCV2SH株用MEM液體培養(yǎng)基(用購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司的MEM干粉培養(yǎng)基按說(shuō)明書(shū)配制)作1:9稀釋,然后按細(xì)胞培養(yǎng)液體積的5 %接種于PK15 (ATCC，保藏號(hào)為CCL-33 )單層細(xì)胞，37 °C吸附30分鐘，加入細(xì)胞維持液(MEM液體培養(yǎng)基中添加4%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸)，37°C培養(yǎng)4日，凍融2 3次，收獲病毒，病毒滴度為106_5TCID5(l/ml。副豬嗜血桿菌菌種的制備將副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株劃線接種于含5%新生牛血清和O. 005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美國(guó)BBI公司)的胰蛋白大豆瓊脂(TSA，購(gòu)自美國(guó)BD公司)平板(簡(jiǎn)稱(chēng)TSA/NAD平板)，37°C培養(yǎng)24 48小時(shí)，各挑選5個(gè)以上典型菌落，純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。一級(jí)種子挑取單個(gè)菌落，接入含5%新生牛血清和O. 005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美國(guó)BBI公司)的胰蛋白大豆肉湯(TSA，購(gòu)自美國(guó)BD公司)(簡(jiǎn)稱(chēng)TSB/NAD液體培養(yǎng)基)，37°C搖床180rpm振蕩培養(yǎng)12小 時(shí)，同時(shí)取樣革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)均勻，符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)特征，無(wú)任何雜菌生長(zhǎng)，作為二級(jí)種子其中含5%血清的TSA/NAD平板的制備方法胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic SoyAgar, TSA, BD Difico產(chǎn)品)40克加入945ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，溫度降至60°C左右，加入50ml過(guò)濾除菌的牛血清，5ml過(guò)濾除菌的1%NAD,充分搖勻后倒平皿。含5%新生牛血清的TSB/NAD液體培養(yǎng)基胰大豆蛋白肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB, BD Difico產(chǎn)品)30克加入940ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，加入50ml過(guò)濾除菌的牛血清，IOml過(guò)濾除菌的O. 01%NAD即成。1. 2病毒液或菌液的培養(yǎng)制備豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的制備用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將長(zhǎng)滿單層的PK15細(xì)胞，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液(MEM液體培養(yǎng)基中添加6%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸)，將毒種液體積比按O.1 O. 2TCID5(I/個(gè)細(xì)胞的接種量接種于PK15細(xì)胞上，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶2周，37°C吸附30分鐘，加入細(xì)胞維持液(步驟1.1所述)，置37°C旋轉(zhuǎn)(1(Γ12轉(zhuǎn)/小時(shí))培養(yǎng)。每日觀察廣2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，37°C培養(yǎng)4日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，置-20°C以下保存。
副豬嗜血桿菌(4型JS株與5型ZJ株)菌液的制備將鑒定合格的副豬嗜血桿菌4型JS株與副豬嗜血桿菌5型ZJ株的二級(jí)種子分別按1:100 (v/v)接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基(步驟1.1所述)，置37°C搖床200rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)至12 16小時(shí)，收獲。1. 3病毒液或菌液的處理豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的處理將步驟1. 2的病毒液用中空纖維濾柱(Millipore公司孔徑10 μ m與O. 45 μ m)過(guò)濾,除去細(xì)胞碎片。副豬嗜血桿菌(4型JS株與5型ZJ株)菌液的處理將將步驟1. 2的兩種菌液(副豬嗜血桿菌ZJ株與JS株)分別以連續(xù)離心機(jī)(10000轉(zhuǎn)/分鐘)離心后再以PBS (pH值為7. 2 7. 4)復(fù)溶至離心前的體積。1.4濃縮將豬圓環(huán)病毒2型SH、副豬嗜血桿菌4型JS株、副豬嗜血桿菌5型ZJ 株分別用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作3倍(體積比)濃縮。1. 5含量測(cè)定1. 5.1豬圓環(huán)病毒SH株病毒含量測(cè)定將病毒液用MEM液體培養(yǎng)基(步驟1.1所述)按本領(lǐng)域技術(shù)人員通用方法作10倍系列稀釋?zhuān)?0_5、10_6、10_73個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔培養(yǎng)板PK15細(xì)胞單層4孔，每孔O.1ml,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，在37°C含5% CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；用冷丙酮固定細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)測(cè)定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽(yáng)性細(xì)胞(呈綠色)的孔數(shù)，根據(jù)Karber氏法計(jì)算病毒TCID5(I。1. 5. 2副豬嗜血桿菌ZJ株與JS株活菌數(shù)測(cè)定菌液取樣，按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法作10倍系列稀釋?zhuān)?0_6、10_72個(gè)稀釋度接種于前述TSA/NAD固體培養(yǎng)基，每個(gè)平板接種O. 1ml，37 °C培養(yǎng)24小時(shí)后，選擇菌落數(shù)在30和300之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。1. 6病毒液或菌液含量測(cè)定結(jié)果豬圓環(huán)病毒2型SH株、副豬嗜血桿菌4型JS株及副豬嗜血桿菌5型ZJ株分別培養(yǎng)三批病毒液或菌液，分別為K001、K002和K003批。病毒液或菌液含量見(jiàn)表I。表I含量測(cè)定
抗原各批次病毒液或菌液含量測(cè)定KOOlΚ002K003 I豬圖環(huán)病毒2型SH株I O6iiTCID50Zml106'5T€ID5O/mlIif2TCID 奸 ml副豬嗜血桿菌4型JS4.5xl09CFU/ml5xl09€FU/mi5xl09CFU/mi I副豬嗜血桿菌5型ZJ4.1OtFU ml5xl09CFU/ml5xl09CFU/ml |1.7病毒液或菌液的滅活豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的滅活將檢驗(yàn)合格的步驟1. 3處理的病毒液加入甲醛溶液(洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠分析純，含量為37% 40%)，使甲醛溶液的終濃度為O. 2% (V/V)，37°C滅活18小時(shí)，每4小時(shí)攪拌I次，每次lOmin，滅活結(jié)束后將滅活病毒液置2 8°C保存。
副豬嗜血桿菌(4型JS株與5型ZJ株)菌液的滅活將步驟3中二種不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的終濃度為O. 3% (V/V)，37°C滅活24小時(shí)，其間每隔4小時(shí)攪拌I次，每次lOmin，滅活結(jié)束后將滅活病毒液置2 8°C保存。1.8滅活效果測(cè)定1. 8.1豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的滅活檢驗(yàn)取少量滅活病毒液接種已長(zhǎng)成單層的PK15細(xì)胞，37°C吸附I小時(shí)后棄病毒液，加入新的細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)2日，應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)盲傳3次，長(zhǎng)成細(xì)胞單層后換成細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)2日，用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)，無(wú)綠色PCV2陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生。1. 8. 2副豬嗜血桿菌滅活檢驗(yàn)制備6個(gè)平皿的TSA/NAD固體培養(yǎng)基，無(wú)菌操作將滅活的菌液在其中3個(gè)TSA/NAD固體培養(yǎng)基平皿上滴加I滴，用接種環(huán)劃線，置37°C普通溫箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立3個(gè)不接菌的TSA/NAD固體培養(yǎng)基作對(duì)照。24小時(shí)后觀察，平皿必須無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)照未接菌的2個(gè)培養(yǎng)基也應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，繼續(xù)觀察結(jié)果至48小時(shí) 6個(gè)平皿中都無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。1.8.3滅活結(jié)果3批豬圓環(huán)病毒2型SH株、副豬嗜血桿菌4型JS株及副豬嗜血桿菌5型JS株的滅活檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表，滅活是徹底的，見(jiàn)表2。表2 3批抗原的滅活檢驗(yàn)效果
抗原各批次滅活檢驗(yàn)結(jié)果KOOlK002K003豬圓環(huán)病毒2型無(wú)綠色PCV2無(wú)綠色PCV2無(wú)綠色PCV2副猜嗜血桿菌4型無(wú)菌生長(zhǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)副豬嗜血桿菌5型無(wú)菌生長(zhǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)1.9配苗配方如表3，將濃縮后的三種抗原液按1:1 :1 (V/V)混合，然后混合液與GEL佐劑(法國(guó)賽比克SEPPIC公司生產(chǎn))按90:10 (V/V)混合，以300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘即可。表3疫苗的配方及含量
成份抗原有效含量% (v/v) IPC V 2 SHI OmTQDm/頭份疫苗I抗原HPS 4型JS株4 X丨O9CFU/頭份疫苗90%HPS 5型ZJ株4 X丨O9CFli/頭份疫苗徹IGEL/10% I
以下為制備獲得疫苗組合物的檢驗(yàn)方法1. 10性狀檢驗(yàn)灰白色混懸液，長(zhǎng)時(shí)間靜置底部有少量沉淀。振蕩后呈均勻混懸液。1. 11無(wú)菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2005年版)附錄169 171頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。性狀和無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下·結(jié)果見(jiàn)表4，三批疫苗批號(hào)為Y001、Y002、Y003，由上述批號(hào)Κ001、Κ002、Κ003的毒
(菌)株抗原制備獲得，分別經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)及性狀檢驗(yàn)，結(jié)果三批疫苗成品均是合格。表4 3批疫苗的性狀及無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物，其特征在于，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種副豬嗜血桿菌抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原選自滅活的全病毒抗原、減毒活病毒抗原、亞單位抗原、重組活載體和DNA載體抗原；副豬嗜血桿菌抗原選自滅活全菌抗原、減毒活菌抗原、亞單位抗原、重組活載體和DNA載體的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原為亞單位抗原；所述的副豬嗜血桿菌抗原為滅活的全菌抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV20RF2蛋白；所述的副豬嗜血桿囷抗原為滅活的副豬嗜血桿囷JS株和滅活的副豬嗜血桿囷ZJ株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述PCV20RF2蛋白的含量為O. 5^20 μ g/頭份；所述滅活的副豬嗜血桿菌JS株抗原的含量為I X 109^8X109CFU/頭份，所述滅活的副豬嗜血桿菌ZJ株抗原的含量為IX 1(T8X IO9CFU/頭份。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的全病毒抗原；副豬嗜血桿菌抗原為滅活的全菌抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的豬圓環(huán)病毒2型PCV2 SH株，所述的副豬嗜血桿菌抗原為滅活的副豬嗜血桿菌JS株和滅活的副豬嗜血桿菌ZJ株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的副豬嗜血桿菌JS株含量為I X IO9CFU/頭份，所述的副豬嗜血桿菌ZJ株含量為I X IO9CFU/頭份。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其特征在于，所述抗原組合物中含有PCV24.5 X 105_ 0TCID50/頭份，血清4型副豬嗜血桿菌I X 109CFU/頭份，含血清5型副豬嗜血桿菌I X IO9CFU/頭份，疫苗佐劑為10%V/V GEL佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于，還可包含其它的豬病原體的附加抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗原組合物，其特征在于，所述的其它的豬病原體附加抗原選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原、豬肺炎支原體抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒(SIV)抗原或它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利12所述的疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、卡波姆、Montanide Gel0
13.根據(jù)權(quán)利12所述的疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑優(yōu)選為Montanide Gel。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病藥物中的應(yīng)用。
15.一種副豬嗜血桿菌，其特征在于，其特征在于，所述副豬嗜血桿菌為副豬嗜血桿菌血清4型JS株，保藏號(hào)為CCTCC NO.M2011172 ;與副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，保藏號(hào)為CCTCC No. M2011173。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬用多聯(lián)疫苗組合物，具體涉及一種同時(shí)抵抗豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌(HPS)感染的疫苗組合物。疫苗組合物包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種副豬嗜血桿菌抗原及獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可得的載體、賦形劑及佐劑。所述疫苗組合物可用于預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102988978SQ20121018084
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司