專利名稱：對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及載體疫苗技術(shù)，具體地說是對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)多價載體疫苗及其應(yīng)用，屬于基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說是表面展示對蝦白斑綜合癥病毒抗原蛋白的鰻弧菌重組載體疫苗及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對蝦是主要在亞洲和拉丁美洲特別為出口目的生產(chǎn)的高價值水產(chǎn)品，目前主要的養(yǎng)殖品種為南美白對蝦、斑節(jié)對蝦和中國對蝦，其中南美白對蝦已成為我國目前養(yǎng)殖量最大的對蝦品種，年產(chǎn)量達(dá)70余萬噸，位居世界第一。然而在過去的近20年里，主要由于弧菌病和病毒病，對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)了相當(dāng)嚴(yán)重的問題，其中白斑綜合癥病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)和弧菌為重要病害兀兇。對全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)來說，白斑綜合癥病毒被認(rèn)為是最為嚴(yán)重的病毒病原之一，毎年的白斑 病發(fā)病率高達(dá)40%以上，并可在3-10天內(nèi)造成全球毎年高達(dá)30億美元的對蝦病害損失。我國所有對蝦養(yǎng)殖區(qū)域基本都已爆發(fā)了日趨嚴(yán)重的白斑病。細(xì)菌重大病害主要為弧菌屬病原引發(fā)的弧菌病(Vibriosis)，危害全球所有養(yǎng)殖對蝦品種，多發(fā)于6-9月間。在蝦苗孵育階段臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)光，腸道破壞，病害爆發(fā)時可一夜間導(dǎo)致100%死亡率。這些重大病害已成為我國和全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重制約因素。白斑綜合癥病毒(WSSV)是引起對蝦白斑病的元兇，它屬Nimaviridae科Whispovirus屬的代表種,是ー種無包涵體、有囊膜的桿狀病毒(van Hulten, et al. 2001.Virology. 286(1) : 1-22)。它能高致死率地侵染絕大多數(shù)種類的對蝦，此外還可以侵染淡水及海洋生態(tài)中的多種蟹類、龍蝦類、端足類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此針對對蝦白斑綜合癥病毒的防治技術(shù)開發(fā)受到廣泛關(guān)注。近年的研究表明，白斑綜合癥病毒(WSSV)的重組囊膜蛋白可以誘導(dǎo)對蝦產(chǎn)生抗病保護(hù)效應(yīng)。目前，國內(nèi)外在研究WSSV疫苗上取得了很大的進(jìn)展。已研發(fā)的包括有核酸類疫苗(Rout N，et al. 2007. Vaccine. 25:2778-2786;Rajeshkumar S，et al. 2009. 26(3) :429-437等)和重組疫苗(Witteveldt J, et al. 2004b. J Virol. 78:2057-2061 ;ffitteveldt J, etal. 2004a. Fish Shellfish Immunol. 16:571-579;Mavichak R. et al. 2010.J FishDis. 33:69-74等)。Witteveldt J等發(fā)現(xiàn)VP28的亞單位疫苗對對蝦免受WSSV的感染起到重要的保護(hù)作用，其免疫保護(hù)率達(dá)到70%。除此以外，Yu Mi Ha等人發(fā)現(xiàn)WSSV的囊膜蛋白VP19在 WSSV 侵染對蝦時起到重要作用(Yu Mi Ha, et al. 2008. J Env Bio, 29 (4) : 513-517)。寧德剛等人(D. Ning, et al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111: 1327-1336)通過基于Cot衣殼蛋白基因展示系統(tǒng)將VP28蛋白展示到枯草芽孢桿菌的表面，通過ロ服的方式免疫龍蝦，其免疫保護(hù)率達(dá)到80%。2011年美國Harrisvaccine公司證明在注射的條件下VP19的免疫保護(hù)率要優(yōu)于VP28，VP19的免疫保護(hù)率是70%而VP28的免疫保護(hù)率是40% Cj. Dustion Loy, DVM global aquaculture advocate May/June 2011)。而 JeroenWitteveldt通過研究發(fā)現(xiàn)，VP19和VP28在不同的給藥方式下，其免疫保護(hù)率是有區(qū)別的，在注射的條件下VP19的免疫保護(hù)率高于VP28 ;在ロ服的條件下VP28的免疫保護(hù)率高于VP19 ;當(dāng)兩個共同作用的時候其免疫保護(hù)效果要低于單個使用?；谏鲜銮叭说难芯拷Y(jié)果，本發(fā)明使用的WSSV的抗原蛋白是VP28和VP19。但目前的研究工作也存在著很多不足之處，其中ー個主要方面在于現(xiàn)有研究エ作所使用的細(xì)菌載體非常単一，主要為枯草芽孢桿菌，世界范圍內(nèi)，以天然無毒或人工減毒的水產(chǎn)病原菌為載體進(jìn)行對蝦多價載體疫苗開發(fā)還處于空白。以病原細(xì)菌的天然無毒或人工減毒株為活菌載體，借助細(xì)菌的外膜定位元件對來源于其他病原微生物(包括細(xì)菌、病毒)的多種抗原因子進(jìn)行細(xì)菌展示，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生針對兩種以上病原體的多重免疫應(yīng)答，是開發(fā)高效多價的載體疫苗的理想途徑，以此展示并導(dǎo)入抗原的策略在疫苗設(shè)計方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(I)通過細(xì)菌展示的多肽抗原更易被免疫系統(tǒng)識別；(2)細(xì)菌的外膜蛋白、脂多糖和分泌的毒素具有強(qiáng)免疫原性，可作為所展示外源蛋白的免疫佐劑，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更為強(qiáng)烈和持久的免疫應(yīng)答；(3)通過展示不同類型的抗原因子可以產(chǎn)生多效價的疫苗；(4)活菌載體本身保持了對宿主的侵入能力，可以通過浸泡或ロ服完成免疫過程，從而使得免疫方式更為簡單和有效；(5)疫苗的生產(chǎn)只需通 過細(xì)菌大規(guī)模培養(yǎng)即可實(shí)現(xiàn)，成本低廉并且操作簡單。冰核蛋白INP是ー種發(fā)現(xiàn)于歐氏桿菌、假單胞菌和黃單胞菌屬的膜蛋白，在過冷水中，它能促進(jìn)冰晶的形成。冰核蛋白可以分為三個結(jié)構(gòu)功能域N端結(jié)構(gòu)域(N_Terminaldomain)、C端結(jié)構(gòu)域(C-Terminaldomain)及中央結(jié)構(gòu)域(Centraldomain)。其N端和C端結(jié)構(gòu)域分別由175個和49個氨基酸組成，被認(rèn)為是具有外膜定位功能的元件。冰核蛋白表面展示系統(tǒng)被認(rèn)為是迄今以來最為理想的異源蛋白展示系統(tǒng)(Lee YP, Chung GH,Rhee JS. 2003. Trends Biotechnol 21:45-52)，其優(yōu)點(diǎn)包括穩(wěn)定的表達(dá)和外膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力；內(nèi)部重復(fù)單位長度可調(diào)整，從而調(diào)節(jié)外源蛋白和膜表面之間的距離；通過冰晶核形成活性試驗(yàn)可檢測異源蛋白是否表達(dá)在細(xì)胞表面；表達(dá)INP融合蛋白不影響膜的結(jié)構(gòu)和宿主細(xì)胞生長。為此，本發(fā)明基于上述多效價載體疫苗開發(fā)思想，結(jié)合INP表面展示技術(shù)和無毒病原菌活載體的優(yōu)點(diǎn)，將對蝦白斑綜合癥病毒抗原蛋白展示到鰻弧菌表面制備可以保護(hù)對蝦免于鰻弧菌和白斑綜合癥病毒雙重侵染的多價載體疫苗。同時通過表面展示方法可以使多肽抗原更加穩(wěn)定，更利于被免疫系統(tǒng)識別(Jeong, H. S. et al. 2001. Enzyme Microbiol.Technol. 28:155-160.)。本發(fā)明所使用的鰻弧菌是ー株天然的非致病性鰻弧菌，以該菌株制備的疫苗具有保護(hù)對蝦免受鰻弧菌侵染的能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，可通過浸泡方式實(shí)現(xiàn)自然注射效果的接種目的。綜上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種可預(yù)防對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價載體疫苗。其中以INP表面展示方法制備白斑綜合癥病毒VP19和VP28的載體疫苗迄今尚未見任何類似的報道或發(fā)明專利。使用鰻弧菌作為載體菌株制備對蝦多價載體疫苗也未見文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及其應(yīng)用，其以ー株非致病性鰻弧菌野生株HT5301作為載體菌株，以該菌株制備的疫苗具有保護(hù)對蝦免受鰻弧菌侵染的能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，可通過浸泡和ロ服方式給藥，實(shí)現(xiàn)自然注射效果的接種目的，彌補(bǔ)了單ー效價和給藥不方便的技術(shù)應(yīng)用缺陷，使用簡單方便，為對蝦白斑綜合癥病毒病和弧菌病的防治提供了 ー種多效價、安全和經(jīng)濟(jì)的疫苗。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案
生物材料保藏(弧菌科弧菌屬鰻弧菌Vibrio anguillarum) HT5301保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCCNO :M2012161，保藏日期是2012年5月8日。
對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述多價載體疫苗是含有對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重組鰻弧菌，所述重組鰻弧菌的細(xì)胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。
作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述重組鰻弧菌由基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ー株非致病性鰻弧菌(Vibrio anguillarum)野生株HT5301獲得,所述非致病性鰻弧菌(Vibrio anguillarum)野生株HT5301的分類命名是弧菌科弧菌屬鰻弧菌，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO :M2012161。本發(fā)明利用丁香假單胞菌的冰核蛋白INP為分子載體，與對蝦白斑綜合癥病毒表面抗原蛋白基因重組，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化非致病性鰻弧菌野生株HT5301得到重組鰻弧菌。所述非致病性鰻弧菌野生株HT5301從我國蘇北對蝦養(yǎng)殖地區(qū)蝦塘內(nèi)分離到，其無弧菌病致病力，經(jīng)生理生化檢測，其具有芳香氨基酸營養(yǎng)缺陷表型。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述重組鰻弧菌的細(xì)胞內(nèi)含有基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP19，該重組質(zhì)粒pHTNVP19含有氨芐青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后連有VP19基因片段，可實(shí)現(xiàn)INP-VP19蛋白的融合表達(dá)。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述重組鰻弧菌的細(xì)胞內(nèi)含有基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP28，該重組質(zhì)粒pHTNVP28含有氨芐青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后連有VP28基因片段，可實(shí)現(xiàn)INP-VP28蛋白的融合表達(dá)。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP19的制備方法為(I)用EcoRI和BamHI對冰核蛋白INP基因片段和質(zhì)粒pUC18進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTN ；(2)用BamHI和PstI對VP19基因片段和重組質(zhì)粒pHTN進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTNVP19。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP28的制備方法為(I)用EcoRI和BamHI對冰核蛋白INP基因片段和質(zhì)粒pUC18進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTN ；(2)用BamHI和PstI對VP28基因片段和重組質(zhì)粒pHTN進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTNVP28。本發(fā)明所采用的重組載體是質(zhì)粒PUC18，其上有復(fù)制原點(diǎn)，可用于質(zhì)粒的擴(kuò)增；還有氨芐青霉素抗性，可用于篩選；除此以外其上還含有原核表達(dá)的啟動子，可用于外源蛋白的表達(dá)。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述VP19基因片段、VP28基因片段均是連接在冰核蛋白INP的N端；所述VP19基因片段是WSSV VP19基因序列(SEQ ID NO: I)全長的編碼序列，所述VP28基因片段是WSSV VP28基因序列(SEQ ID NO: 2)從第30個氨基酸開始到結(jié)束的編碼序列。 所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗在預(yù)防由白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV導(dǎo)致的對蝦白斑綜合癥和預(yù)防由鰻弧菌導(dǎo)致的對蝦弧菌病方面的應(yīng)用。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述多價載體疫苗通過浸泡和ロ服給藥途徑免疫接種對蝦；通過浸泡方式給藥免疫時，浸泡濃度為lX105 lX106CFU/ml，浸泡時間15min ;通過ロ服方式給藥免疫時，投喂劑量為IX IO9IX IO9CFU/克飼料，連續(xù)投喂7天。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述多價載體疫苗通過發(fā)酵培養(yǎng)和凍干制備得到凍干疫苗制品。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，所述培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基或TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度22° (T28° C ;在凍干制備過程中，所述多價載體疫苗添加有凍干保護(hù)齊U，所述凍干保護(hù)劑包括海藻糖和脫脂奶粉，它們的添加量是每IOOg多價載體疫苗中添加3. 5g的海藻糖和5g的脫脂奶粉，凍干疫苗制品的活菌含量不低于50億/毫升。作為本發(fā)明的進(jìn)ー步改進(jìn)，所述LB培養(yǎng)基或TSB培養(yǎng)基按20mg/L的比例補(bǔ)加苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以使蛋白產(chǎn)量足夠。本發(fā)明中，優(yōu)選米用LB培養(yǎng)基,優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為26° C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明的多價載體疫苗以一株非致病性鰻弧菌野生株HT5301作為載體菌株，以該菌株制備的疫苗具有保護(hù)對蝦免受鰻弧菌的侵染能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，免疫效果顯著，具有非常好的水產(chǎn)養(yǎng)殖對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價防治效果。(2)本發(fā)明的多價載體疫苗可通過浸泡和ロ服方式給藥免疫，可對對蝦后期幼體和仔蝦等不同蝦齡階段進(jìn)行接種免疫而獲得高效的免疫保護(hù)力，實(shí)現(xiàn)自然注射效果的接種目的，彌補(bǔ)了単一效價和給藥不方便的技術(shù)應(yīng)用缺陷，使用簡單方便，多效價、安全且經(jīng)濟(jì)，免疫效果顯著。(3)本發(fā)明的多價載體疫苗可制備成凍干疫苗制品，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價值。


圖I為發(fā)明人克隆的WSSV VP19基因序列在Gene Bank上的搜索對比結(jié)果。圖2為發(fā)明人克隆的WSSV VP28基因序列在Gene Bank上的搜索對比結(jié)果。
圖3為浸泡免疫后對對蝦弧菌病的免疫保護(hù)效果曲線圖。圖4為浸泡免疫后對對蝦白斑綜合癥病毒的免疫保護(hù)效果曲線圖。圖5為ロ服免疫后對對蝦白斑綜合癥病毒的免疫保護(hù)效果曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。本發(fā)明實(shí)施例中所用的WSSV VP19基因和VP28基因由本發(fā)明人克隆、測序鑒定并保存，以下是WSSV VP19和VP28的克隆、測序鑒定過程。白斑綜合征病毒感染后發(fā)病死亡的對蝦樣品采于江蘇省南通市如皋市，取上述死亡對蝦樣品的腮組織0. lg，加入5倍的TN緩沖液(0. 02M Tris-HCl, 0. 4M NaCl, pH 7. 4)，以玻璃勻漿器研磨，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清病毒液。用生エ生物工程上海有限公司的病毒DNA快速提取試劑盒(SK8267)提取病毒基因組。_20°C下保存，作為PCR模 板。VP19和VP28的PCR擴(kuò)增引物如下VP19-FE:GCGGAATTCATGGCCACCACGACTAACACTCVP19-RP:GCGCTGCAGTTACTGCCTCCTCTTGGGGTAAVP28-F:CGGGATCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGVP28-R:CGGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG其反應(yīng)體系見本發(fā)明實(shí)施例I中的I. 3PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ；95°C 30s, 55°C 15s，72°C 40s，30 個循環(huán)；72°C延伸 5min。PCR 產(chǎn)物大小分別為VP19 是366bp，VP28是615bp。擴(kuò)增片段克隆于pMD18_T載體中(購自寶生物工程(大連)有限公司)，測序由生エ生物工程上海有限公司完成，重組質(zhì)粒中WSSV的VP19基因序列如SEQ ID NO: I所不，VP19基因序列如SEQ ID NO: 2所不。測序結(jié)果在Gene Bank中(http://blast. ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi)比對。WSSV VP19 基因序列與 Gene Bank 中序列號為⑶734035等同源性為99% (圖I所示)。WSSV VP28基因序列與Gene Bank中序列號為EF534254和DQ013883的同源性為100%，而與EU414753等同源性為99% (圖2所示)。實(shí)施例I :以冰核蛋白INP為載體蛋白表面展示VP19的重組鰻弧菌載體疫苗的制備。I分子生物學(xué)操作I. I冰核蛋白INP基因的獲取用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(購自生エ生物工程上海有限公司，SK8225)提取丁香假單胞菌丁香致病種ICMP3203的基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩. 2分子生物學(xué)技術(shù)所有質(zhì)粒構(gòu)建采用Samtoook等人所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行，用于本發(fā)明的所有回收DNA片段均采用生エ生物工程上海有限公司凝膠回收試劑盒分離純化，所有的測序均由生エ生物工程上海有限公司測序。1.3PCR 擴(kuò)增用于基因擴(kuò)增的引物由生エ生物工程上海有限公司合成，為便于擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆，部分引物的5’端添加限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系中含10mmol/L Tris-HCl(pH 8. 3),50mmol/L MgCl2，上下游引物各 lOOpmol，200 y mol/L dNTPs，50ng 模板 DNA，2. 5UDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序根據(jù)不同引物特征設(shè)置。PCR擴(kuò)增的引物如下INP-F GCCGAATTCTGAGGATGCTGTAATGAAINP-R GCCGGTACCAATCAGATCACTGTGVP19-F GGCGGTACCATGGCCACCACGACTAACACTCVP19-R GCGCTGCAGTTACTGCCTCCTCTTGGGGTAAPCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性 5min ;95°C 30s，55°C 15s，72°C 40s，30 個循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物大小為617bp。2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 (I)用EcoRI和BamHI對冰核蛋白INP基因片段和質(zhì)粒pUC18進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTN ；(2)用BamHI和PstI對VP19基因片段和重組質(zhì)粒pHTN進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTNVP19。3表面展示VP19的重組鰻弧菌載體疫苗的制備3. I制備鰻弧菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)(I)用接種環(huán)蘸取少許鰻弧菌菌液稀釋劃線于TCBS固體培養(yǎng)基上，于28°C倒置培養(yǎng) 16h ；(2)挑取單菌落接種于5ml TSB (2% NaCl)液體培養(yǎng)基中，28°C，200r/min搖床培養(yǎng) 16h ；(3)按1%的接種量將鰻弧菌菌液接種于50ml TSB (2% NaCl)液體培養(yǎng)基中；(4) 28°C，200r/min 培養(yǎng) 3h 至 0D600=0. 5，置于冰水浴預(yù)冷 30min ；(5)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50ml預(yù)冷的離心管中，4°C恒溫，5000g離心IOmin ；(6)棄盡上清液，將菌體置于冰水浴中，用20ml預(yù)冷的272mmol/L蔗糖溶液輕輕混勻洗漆一次，4°C恒溫,5000g離心IOmin ；(7)棄盡上清液，將菌體置于冰水浴中，用IOml預(yù)冷的272mmol/L蔗糖溶液輕輕混勻洗漆一次，4°C恒溫,5000g離心IOmin ；(8)棄盡上清液,將沉淀用Iml預(yù)冷的272mmol/L鹿糖溶液重新輕輕懸浮；(9)每管100 U I分裝至預(yù)冷的Eppendorf管中(冰水浴中操作)，加入等體積的甘油，迅速置-80 V冰箱冷凍保藏。3. 2表面展示VP19的重組鰻弧菌的篩選和鑒定( I)從_80°C冰箱取一管鰻弧菌感受態(tài)細(xì)胞，手心融化，迅速置于冰水浴中；(2)加入5 U I重組質(zhì)粒pHTNVP19，輕輕混勻，冰水浴中放置30min ；(3)將電轉(zhuǎn)移參數(shù)設(shè)置成電壓為2kv，時間為5ms ；(4)將混合液移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)；(5)快速轉(zhuǎn)移至冰水浴中放置l-2min，加入900 ill TSB (2% NaCl)培養(yǎng)基，28°C搖床復(fù)蘇培養(yǎng)3h ；(6)離心后去除900 U I上清，以剩余的100 U I液體重懸菌體沉淀，并也涂布于適當(dāng)?shù)腡SA (2% NaCl，Amp IOOu g/ml)固體培養(yǎng)基上；(7)置于28°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24h，挑選出單菌落搖菌驗(yàn)證；(8)挑取轉(zhuǎn)化正確的單克隆接種于5ml TSB (2% NaCl,Amp 100 ii g/ml)培養(yǎng)基中，28 °C，200r/min 搖床培養(yǎng) 16h ；(9) ー級種子按 1:100 接種于 15ml TSB (2% NaCl，Amp 100 y g/ml)培養(yǎng)基中，28 °C，200r/min 恒溫表達(dá) 24h ；(10) SDS-PAGE 檢測表達(dá)結(jié)果。實(shí)施例2 以冰核蛋白INP為載體蛋白表面展示VP28的重組鰻弧菌載體疫苗的制備。
I分子生物學(xué)操作具體操作方法同本發(fā)明實(shí)施例I中的分子生物學(xué)操作PCR擴(kuò)增的引物如下INP-F GCCGAATTCTGAGGATGCTGTAATGAAINP-R GCCGGTACCAATCAGATCACTGTGVP28-FB’ :CGGGATCCCACAACACTGTGACCAAGVP28-R:CGGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG2重組質(zhì)粒的構(gòu)建(I)用EcoRI和BamHI對冰核蛋白INP基因片段和質(zhì)粒pUC18進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTN ；(2)用BamHI和PstI對VP28基因片段和重組質(zhì)粒pHTN進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)過16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選重組體，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并對酶切正確的克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PHTNVP28。3表面展示VP28的重組鰻弧菌載體疫苗株的制備3. I制備鰻弧菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)具體操作方法同本發(fā)明實(shí)施例I中的制備鰻弧菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)3. 2表面展示VP28的重組鰻弧菌的篩選和鑒定具體操作方法同本發(fā)明實(shí)施例I中3. 2，只是將重組質(zhì)粒由pHTNVP19更換成PHTNVP28。實(shí)施例3 :凍干疫苗制品的制備。載體疫苗的培養(yǎng)取I接種保存于LB斜面固體培養(yǎng)基(大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，瓊脂18g/L，pH 7. 6)上的載體疫苗株基礎(chǔ)種子(實(shí)施例I制備)，接種于裝有IOOml液體LB種子培養(yǎng)基(大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，pH7. 6，100mg/ml氨芐青霉素)的500ml三角搖瓶，在26°C下恒溫振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘)。12小時后，按3%的接種量將生長旺盛的疫苗菌液(0D=4. 0左右)接種于新鮮富鐵LB發(fā)酵培養(yǎng)基(大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，檸檬酸鐵銨0. 2-0. 5mmol,PH6. 8 7. 2)，26°C恒溫振蕩培養(yǎng)16 18小時后收集疫苗發(fā)酵液備用。疫苗凍干制備按照每IOOg多價載體疫苗中添加3. 5g的海藻糖和5g的脫脂奶粉的比例向多價載體疫苗中添加海藻糖和脫脂奶粉作為凍干保護(hù)劑(滅菌)，充分混勻后，放入已滅菌處理的凍干機(jī)內(nèi)，按照如下凍干參數(shù)進(jìn)行凍干制備預(yù)冷至4°C，維持0. 5h，降溫至_45°C后凍結(jié)3h，然后升溫至_15°C，抽真空并維持8 9h后繼續(xù)升溫至28°C，維持6 8h(剰余水分降至4%以下，可判結(jié)為凍干終點(diǎn))。真空壓蓋鋁封后于_15°C保存?zhèn)溆?。凍干疫苗制品在給藥時是按如下的方法進(jìn)行的首先將凍干疫苗制品取出后置于室溫下(25°C 26°C)，用無菌海水按照凍干粉原液體積進(jìn)行復(fù)水，再用無菌海水稀釋成所需菌密度(此時即可采用浸泡方式給藥)。然后加玉米粉吸附，烘干，用研缽研磨并過篩，獲得含菌玉米粉。采用ロ服方式給藥時，稱取上述含菌玉米粉，用水?dāng)嚢杈鶆?，加入對蝦飼料拌勻，晾干備用。實(shí)施例4 :浸泡免疫接種南美白對蝦對對蝦弧菌病的免疫保護(hù)評價。將南美白對蝦糠蝦培育至后期幼體PL15階段后，將健康的對蝦幼體隨機(jī)分組，每組500尾。疫苗凍干品復(fù)水活化將凍干疫苗制品取出后置于室溫下(25°C 26°C)用無菌海 水按照凍干粉原液體積進(jìn)行復(fù)水，后用無菌海水稀釋成所需菌密度備用。將上述制備的載體疫苗活菌采用浸泡方式免疫對蝦幼體，作為載體疫苗浸泡組，該浸泡組的浸泡菌密度為lX105CFU/ml，浸泡時間控制在15分鐘左右，浸泡中保持通氣充分。另外設(shè)置ー組對照組，所述對照組只浸泡滅菌海水，作為無菌海水浸泡組。免疫接種處理后所有對蝦幼體繼續(xù)養(yǎng)殖4周，4周后用鰻弧菌野生毒株按照I X 107CFU/ml的密度進(jìn)行浸泡感染攻毒，攻毒后連續(xù)觀察對照組和免疫組，記錄死亡數(shù)，按下述公式計算每組的免疫保護(hù)力，計算結(jié)果如圖3所示。免疫保護(hù)力％ =(對照組死亡率-試驗(yàn)組死亡率)/對照組死亡率X 100%結(jié)果分析由圖3中可以看出載體疫苗對弧菌病具有很好的免疫效果，可大大降低南美白對蝦的死亡率。實(shí)施例5 :浸泡免疫接種南美白對蝦對對蝦白斑綜合癥病毒的免疫保護(hù)評價。將南美白對蝦培育至仔蝦階段(平均體重IOg/尾)后，將健康的對蝦隨機(jī)分組，每組500尾。用實(shí)施例I制備的載體疫苗采用浸泡方式免疫對蝦，作為HT5301-A1浸泡組；用實(shí)施例2制備的載體疫苗采用浸泡方式免疫對蝦，作為HT5301-A2浸泡組；設(shè)置兩組對照組，一組對照組浸泡滅菌海水，作為無菌海水浸泡組；另外一組用非致病性鰻弧菌(Vibrioanguillarum)野生株HT5301采用浸泡方式免疫對蝦，作為HT5301浸泡組。上述HT5301-A1浸泡組、HT5301-A2浸泡組和HT5301浸泡組的浸泡菌密度為I X 105CFU/ml，浸泡時間控制在15分鐘左右，浸泡中保持通氣充分。接種處理后所有對蝦繼續(xù)養(yǎng)殖4周，4周后對蝦白斑綜合癥病毒液按照lX107CFU/ml的密度進(jìn)行浸泡感染攻毒，攻毒后連續(xù)觀察對照組和免疫組，記錄死亡數(shù)，按下列公式計算每組的免疫保護(hù)カ，計算結(jié)果如圖4所示。免疫保護(hù)力％ =(對照組死亡率-試驗(yàn)組死亡率)/對照組死亡率X 100%結(jié)果分析由圖4中可以看出在浸泡免疫接種的條件下，實(shí)施例I制備的載體疫苗(HT5301-A1)和實(shí)施例2制備的載體疫苗(HT5301-A2)均對對蝦白斑綜合癥病毒具有良好的免疫保護(hù)效果，可大大降低南美白對蝦的死亡率。并且實(shí)施例I制備的載體疫苗免疫保護(hù)效果優(yōu)于實(shí)施例2制備的載體疫苗。實(shí)施例6 : ロ服免疫接種南美白對蝦對對蝦白斑綜合癥病毒的免疫保護(hù)評價。
將南美白對蝦培育至仔蝦階段(平均體重IOg/尾)后，將健康的對蝦隨機(jī)分組，每組500尾。用實(shí)施例I制備的載體疫苗采用ロ服方式免疫對蝦，作為HT5301-A1 ロ服組；用實(shí)施例2制備的載體疫苗采用ロ服方式免疫對蝦，作為HT5301-A2 ロ服組；設(shè)置兩組對照組，一組對照組喂食正常飼料，作為正常ロ服組；另外一組用非致病性鰻弧菌(Vibrioanguillarum)野生株HT5301采用ロ服方式免疫對蝦，作為HT5301 ロ服組。接種處理后所有對蝦繼續(xù)養(yǎng)殖4周，4周后喂食包裹有對蝦白斑綜合癥病毒的飼料進(jìn)行感染攻毒，攻毒后連續(xù)觀察對照組和免疫組，記錄死亡數(shù)，按下列公式計算每組的免疫保護(hù)力，計算結(jié)果如圖5所示。免疫保護(hù)力％ =(對照組死亡率-試驗(yàn)組死亡率)/對照組死亡率X 100%結(jié)果分析由圖5中可以看出在ロ服免疫接種的條件下，實(shí)施例I制備的載體疫 苗(HT5301-A1)和實(shí)施例2制備的載體疫苗(HT5301-A2)均對對蝦白斑綜合癥病毒具有良好的免疫保護(hù)效果，可大大降低南美白對蝦的死亡率。并且實(shí)施例2制備的載體疫苗免疫保護(hù)效果優(yōu)于實(shí)施例I制備的載體疫苗。序列表〈110〉無錫海健生物科技有限公司〈120〉對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>366<212>DNA〈213〉對蝦〈400〉Iatggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggccct 60tcttacacca tggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg cctctttttg 120atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca 180aagaaggaca gcgattctga cactgataag gacaccgatg atgatgacga cactgccaac 240gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg 300tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc accgttttta tgtcttaccc caagaggagg 360cagtaa366<210>2<211>615<212>DNA〈213〉對蝦<400>2atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 60gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac 120acaggcaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt 180ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 240
權(quán)利要求
1.對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述多價載體疫苗是含有對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重組鰻弧菌，所述重組鰻弧菌的細(xì)胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。
2.如權(quán)利要求I所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述重組鰻弧菌由基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一株非致病性鰻弧菌(Vibrioanguillarum)野生株HT5301獲得，所述非致病性鰻弧菌(Vibrio anguillarum)野生株HT5301的分類命名是弧菌科弧菌屬鰻弧菌，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO M2012161o
3.如權(quán)利要求I所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗株，其特征在于所述重組鰻弧菌的細(xì)胞內(nèi)含有基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP19，該重組質(zhì)粒PHTNVP19含有氨芐青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后連有VP19基因片段，可實(shí)現(xiàn)INP-VP19蛋白的融合表達(dá)。
4.如權(quán)利要求I所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗株，其特征在于所述重組鰻弧菌的細(xì)胞內(nèi)含有基于冰核蛋白INP表面展示系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHTNVP28，該重組質(zhì)粒PHTNVP28含有氨芐青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后連有VP28基因片段，可實(shí)現(xiàn)INP-VP28蛋白的融合表達(dá)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述VP19基因片段、VP28基因片段均是連接在冰核蛋白INP的N端；所述VP19基因片段是WSSVVP19基因序列(SEQ ID NO: I)全長的編碼序列，所述VP28基因片段是WSSV VP28基因序列(SEQ ID NO:2)從第30個氨基酸開始到結(jié)束的編碼序列。
6.權(quán)利要求I飛任一項所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗在預(yù)防由白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV導(dǎo)致的對蝦白斑綜合癥和預(yù)防由鰻弧菌導(dǎo)致的對蝦弧菌病方面的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述多價載體疫苗通過浸泡和口服給藥途徑免疫接種對蝦；通過浸泡方式給藥免疫時，浸泡濃度為1\10卜1\1(^^~1111，浸泡時間i5min ;通過口服方式給藥免疫時，投喂劑量為ixio9 4xio9cfu/克飼料，連續(xù)投喂7天。
8.如權(quán)利要求Γ5任一項所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述多價載體疫苗通過發(fā)酵培養(yǎng)和凍干制備得到凍干疫苗制品。
9.如權(quán)利要求8所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，所述培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基或TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度22° (T28° C ;在凍干制備過程中，所述多價載體疫苗添加有凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑包括海藻糖和脫脂奶粉，它們的添加量是每IOOg多價載體疫苗中添加3. 5g的海藻糖和5g的脫脂奶粉，凍干疫苗制品的活菌含量不低于50億/毫升。
10.如權(quán)利要求9所述的對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于所述LB培養(yǎng)基或TSB培養(yǎng)基按20mg/L的比例補(bǔ)加苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以使蛋白產(chǎn)量足夠。
全文摘要
本發(fā)明涉及對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及其應(yīng)用。所述多價載體疫苗是含有對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重組鰻弧菌，所述重組鰻弧菌的細(xì)胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。本發(fā)明以一株非致病性鰻弧菌野生株HT5301作為載體菌株，以該菌株制備的疫苗具有保護(hù)對蝦免受鰻弧菌侵染的能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，可通過浸泡和口服方式給藥，實(shí)現(xiàn)自然注射效果的接種目的，彌補(bǔ)了單一效價和給藥不方便的技術(shù)應(yīng)用缺陷，使用簡單方便，為對蝦白斑綜合癥病毒病和弧菌病的防治提供了一種多效價、安全和經(jīng)濟(jì)的疫苗。
文檔編號A61K39/106GK102764433SQ20121018674
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
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