一種異鼠李素的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種異鼠李素的新用途，所述的新用途是指以異鼠李素作為活性成分用于制備治療腸炎的藥物或保健食品。研究結(jié)果表明：異鼠李素可以明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、血便、結(jié)腸縮短和組織病理損傷等癥狀，可抑制結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，因此，以異鼠李素作為活性成分可望開發(fā)成治療腸炎的藥物或保健食品，尤其可望開發(fā)成治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
【專利說明】一種異鼠李素的新用途【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及異鼠李素的一種新用途，具體說，是涉及異鼠李素在制備治療腸炎的藥物或保健食品中的應(yīng)用，屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis, UC)屬于炎癥性腸病(Inf lammatory boweldisease, IBD)，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，免疫系統(tǒng)異常是造成炎癥和組織損傷的內(nèi)在因素，并與遺傳、環(huán)境、微生物等因素密切相關(guān)。臨床表現(xiàn)主要是腹瀉、腹痛、粘液膿血便和反復(fù)發(fā)作。結(jié)腸鏡檢可見黏膜充血、水腫、糜爛出血及潰瘍。國外流行病學(xué)資料顯示，本病可發(fā)生于任何年齡，多見于20-40歲的青壯年，在15-25歲好發(fā)人群中發(fā)病率為50~100/10萬。近年來隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢。本病病程長，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且長期患者中有5~10%發(fā)生癌變，臨床上至今尚無有效治療措施，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。
[0003]目前治療UC的西藥主要有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類以及免疫抑制劑。效果都不很理想，且副作用大，不易長期使用。柳氮磺胺吡啶(SASP)是目前臨床最常用的藥物，適用于中度、輕度和慢性UC患者?？诜笤谀c內(nèi)分解為磺胺吡啶及5-氨基水楊酸。對結(jié)腸腸壁組織有特別親和力，起到抗炎作用?？诜ASP后有10%~40%的患者出現(xiàn)惡心、消化不良、頭痛、白細(xì)胞下降等不良反應(yīng)，偶有引起關(guān)節(jié)痛、皮疹、蛋白尿及胰腺炎等，多數(shù)不良反應(yīng)都?xì)w因于SASP的磺胺吡啶部分。
[0004]由于我國中藥資源豐富，從天然植物中篩選具有活性的新化合物或已知結(jié)構(gòu)的天然化合物的新用途已成為新藥開發(fā)的主要途徑之一。因此，本領(lǐng)域迫切需要從天然植物中尋找高效、低毒的治療UC的藥物。
[0005]異鼠李素是從銀杏、沙棘等藥用植物中分離提純的黃酮類化合物，亦廣泛存在于其他多種植物的花、果實和葉中。大量研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素具有保護(hù)心血管(抗心肌缺氧、缺血，緩解心絞痛、抗心律失常、降低血清膽固醇、促進(jìn)血流通暢等)、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗過敏及調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。但目前未見異鼠李素可作為活性成分用于制備治療腸炎的藥物或保健食品的相關(guān)報道。
[0006]在飲用水中加入葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)直接給動物自由飲用，造成結(jié)腸黏膜的組織結(jié)構(gòu)破壞和炎性細(xì)胞浸潤，是國際通用的潰瘍性結(jié)腸炎造模方法(Gastroenterology, 1990,98:694-702 ;Digestive Disease and Science,1993,38:1722-34)。此種造模方法引起的病灶部位主要集中于結(jié)腸，也可累及小腸，其癥狀類似人類潰瘍性結(jié)腸炎(Yatrik M Sha, etal.Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol.2007，292:G1114_1122)，所以目前被廣泛采用(中國專利00118309.5“二甲硅油治療潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用”)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種異鼠李素的新用途，以充分發(fā)揮異鼠李素在臨床中的藥用價值。
[0008]本發(fā)明所述的異鼠李素的一種新用途，是指以異鼠李素作為活性成分用于制備治療腸炎的藥物或保健食品。
[0009]作為一種優(yōu)選方案，所述的異鼠李素的一種新用途，是指以異鼠李素作為活性成分用于制備治療小腸炎或/和結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
[0010]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述的異鼠李素的一種新用途，是指以異鼠李素作為活性成分用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
[0011]上述的異鼠李素的純度推薦>50%，以>90%較佳，以>98%最佳。
[0012]上述的藥物可以是任何可藥用的劑型，包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑等；優(yōu)選口服劑型，如:膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。所述的口服劑型可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進(jìn)行包衣。適宜的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑；適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉；適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂；適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。
[0013]實驗結(jié)果表明，異鼠李素可以明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、血便、結(jié)腸縮短和組織病理損傷等癥狀，可抑制結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。因此，以異鼠李素作為活性成分可望 開發(fā)成治療腸炎的藥物或保健食品，尤其可望開發(fā)成治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重的影響；
[0015]圖2體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血便發(fā)生率的影響；
[0016]圖3體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響；
[0017]圖4-5體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理的影響；
[0018]圖6體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的TNF-α表達(dá)的影響；
[0019]圖7體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的IL-6表達(dá)的影響；
[0020]圖中:a表示正常對照組，b表示模型對照組，c表示陽性對照組，d表示用藥組。
【具體實施方式】
[0021 ] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。
[0022]實施例中所用的異鼠李素來源為市售，如Sigma化學(xué)公司、成都曼斯特生物科技有限公司等，所用樣品的純度均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。
[0023]實施例
[0024]1、實驗材料
[0025]1.1 藥材
[0026]異鼠李素(CAS:480-19-3，分子量316.26，HPLC純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司);葡聚糖硫酸鈉(DSS，CAS:9011-18-1,分子量35000~44000，由MP BiomedicalLLC公司生產(chǎn));柳氮磺胺吡啶(SASP，CAS:599-79-1，分子量398.39，HPLC純度≤98%，由Sigma公司生產(chǎn))。
[0027]1.2實驗動物
[0028]體重20±2g的C57BL/6小鼠(8_10周)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SYXK (滬)2009-0069。置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水。
[0029]2、實驗方法
[0030]2.1潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立
[0031]選擇體重均一的C57BL/6小鼠(20±2g，8_10周)，將DSS加入蒸餾水中配成5%(w/V)的溶液，直接給小鼠自由飲用。
[0032]2.2分組及給藥方法
[0033]正常對照組:10只，給予正常飲食。
[0034]模型對照組:10只，給予5%DSS溶液自由飲用5天，從第5天開始換成正常飲用水，同時灌胃給予生理鹽水連續(xù)7天。
[0035]陽性對照組:10只，給予5%DSS溶液自由飲用5天，從第5天開始換成正常飲用水，同時灌胃給予SASP (350mg/kg)連續(xù)7天。
[0036]用藥組:10只，給予5%DSS溶`液自由飲用5天，從第5天開始換成正常飲用水，同時灌胃給予異鼠李素(50mg/kg)連續(xù)7天。
[0037]2.3腸炎的評估
[0038]實驗期間每天記錄體重變化，腹瀉癥狀及血便癥狀。實驗結(jié)束后麻醉并頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，取出結(jié)腸，測量從盲腸到直腸的結(jié)腸長度。并取結(jié)腸做組織切片，進(jìn)行H&E染色。
[0039]結(jié)腸標(biāo)本病理評分:(I)炎癥細(xì)胞的滲出評分標(biāo)準(zhǔn):0分-黏膜固有層內(nèi)有極少量炎癥細(xì)胞，I分-黏膜固有層內(nèi)有較多的炎癥細(xì)胞或黏膜固有層內(nèi)的炎癥細(xì)胞增多，2分-炎癥細(xì)胞擴(kuò)散至黏膜下層，3分-全層均有炎癥細(xì)胞滲出；(2)組織損壞評分標(biāo)準(zhǔn):0分-無黏膜損傷，I分-非連續(xù)的黏膜上皮損壞，2分-表層黏膜糜爛，3分-廣泛的黏膜破損并向腸壁深層擴(kuò)展；將炎癥細(xì)胞的滲出和組織損壞計分相加，計算出組織病理評分(1-6分)。
[0040]2.4熒光定量RT-PCR檢測結(jié)腸組織的TNF- α和IL-6的表達(dá)
[0041]體內(nèi)藥效實驗結(jié)束后取結(jié)腸組織，用Trizol試劑提取結(jié)腸總RNA并定量，取
3μ gRNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。以cDNA為模板，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:2X SYBR Premix Ex Taq (TakaRa, cat:DRR420A) 5 μ L> ForwardPrimer 0.4 μ L、Reverse Primer 0.4uL、50XR0X Reference Dye 0.4 μ L、cDNAl μ L、dH20
2.8 μ L，總體積為10 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù):95°C、30s預(yù)變性，95°C、5s變性，60°C、30s退火，共40個循環(huán)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin內(nèi)參照。引物序列如下:
[0042]mTNF- α:正義鏈 5，—CGTGGAACTGGCAGAAGAGG—3，，
[0043]反義鏈5’ 一AGACAGAAGAGCGTGGTGGC—3’ ；
[0044]mIL-6:正義鏈 5，ACCACGGCCTTCCCTACTTC—3，，
[0045]反義鏈5’ 一CATTTCCACGATTTCCCAGA—3’ ；[0046]β -Actin:正義鏈 5’ 一CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT—3’，
[0047]反義鏈5，GGTCTTTACGGATGTCAACG—3，。
[0048]用PCR擴(kuò)增儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，并得出Ct值。通過計算2_ΛΛετ得出各組基因的相對表達(dá)水平。
[0049]2.5統(tǒng)計分析
[0050]所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)采用單向方差分析(One-way ANOVA)及LSD檢驗，P〈0.05為統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著性。
[0051]3、結(jié)果
[0052]3.1異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用
[0053]3.1.1對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重的影響
[0054]圖1體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重的影響，由圖1可見:正常對照組小鼠的體重增加了 2.7±0.8%，模型組小鼠的體重減輕了 6.8±0.8%，陽性對照組小鼠的體重減輕了 0.7±0.6%，用藥組小鼠的體重減輕了 2.4±0.6% ;進(jìn)一步說明異鼠李素能顯著抑制DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重下降(P〈0.01)。
[0055]3.1.2對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血便發(fā)生率的影響
[0056]圖2體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血便發(fā)生率的影響，由圖2可見:正常對照組小鼠無血便發(fā)生，模型組小鼠的血便發(fā)生率為90±0%，陽性對照組小鼠的血便發(fā)生率為33.3 ±5.8%，用藥組小鼠的血便發(fā)生率為53.3 ±5.8% ;進(jìn)一步說明異鼠李素能顯著減少DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的血便發(fā)生率(P〈0.01)。
[0057]3.1.3對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響
[0058]圖3體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響，由圖3可見:正常對照組小鼠無結(jié)腸縮短發(fā)生，模型組小鼠的結(jié)腸縮短率為37.7±0.5%，陽性對照組小鼠的結(jié)腸縮短率為24.1±0.4%，用藥組小鼠的結(jié)腸縮短率為31.3±0.4% ;進(jìn)一步說明異鼠李素能顯著改善DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸縮短癥狀(P〈0.05)。
[0059]3.1.4對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理的影響
[0060]圖4體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的損傷修復(fù)作用，由圖4可見:模型組小鼠的結(jié)腸組織為典型炎癥黏膜表現(xiàn)，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量炎性細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂，黏膜下層出血、水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張；陽性對照組小鼠和用藥組小鼠的結(jié)腸組織可見病變減輕，潰瘍愈合，黏膜下層出血減輕。
[0061]另外，圖5體現(xiàn)了結(jié)腸標(biāo)本病理評分結(jié)果，正常對照組小鼠計分為0，模型組小鼠計分為5±0.5%，陽性對照組小鼠計分為2.5±0.5%，用藥組小鼠計分為3.5±0.5%，與模型組相比，差異有顯著性(P〈0.05 )。
[0062]綜上結(jié)腸組織病理分析結(jié)果表明:異鼠李素可以減輕結(jié)腸黏膜組織病理損傷和炎性細(xì)胞浸潤。
[0063]3.1.5對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的TNF- α表達(dá)的影響
[0064]圖6體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的TNF-α表達(dá)的影響，由圖6可見:模型組小鼠結(jié)腸組織TNF-α表達(dá)明顯高于正常對照組(P <0.001);灌胃給予SASP或異鼠李素后，小鼠結(jié)腸組織的TNF-α表達(dá)下降，與模型組相比，差異有顯著性(P< 0.001)，表明異鼠李素能顯著抑制DSS引起的炎癥反應(yīng)中TNF-α的表達(dá)。
[0065]3.1.6對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的IL-6表達(dá)的影響
[0066]圖7體現(xiàn)了異鼠李素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的IL-6表達(dá)的影響，由圖7可見:模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6表達(dá)明顯高于正常對照組(P < 0.001);灌胃給予SASP或異鼠李素后，小鼠結(jié)腸組織的IL-6表達(dá)下降，與模型組相比，差異有顯著性(P < 0.01)，表明異鼠李素能顯著抑制DSS引起的炎癥反應(yīng)中IL-6的表達(dá)。
[0067]綜上研究結(jié)果表明，異鼠李素可以明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、血便、結(jié)腸縮短和組織病理損傷等癥狀，可抑制結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。因此，以異鼠李素作為活性成分可望開發(fā)成治療腸炎的藥物或保健食品，尤其可望開發(fā)成治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
[0068]最后有必要在此說明的是:以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種異鼠李素的新用途，其特征在于:以異鼠李素作為活性成分用于制備治療腸炎的藥物或保健食品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異鼠李素的新用途，其特征在于:以異鼠李素作為活性成分用于制備治療小腸炎或/和結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的異鼠李素的新用途，其特征在于:以異鼠李素作為活性成分用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物或保健食品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的異鼠李素的新用途，其特征在于:所述的異鼠李素的純度>50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的異鼠李素的新用途，其特征在于:所述的異鼠李素的純度>90% ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的異鼠李素的新用途，其特征在于:所述的異鼠李素的純度>98% ο
【文檔編號】A61P1/04GK103462957SQ201210187101
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月7日
【發(fā)明者】竇薇, 王崢濤, 張晶晶, 楊莉, 丁麗麗 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)