專(zhuān)利名稱(chēng)：鐘花報(bào)春花或其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鐘花報(bào)春花或其提取物的新用途，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是依賴(lài)于血管新生(Augiogenesis)的。腫瘤自身具備啟動(dòng)和促進(jìn)新生血管生成的能力，以滿(mǎn)足自身的新陳代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的需要，并通過(guò)血管源源不斷地向宿主輸送轉(zhuǎn)移細(xì)胞，并在機(jī)體的其他部位繼續(xù)生長(zhǎng)和誘導(dǎo)血管形成，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。如果沒(méi)有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)1_2_，也不會(huì)出現(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。不 僅實(shí)體腫瘤需要依賴(lài)血管生成，血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如惡性淋巴瘤、白血病等，這些腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也與血管生成密切相關(guān)。不僅如此,血管新生(Augiogenesis)也是其他許多病理過(guò)程的基本事件之一,如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化等。因此，以血管生成為靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)血管新生抑制劑，不但可用于大多數(shù)腫瘤的阻斷和治療，還可以用于對(duì)其他與血管新生有關(guān)的疾病的預(yù)防和治療。鐘花報(bào)春(Primula sikkmensis Hook),屬于報(bào)春花科報(bào)春花屬植物,花黃色,鐘狀，聚生于花葶頂端，主產(chǎn)于西藏東部及南部、青海東南部、四川西部、云南西北部；生于海拔3750— 4500米的林緣濕草地、水溝邊；分布于尼泊爾、錫金、不丹、緬甸。它是ー種常見(jiàn)的藏藥材，藏族民間用全草作止瀉藥，其療效獨(dú)特顯著。具有清熱解毒，瀉肝膽火、止血等作用，還能用于心脈瘀阻、血脈不暢，療效確切，在治療小兒熱痢方面，有效率達(dá)到80%，同吋，由于鐘花報(bào)春資源十分豐富，使其在甘孜藏族地區(qū)廣泛被使用。當(dāng)前對(duì)鐘花報(bào)春的研究多集中在報(bào)春花的系統(tǒng)分類(lèi)、地理分布及資源調(diào)查等方面，也有研究人員對(duì)鐘花報(bào)春花的總黃酮提取エ藝進(jìn)行了初歩研究，他們利用正交試驗(yàn)研究了從鐘花報(bào)春的花中提取總黃酮的優(yōu)選エ藝，井指出以60%こ醇，20倍溶媒用量，回流提取3次，毎次I小時(shí)，提取得到的總黃酮含量較高，提取物中總黃酮含量可達(dá)到7%左右。(邱建平，等，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化鐘花報(bào)春花總黃酮提取エ藝，成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009年4卷4期)。目前，還未見(jiàn)將鐘花報(bào)春花こ醇提取物或總黃酮用于抗血管新生的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鐘花報(bào)春花或其提取物的新用途。本發(fā)明提供了鐘花報(bào)春花或其提取物在制備抑制血管新生的藥物中的用途。進(jìn)ー步地，所述藥物是抑制腫瘤血管新生的藥物。進(jìn)ー步地，所述鐘花報(bào)春花提取物為鐘花報(bào)春花的こ醇提取物。更進(jìn)一歩地，所述鐘花報(bào)春花こ醇提取物，是以鐘花報(bào)春花為原料，采用50-70%ν/Vこ醇提取得到的提取物。進(jìn)ー步優(yōu)選地，所述こ醇濃度為60%V/V。具體地，是以鐘花報(bào)春花為原料，加入20倍量60%こ醇，回流提取3次，每次lh。
其中，所述鐘花報(bào)春花提取物為鐘花報(bào)春花總黃酮，其中，黃酮的含量以蘆丁計(jì)不得低于50%w/w。進(jìn)ー步地，所述鐘花報(bào)春花總黃酮中，黃酮的含量以蘆丁計(jì)為50-60%w/w。更進(jìn)一歩地，鐘花報(bào)春花總黃酮是通過(guò)如下方法制備的(I)取鐘花報(bào)春花，以50-70%V/Vこ醇提取，合并提取液備用；(2)將步驟(I)中的提取液回收こ醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹(shù)脂，先用水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，再用30%-40%的こ醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報(bào)春總黃酮。進(jìn)ー步優(yōu)選地，步驟(I)中采用60%V/Vこ醇提取；步驟(2)中選用30%V/Vこ醇進(jìn)行洗脫。具體地，步驟(I)中，是以鐘花報(bào)春花為原料，加入20倍量60%こ醇，回流提取3次，每次Ih。 進(jìn)ー步優(yōu)選地，所述大孔吸附樹(shù)脂為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。其中，所述的鐘花報(bào)春花為報(bào)春花科報(bào)春花屬植物鐘花報(bào)春Primulasikkimensis Hook 的干燥花。鐘花報(bào)春花及其こ醇提取物和總黃酮，具有良好的血管形成抑制作用，可作為血管新生抑制劑，為臨床癌癥治療用藥提供了一種新的選擇。同吋，鐘花報(bào)春花總黃酮、こ醇提取物的藥效活性與鐘花報(bào)春花內(nèi)含有的単一化合物(如槲皮素、5-羥基黃酮)相當(dāng)、甚至更好，因此，后期用藥時(shí)無(wú)需再對(duì)単一化合物進(jìn)行分離純化，不僅節(jié)省了藥物的生產(chǎn)成本，還提高了藥材的利用率，有利于實(shí)現(xiàn)藥物的エ業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明鐘花報(bào)春花こ醇提取物的制備取鐘花報(bào)春花粗粉，加入20倍量60%こ醇浸泡后，回流提取3次，毎次lh，合并濾液，減壓回收至干，得鐘花報(bào)春花乙醇提取物。實(shí)施例2本發(fā)明鐘花報(bào)春花總黃酮的制備取鐘花報(bào)春花粗粉，加入20倍量60%こ醇浸泡后，加熱回流提取3次，每次lh，合并濾液，減壓回收至無(wú)醇味后，加入適量蒸餾水后，用正丁醇萃取，減壓回收正丁醇溶液至無(wú)正丁醇味后，加入適量蒸餾水溶解，過(guò)濾后，濾液上經(jīng)預(yù)處理的DlOl大孔吸附樹(shù)脂，先用蒸餾水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，然后用30%こ醇洗脫，收集洗脫液，直至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，合并洗脫液，回收溶劑后，干燥即得鐘花報(bào)春花總黃酮，其中，黃酮以蘆丁計(jì)含量為52. 5%。本發(fā)明鐘花報(bào)春花總黃酮的制備方法不限于實(shí)施例中所述的方式，現(xiàn)有的黃酮提取方法均能用于對(duì)鐘花報(bào)春花總黃酮的提取，如堿水提取等；對(duì)總黃酮的精制也可采用其他型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行精制，洗脫溶劑除采用こ醇以外，也可以采用弱堿溶液進(jìn)行洗脫，也可提高黃酮含量。實(shí)施例3鐘花報(bào)春花總黃酮制備方法的篩選I.總黃酮含量測(cè)定方法I · I對(duì)照品溶液的制備取蘆丁對(duì)照品O. 01006g,置于50ml容量瓶中，加60%こ醇定容至刻度，制得濃度為O.2012mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。I. 2樣品溶液的制備按照各制備方法制備得到的浸膏轉(zhuǎn)移至IOOml容量瓶中，并定容至刻度，從此溶液中精密移取IOml于IOOml容量瓶中，并用60%こ醇定容至刻度，即制得樣品溶液，備用。I. 3測(cè)定波長(zhǎng)的確定精密移取對(duì)照品溶液7ml和供試品溶液2ml，分別置于2支25ml容量瓶中，均加入60%こ醇稀釋至7ml，混勻，加5%亞硝酸鈉溶液Iml，搖勻，放置6min，再加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉溶液10ml，再加60%こ醇至刻度，搖勻，放置15min，以 相應(yīng)試劑為空白，照紫外可見(jiàn)分光光度法(《藥典》05年版附錄VA)，在200-800nm進(jìn)行掃描，測(cè)得對(duì)照品溶液和樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)分別為506. 51nm和498. 67nm。兩者的最大吸收波長(zhǎng)接近，因此確定506nm為測(cè)定波長(zhǎng)。I · 4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液(O.2012mg/ml)0. 0ml, I. 0ml, 2. 0ml, 3. 0ml, 4. 0ml, 5. 0ml, 6.0ml, 7. 0ml,分別置于25ml容量瓶中，各加60%こ醇至7. 0ml，加5%亞硝酸鈉溶液(O. 050g/ml)1. 0ml，搖勻，放置6min，再加10%硝酸鋁溶液(O. 09972g/ml) I. Oml，搖勻，放置6min.加氫氧化鈉試液(O. 04308g/ml) 10ml，再加60%こ醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，找紫外可見(jiàn)分光光度法(《藥典》05版附錄V A)，在506nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Υ=12· 785X-0. 001 R2=O. 9992。I. 5樣品液的測(cè)定從供試品溶液中精密移取4ml于I支25ml容量瓶中，然后用60%こ醇溶液稀釋至7. 0ml，然后按照對(duì)照品溶液的顯色方法顯色。精密量取60%こ醇4ml，作為空白對(duì)照，后續(xù)顯色處理同上述對(duì)照品。在506nm處測(cè)定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算總黃酮含量。2、鐘花報(bào)春花總黃酮提取方法考察2. I單因素方法考察本實(shí)驗(yàn)以不同こ醇濃度為考察因素，以鐘花報(bào)春花總黃酮得率為考察指標(biāo)，篩選鐘花報(bào)春花總黃酮的最佳提取エ藝條件。2. I. I儀器與材料(I)儀器與試藥UV-2500 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) PerkinElmer Lambda 35UV/VISSpectrometer ;熱回流裝置，超聲儀，R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，瑞士 PAG — 160A電子天平，F(xiàn)Al 104電子天平(上海精天電子儀器廠)，電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宏興機(jī)械儀器實(shí)業(yè)制造公司)，DGG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，SHE- III循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為10080-200707)，95%こ醇，90%こ醇，80%こ醇，70%こ醇，60%こ醇，5%亞硝酸鈉溶液；10%硝酸鋁溶液；4. 3%氫氧化鈉溶液以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水系重蒸水。(2)實(shí)驗(yàn)藥材
鐘花報(bào)春花由重慶中藥研究所涂永勤博士鑒定為鐘花報(bào)春Primulasikkimensis Hook 的干燥花。2. I. 2方法與結(jié)果(I)總黃酮的提取
取I號(hào)內(nèi)鐘花報(bào)春花適量于托盤(pán)內(nèi)鋪開(kāi)，同時(shí)取II號(hào)內(nèi)鐘花報(bào)春花適量于另ー托盤(pán)內(nèi)鋪開(kāi)，一起放入烘箱中，30°c干燥過(guò)夜。將烘干的藥材快速地用打粉機(jī)打成粗粉，然后平鋪于托盤(pán)中，置于烘箱中30°c干燥一定時(shí)間(約2小吋)然后用袋子封裝好置于干燥器中保存?zhèn)溆?。分別精密稱(chēng)取I號(hào)藥材粉末5. OOOg, 4. 998g，4. 998g，4. 996g，4. 997g，置于5支250ml潔凈的圓底燒瓶中，分別加入IOOml的95%，90%, 80%, 70%, 60%こ醇浸泡藥材30分鐘。分別精密稱(chēng)取II號(hào)藥材粉末4. 997g，5. 000g, 4. 998g，4. 999g，5. 002g,置于5支250ml潔凈的圓底燒瓶中，然后同I號(hào)藥材粉末一祥處理。將I號(hào)和II號(hào)中每?jī)蓚€(gè)所用こ醇濃度相同的樣品置于同一水浴鍋中回流提取2小吋，60%，70%，80%，90%，95%こ醇的水浴溫度分別為86°C,85°C,84. 5°C,83. 5°C,82. 5°C，然后分別趁熱抽濾，濾渣再加IOOml同第一次提取的溶劑回流提取2次，毎次I小時(shí)，然后合并濾液備用。(配制不同濃度こ醇溫度為18°C)。洗10個(gè)大小基本一致的蒸發(fā)皿，置減壓干燥箱中減壓60°c干燥過(guò)夜備用。蒸發(fā)皿減壓干燥后分別精密稱(chēng)重，重量如下所示表I不同こ濃度干燥后的重量
權(quán)利要求
1.鐘花報(bào)春花或其提取物在制備抑制血管新生的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述藥物是抑制腫瘤血管新生的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用途，其特征在于所述鐘花報(bào)春花提取物為鐘花報(bào)春花こ醇提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述鐘花報(bào)春花こ醇提取物，是以鐘花報(bào)春花為原料，采用50-70%V/Vこ醇提取得到的提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述こ醇濃度為60%V/V。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用途，其特征在于所述鐘花報(bào)春花提取物為鐘花報(bào)春花總黃酮，其中，黃酮的含量以蘆丁計(jì)不得低于50%w/w。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述鐘花報(bào)春花總黃酮中，黃酮的含量以蘆丁計(jì)為 50-60%w/w。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用途，其特征在于鐘花報(bào)春花總黃酮是通過(guò)如下方法制備的 (1)取鐘花報(bào)春花，以50-70%V/Vこ醇提取，合并提取液備用； (2)將步驟(I)中的提取液回收こ醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹(shù)脂，先用水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，再用30%-40%的こ醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報(bào)春總黃酮。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于步驟(I)中采用60%V/Vこ醇提??；步驟(2)中選用30%V/Vこ醇進(jìn)行洗脫。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述大孔吸附樹(shù)脂為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的鐘花報(bào)春花為報(bào)春花科報(bào)春花屬植物鐘花報(bào)春Primula sikkimensis Hook的干燥花。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鐘花報(bào)春花或其提取物在制備抑制血管新生的藥物中的用途。鐘花報(bào)春花及其乙醇提取物和總黃酮，具有良好的血管形成抑制作用，可作為血管新生抑制劑，為臨床癌癥治療用藥提供了一種新的選擇。同時(shí)，鐘花報(bào)春花總黃酮、乙醇提取物的藥效活性與鐘花報(bào)春花內(nèi)含有的單一化合物(如槲皮素、5-羥基黃酮)相當(dāng)、甚至更好，因此，后期用藥時(shí)無(wú)需再對(duì)單一化合物進(jìn)行分離純化，不僅節(jié)省了藥物的生產(chǎn)成本，還提高了藥材的利用率，有利于實(shí)現(xiàn)藥物的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102688264SQ20121018952
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者彭騰, 李鴻翔, 賀鋼民, 鄧赟, 邱建平, 陳裕 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)