專利名稱：金銀花水提物和let-7a microRNA在制備預防及治療登革病毒和登革熱藥物與保健品中 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬中草藥制藥技術領域，具體涉及金銀花水提物其在制備預防和治療登革病毒的藥物與保健品中的應用。二
背景技術：
登革熱是熱帶與亞熱帶地區(qū)的蚊蟲傳染病，每年全球約有5億至10億人感染病例，大多為居住在城市或城鎮(zhèn)郊區(qū)的居民。其感染病癥從發(fā)燒疼痛的dengue fever到嚴重內(nèi)出血的dengue hemorrhagic fever與體內(nèi)受損重創(chuàng)導致的休克型dengue shock syndrome,估計在每年全球10億人感染病例中因感染登革熱而衍發(fā)為嚴重內(nèi)出血的denguehemorrhagic fever約為50萬病例及2萬的死亡病例。然而，引起登革熱的登革病毒denguevirus其在體內(nèi)會引起免疫相關的復雜反應，因而導致至今治療登革病毒相關的登革熱疾病只有"頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳"的治療癥狀的"治標"藥，而沒有確實有效能抑制登革病毒活性與增生數(shù)量的"治本"藥或是疫苗。尋找治療或預防登革熱的有效治療藥為本研發(fā)的起因。中草藥金銀花(Lonicera japonica Thunb; honeysuckle)已知其具有治療感染發(fā)熱癥狀的療效。本發(fā)明在于進一步的了解飲用金銀花水提物是否能專門對抗denguevirus引起的疾病,金銀花水提物是否能調(diào)控體內(nèi)抗病毒的microRNA免疫機制,其調(diào)控的體內(nèi)抗病毒的microRNA是否能抗登革病毒，以及其抗病毒的機制。期望因此研究確立金銀花治療登革病毒的機制與功效，佳惠全世界的患者。三

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是確立金銀花可抗登革病毒及其是以調(diào)控體內(nèi)抗病毒的microRNA免疫機制(microRNA immunity)來對抗登革病毒,本發(fā)明的技術方案如下
I.以小鼠為實驗動物模式，按中醫(yī)治療方式喂食金銀花水提物(即中醫(yī)治病時病人所喝的金銀花水提物，俗稱〃金銀花茶〃；制備方式為金銀花干花苞10克加水500毫升，大火煮開后文火煮20分鐘即可。此為一次性服用劑量。治療期須早晚各服一劑，連續(xù)服用
4天)，然后采血，以Solexa deep sequencing測血中microRNA表達譜的改變。2.將血中microRNA表達譜中因喝金銀花水提物而高表達的microRNA做計算機分析預測其抗登革病毒RNA genome的可能性及其總量上的大幅度變化。此實驗與分析證明金銀花水提物可同時調(diào)控體內(nèi)數(shù)個不同的microRNA,這些microRNA中有許多可直接以登革病毒的各個基因為目標，因而推測喝金銀花水提物可因同時調(diào)高多種抗登革病毒的microRNA達到同時攻擊抑制或調(diào)控登革病毒的功效，并大大減少因病毒發(fā)生突變而產(chǎn)生的藥作用點失效的可能性，保證了此金銀花水提物在對抗不同品系的登革病毒的有效性與療方的持久性。
3.將篩選出的〃受金銀花調(diào)控而高表達且計算機分析預測其極有可能可抗登革病毒RNA genome的microRNA"以RNA合成方式大量復制以便運用于細胞學研究。在此我們采用let-7a為抗登革病毒RNA genome的microRNA代表(biomarker),計算機分析預測其極有可能可抗登革病毒RNA genome的NSl gene為目標基因。4.細胞學研究中，我們以 luciferase assay, real time-PCR, Western blot,immunofluorescence cytochemistry分別證明let_7a可抑制含有登革病毒NSl gene的載體的活性，可抑制活體登革病毒制造NSl gene及生成NSl蛋白質(zhì)。因而證實let_7a確實可在細胞內(nèi)抑制登革病毒RNA genome的NSl gene并從而抑制登革病毒制造NSl蛋白質(zhì)，影響病毒的活性。5.小鼠模式研究中，real time PCR證實喝金銀花水提物的小鼠其血液中l(wèi)et-7a會在開始喝后的第2天呈現(xiàn)高表達，并呈周期改變至8天。6.小鼠模式研究中，我們采用"先注射登革病毒入鼠大腦內(nèi)使其感染登革病毒，、再喝金銀花水提物”以研究金銀花水提物對感染登革病毒的療效。實驗證明金銀花水提物可抑制登革病毒在腦內(nèi)制造NSl gene，并明顯降低其所生成的NSl蛋白質(zhì)，與減少感染鼠腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量。感染鼠的疾病征兆比較輕微，存活期較長。感染鼠體內(nèi)let_7a表達量呈現(xiàn)組織特異性在血液中比陰性對照組高，在腦中大為減少。喝金銀花水提物而沒感染登革病毒的鼠其血中腦中l(wèi)et_7a表達量提高。感染鼠喝金銀花水提物者雖然其腦內(nèi)NSl與其腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量下降，但其體內(nèi)let_7a表達量在血與腦中和感染鼠沒喝金銀花水提物者相當。我們推測此為金銀花調(diào)控的各個免疫系統(tǒng)與病毒感染的競爭關系。此實驗建議金銀花水提物其活性成份與體內(nèi)調(diào)控機制以肓接與間接的方式達到抑制登革病毒的療效。其可作用于抑制足以引起致命性出血■型登革熱與休克型登革熱的登革病毒劑量，伹其對改變病毒引起的細胞素風暴(cytokine storm)相關的病兆影響較微。我們依此認為金銀花為能確實有效能抑制登革病毒活性與增生數(shù)量的"治本"藥，在治療登革熱時可進一步嘗試將金銀花與現(xiàn)有的一些治療病兆癥狀的"治標"藥配伍以達到"標，本"兼治的效果。7.小鼠模式研究中，我們采用"先喝金銀花水提物，再注射登革病毒入鼠大腦內(nèi)使其感染登革病毒”以研究金銀花水提物對預防防治登革病毒的療效。實驗證明金銀花水提物可抑制登革病毒在腦內(nèi)制造NSl gene，其在沒有明顯降低其所生成的NSl蛋白質(zhì)狀況下，可減少感染鼠腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量。感染鼠的疾病征兆沒有明顯的比較輕微。感染鼠體內(nèi)let_7a表達量呈現(xiàn)組織特異性在血液和腦中與陰性對照組相當。喝金銀花水提物而沒感染登革病毒的鼠其血中l(wèi)et_7a與陰性對照組相當，其腦中l(wèi)et_7a被高表達。感染鼠喝金銀花水提物者雖然其腦內(nèi)NSl gene與其腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量下降，但其體內(nèi)let_7a表達量在血中呈現(xiàn)被抑制狀態(tài)，在腦中和感染鼠沒喝金銀花水提物者相當。我們推測此為金銀花調(diào)控的各個免疫系統(tǒng)與病毒感染的競爭關系。此實驗建議金銀花水提物其活性成份與體內(nèi)調(diào)控機制以直接與間接的方式達到抑制登革病毒的療效。其可作用于抑制足以引起致命性出血■型登革熱與休克型登革熱的登革病毒劑量，但其不改變病毒引起的細胞素風暴相關的病兆。我們依此認為金銀花為能確實有效抑制登革病毒活性與增生數(shù)量的"治本"藥，在治療登革熱時可進一步嘗試將金銀花與現(xiàn)有的一些治療病兆癥狀的"治標"藥配伍以達到"標，本"兼治的效果。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果是證實喝金銀花水提物可調(diào)控體內(nèi)抗登革病毒microRNA免疫系統(tǒng)(microRNA immunity),其中的抗登革病毒microRNA let_7a的高表達可抑制登革病毒的活性。金銀花水提物可同時調(diào)控多個不同的抗登革病毒microRNA，金銀花水提物從而以直接與間接的方式達到抑制登革病毒的活性與數(shù)量及治療登革熱的療效。此研究確立金銀花治療登革病毒的機制與功效為能確實有效抑制登革病毒活性與增生數(shù)量的〃治本〃藥。依此我們認為在治療登革熱時可進一步嘗試將金銀花與現(xiàn)有的一些治療病兆癥狀的〃治標〃藥配伍以達到〃標，本〃兼治的效果。本發(fā)明所要求金銀花水提物和let-7a microRNA可制備成預防和治療抗登革病毒的藥物，也可治備成抗登革熱的保健食品。四


圖I.金銀花可調(diào)控小鼠血中microRNA表達譜。Solexa sequencing數(shù)據(jù)(以統(tǒng)計學的standard deviation標準偏差數(shù)據(jù)顯示)。其中各個高表達且能抗登革病毒DV2 PL046RNA genome的目標基因的microRNA有特別注明。圖2.金銀花可高表達小鼠血中抗登革病毒microRNA表達量總量。Solexasequencing數(shù)據(jù)以統(tǒng)計圖呈現(xiàn)。
圖3. let_7a可抗登革病毒RNA genome的NSl gene為目標基因。圖4. let_7a可在細胞內(nèi)抑制登革病毒RNA genome的NSl gene并從而抑制登革病毒制造NSl蛋白質(zhì)。(a).以表達量載體做細胞學實驗，let_7a的量越高，對登革病毒基因表達抑制力越大。(b).左圖顯示let_7a對正常的登革病毒NSl基因有抑制力，右圖顯示let_7a對突變的登革病毒NSl基因失去抑制力；因此證明let_7a確實是作用在登革病毒NSl基因上。(c，d, e).當細胞感染活的登革病毒時，let_7a也有同樣的抑制病毒活性的能力，let_7a量越高,活病毒能制造的NSl gene就越少(c),其制出的NSl protein量也下降(d, e)。let_7a對登革病毒引起的不正常細胞Ras protein表達也具有抑制作用⑷。圖5.金銀花調(diào)控體內(nèi)抗登革病毒的let_7a microRNA在血中的量呈周期改變let-7a的量于喝后第2天上升，呈周期性改變至8天。圖6.采用"先注射登革病毒入鼠大腦內(nèi)使其感染登革病毒，再喝金銀花水提物〃以研究金銀花水提物對感染登革病毒的療效。金銀花水提物可抑制登革病毒在腦內(nèi)制造NSl gene (d)，降低其所生成的NSl蛋白質(zhì)(e)，減少感染鼠腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量(f)。喝金銀花水提物的感染鼠其存活期較長(a)，疾病征兆比較輕微(b，C)。感染鼠體內(nèi)let_7a表達量呈現(xiàn)組織特異性(g，h)，據(jù)此推測金銀花調(diào)控的各個免疫系統(tǒng)與病毒感染呈競爭關系，此實驗建議金銀花水提物其活性成份與體內(nèi)調(diào)控機制以直接與間接的方式達到抑制登革病毒的療效。但對改變病毒引起的細胞素風暴相關的病兆影響較微。圖7.采用〃先喝金銀花水提物，再注射登革病毒入鼠大腦內(nèi)使其感染登革病毒〃以研究金銀花水提物對預防防治登革病毒的療效。金銀花水提物可抑制登革病毒在腦內(nèi)制造NSl gene (d)，在不降低其所生成的NSl蛋白質(zhì)狀況下減少感染鼠腦內(nèi)的登革病毒數(shù)量(e, f)。感染鼠的疾病征兆改變不明顯(a，b, C)。感染鼠體內(nèi)let_7a表達量呈現(xiàn)組織特異性(g，h)，據(jù)此推測金銀花調(diào)控的各個免疫系統(tǒng)與病毒感染呈競爭關系，此實驗建議金銀花水提物其活性成份與體內(nèi)調(diào)控機制以直接與間接的方式達到抑制登革病毒的療效。但不改變病毒引起的細胞素風暴相關的病兆。五
具體實施例方式 I.金銀花調(diào)控小鼠血中microRNA表達譜與其計算機預測。
參考中醫(yī)金銀花治發(fā)燒感染的醫(yī)方與中華人民共和國藥典，將人喝的劑量與體重之比例換算成小鼠喝的劑量(即以一般成人約50kg的體重須10克金銀花干花苞為一次性劑量，換算成體重為25克的小鼠就須0. 005克金銀花干花苞為一次性劑量。小鼠喝的金銀花水提物的一次性劑量為0. 2毫升)，然后按照中醫(yī)的金銀花治療方式煮金銀花水提物并依其醫(yī)療方式喂食小鼠(一日兩次，連續(xù)喝4天)。然后采血，抽RNA，交予深圳華大基因公司(BGI，www. genomics, cn)進行 microRNA 的 Solexa deep sequencing 與數(shù)據(jù)分析形成表達譜。表達譜中高表達的microRNA先與miRBase (the microRNA database, www.mirbase. org)數(shù)據(jù)庫做比對以確認鼠與人相同的microRNA，再與ViTa (virus’ miRNA target, vita. mbc. nctu. edu. tw/index, php)數(shù)據(jù)庫做比對預測可抗登革病毒 denguevirus type 2 PL046 sequence (accession number AJ968413) RNA genome 的microRNA。然后以統(tǒng)計方式分析了解喝金銀花水提物對提高血中抗登革病毒的microRNA其量上的改變。見附圖1，2。
權利要求
1.一種金銀花水提物或其影響的let-7a microRNA，其特征是金銀花干花苞10克加水500暈升，大火煮開后文火煮20分鐘。
2.權利要求I所述金銀花水提物在制備預防或治療登革病毒或登革熱藥物中的應用。
3.權利要求I所述金銀花水提物在制備預防或治療登革病毒或登革熱保健品中的應用。
4.權利要求I所述金銀花水提物影響的let-7amicroRNA在制備預防或治療登革病毒或登革熱藥物中的應用。
5.權利要求I所述金銀花水提物影響的let-7amicroRNA在制備預防或治療登革病毒或登革熱保健品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬中草藥制藥技術領域，具體涉及金銀花水提物和let-7amicroRNA在制備預防及治療登革病毒和登革熱藥物與保健品中的應用。本發(fā)明所述金銀花用于提高體內(nèi)microRNA免疫功能的新用途能夠用于治療機體登革病毒感染，以及金銀花所調(diào)控的抗登革病毒的let-7amicroRNA在治療登革熱的藥物與保健品中應用。
文檔編號A61P31/14GK102697832SQ201210191189
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權日2012年6月12日
發(fā)明者劉校生, 甘黛蒂 申請人:南京大學