專利名稱：丹參內(nèi)酯在制備抗腫瘤血管新生藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丹參內(nèi)酯(tanshinlactone)的新用途,特備是涉及其在制備抗腫瘤血管新生藥物中的應用，屬于抗血管新生化合物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤血管新生是一種高度調(diào)節(jié)過程，即在短期內(nèi)發(fā)生，然后完全終止。腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生，首個證實腫瘤產(chǎn)生血管生長因子的理論的實驗，是Greenblatt等的移植黑素瘤或子宮絨毛膜癌細胞促進血管增殖的試驗；結(jié)果表明腫瘤細胞的增殖與血管形成密切相關(guān)，因而提供了腫瘤血管新生是由腫瘤細胞產(chǎn)生的可擴散因子介導的證據(jù)。在主要的血管叢形成后，這些內(nèi)皮細胞由出芽或從原有血管分裂方式形成新毛細血管。血管新生依賴由宿主和腫瘤細胞釋放的多種分子間的平衡，經(jīng)過一系列步驟，包括從血管周邊細胞和基底膜上分離內(nèi)皮細胞，侵入和移出基底膜，最終擴展入腫瘤實質(zhì)中。特異的血管生長 分子能啟動此過程，特異的抑制分子能終止此過程。目前，腫瘤的治療手段主要依賴化學治療，放射治療，手術(shù)治療的方式，但是，這些手段存在副作用大，特異性差等缺點。目前醫(yī)藥界致力于尋找一種作用靶點明確，副作用小，療效良好的藥物，從天然產(chǎn)物中分離制備新的有血管新生抑制作用的化合物成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。丹參內(nèi)酯分子式為C17H12O3,白色針狀結(jié)晶，分子量為264，可由唇形科鼠尾草屬(SlaJvia)多種植物(例如丹參iSavia miItiorrhiza)^甘西鼠尾 (.Salvia przewalskii Maxim),云南鼠尾 (.Salvia yunnanensis C.
H.Wright)等)的干燥根或根莖中提取制得；丹參內(nèi)酯的化學結(jié)構(gòu)式如下
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目前，對于丹參內(nèi)酯的研究，局限于對于其化學結(jié)構(gòu)的研究。在藥理活性方面，將丹參內(nèi)酯單獨作為藥理活性成分的研究沒有報道。近年來，隨著對癌癥、視網(wǎng)膜病變以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機理的進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管新生是一個引發(fā)此類疾病的關(guān)鍵生理步驟，所以血管新生抑制劑的研究也成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一個熱點。目前，比較常見的血管新生抑制劑主要為化學藥，如地非三唑、普利等；也有部分是來自于生物來源，如肽類、外源色素上皮衍生因子等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種丹參內(nèi)酯(tanshinlactone)的新用途，即丹參內(nèi)酯在制備抗腫瘤血管新生藥物中的應用，其作為抗腫瘤血管新生藥物的主要活性成分或與其他活性成分配合使用制成藥物，作為血管新生抑制劑來治療癌癥。本發(fā)明的丹參內(nèi)酯可以從天然植物提取的，也可以是化學合成的。本發(fā)明所述應用中可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、色素和甜味劑等，制成膠囊劑、丸劑、粉劑、片劑、粒劑、口服液和注射液等多種形式。本發(fā)明利用人肝癌細胞株H印G-2，通過MTT實驗，來測試丹參內(nèi)酯對腫瘤細胞的增殖影響；實驗結(jié)果顯示，丹參內(nèi)酯濃度在O. 5、I. 0,2. 5,5. 0U0ug/mL時能夠有效的抑制腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明利用雞胚尿囊膜實驗模型，來測試丹參內(nèi)酯對于體內(nèi)實驗模型血管新生的影響；實驗結(jié)果顯示，丹參內(nèi)酯能夠有效的抑制雞胚尿囊膜血管的生長，在10.0、15.0 ug/mL可以顯著抑制血管新生，其作用強于陽性藥物，顯示出良好的血管新生抑制活性。以上實驗結(jié)果顯示，丹參內(nèi)酯可以抑制血管的異常生長，抑制腫瘤細胞，可以作為血管新生抑制劑的有效成分，單獨應用或者合用或與可接受的賦形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服劑或非口服性用于治療癌癥及血管異常新生引發(fā)的相關(guān)疾病。


圖I是本發(fā)明從云南鼠尾草中分離丹參內(nèi)酯的工藝流程示意圖。圖2是本發(fā)明丹參內(nèi)酯用于人肝癌細胞株IfepG-2的實驗結(jié)果示意圖(不同丹參內(nèi)酯給藥濃度的MTT試驗測試結(jié)果)；
圖3是本發(fā)明丹參內(nèi)酯用于人肝癌細胞株!fepG-2的實驗結(jié)果示意圖(不同濃度丹參內(nèi)酯對!fepG-2細胞株增殖影響的抑制率結(jié)果)；
圖4是本發(fā)明丹參內(nèi)酯對雞胚尿囊膜血管新生抑制作用結(jié)果示意圖(丹參內(nèi)酯作用于雞胚尿囊膜，經(jīng)IPP圖像處理軟件處理后抑制血管生長的實驗結(jié)果)，其中a生理鹽水組，b地塞米松組，c丹參內(nèi)酯5 ug/mL組，d丹參內(nèi)酯10ug/mL組，e丹參內(nèi)酯15 ug/mL組；
圖5是本發(fā)明丹參內(nèi)酯對雞胚尿囊膜血管新生抑制作用結(jié)果示意圖(血管生長面積數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但在本發(fā)明的的保護范圍不限于下述的實施例，實施例中，未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行實驗。實施例I :丹參內(nèi)酯的制備(下述實施例中使用的丹參內(nèi)酯是采用如下方法制備得到的)采用唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草yunnanensis C. H. Wright)的干燥根或根莖10千克，粉碎成粗粉，用25L丙酮冷浸提取，反復三次，濃縮得粗浸膏；浸膏用水配成懸浮液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯段；該段采用硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到5個部分洗脫段，其中9:1洗脫部分再采用硅膠色譜柱，氯仿-丙酮梯度洗脫(依次采用8:1、5:1、3:1洗脫)，將5:1的洗脫部分用RP-C18柱色譜甲醇-水梯度洗脫(依次用80:20、85:15洗脫)，將85:15洗脫部分用葡聚糖凝膠色譜(氯仿-甲醇1:1洗脫)分離純化，最后用半制備高效液相色譜(semipre-HPLC)制備得到丹參內(nèi)酯IOmg (見圖I);其所得核磁數(shù)據(jù)與丹參內(nèi)酯 Luo H-W 等 Tanshinlactone, a novel seco-abietanoid fromSalvia miltiorrhiza. Chem. Pharm. Bull. 1986, 34, 3166-3168.中報道的數(shù)據(jù)一致，1H-NMR和13C-NMR檢測數(shù)據(jù)如下
1H NMR (400 MHz, CDC13) δH
8. 38 (1Η, d, J = 8. 2，H—1), 7.46 (1H, dd, J = 8. 2，8.2，H—2)，7. 38 (1H, d,J = 8.2，H-3), 7.80 (1H, d, J = 8.8，H-6), 7. 74 (1H, d, J = 8.8，H—7)，7. 37 (1H,s, H-16), 2. 36 (3H, s，Me_17), 2.66 (3H, s, Me-18)
13C NMR (100 MHz, CDC13)
δ C 120.6 (C-I)，126.8(C-2), 128.8 (C_3)，134.5 (C_4)，123.3 (C_5)，120.7(C-6), 116.6 (C-7), 110.2 (C_8), 107.9 (C_9)，133. I (C-IO), 158.6 (C—ll), 158.6(C-13), 149.5( C-14), 141.0 (C-15), 120.3 (C—16)，8.5 (C-17), 19.6 (C-18)
根據(jù)以上核磁波譜信息，確定其結(jié)構(gòu)為丹參內(nèi)酯(Tanshinlactone), CAS No.105351-70-0。
實施例2 :丹參內(nèi)酯對人肝癌細胞株IfepG-2增殖的影響實驗
將人肝癌細胞株H印G-2在37°C，5% CO2培養(yǎng)24小時，將其按照3000個/孔的接種量接種至96孔板中，在上述條件下培養(yǎng)24小時后，將丹參內(nèi)酯制成0. 5,1. 0,2. 5,5. O、10. 0ug/mL的不同濃度藥液加至96孔板中，在37°C，5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時，小心移出上清液，每孔加入150 μ LDMSO,震蕩lh，于酶標儀490nm處測吸光度A值。如圖2結(jié)果顯示當?shù)?nèi)酯濃度為5. 0ug/mL和10ug/mL時MTT實驗的吸光度明顯下降，說明腫瘤細胞增殖活性明顯下降；根據(jù)
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
計算出抑制率，如圖3顯示，在丹參內(nèi)酯濃度為5. 0ug/mL和10ug/mL時該化合物對于細胞的抑制率顯著提高。
實施例3 :丹參內(nèi)酯的雞胚尿囊膜實驗，具體操作如下
1、購買三天內(nèi)生產(chǎn)的新鮮種蛋，用84消毒液或是新潔爾滅對種蛋進行表面擦拭消毒，之后將種蛋放入恒溫培養(yǎng)箱，設置溫度37. 8°C，保持一定濕度(60%)，在此條件下孵育7天。2、開窗與給藥
2.I空白對照溶液、陽性對照溶液和丹參內(nèi)酯溶液的制備⑴空白對照溶液制備用空白生理鹽水作對照；⑵陽性對照溶液制備用5 mg/mL地塞米松磷酸鈉注射液作為陽性對照；(3)丹參內(nèi)酯溶液制備準確稱取丹參內(nèi)酯2mg用無水乙醇配置成lmg/mL的母液備用，、利用上述母液分別用無水乙醇稀釋配置成5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 15 μ g/mL的丹參內(nèi)酯乙醇溶液冷藏備用；
2.2開窗與給藥具體操作如下(1)用75%乙醇消毒液對雞胚大頭端表面進行消毒處理，⑵用扁角鑷子依次去除蛋殼、殼膜，暴露氣室膜，⑶用注射器和彎角鑷子分離氣室膜與尿囊膜，暴露尿囊膜組織，⑷將藥物通過載藥片給到尿囊膜上血管相對稀疏的區(qū)域；
給藥后，用透明膠帶封窗，在溫度37. 8°C，濕度(60%)的條件下培養(yǎng)48小時；
3、標本制作與圖像采集
3. I標本制作揭開封口透明膠帶，向給藥窗口中滴加2mL固定液(甲醇丙酮=1:1)，固定IOmin后，待血管固定完全后，剝離氣室周圍的蛋殼，使給藥區(qū)域的尿囊膜充分暴露，用手術(shù)剪剪下以載體為中心的約2. 5X2. 5cm2范圍內(nèi)的尿囊膜組織，平鋪于裝有PBS緩沖 液的培養(yǎng)皿中，使其充分展開，然后將其轉(zhuǎn)移至載玻片上；
3.2圖像采集以白紙為背景，在自然光線條件下用數(shù)碼照相機進行拍照，原位拍攝以藥物載體(載藥片)為中心的雞胚尿囊膜照片；
4、數(shù)據(jù)處理將采集的尿囊膜照片用軟件進行圖像處理計算血管面積，之后采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗結(jié)果顯示，圖4為經(jīng)IPP軟件處理后增強對比度的照片，從圖中可以明顯看出，當?shù)?nèi)酯的給藥濃度為10. O、15. O ug/mL時，血管生長明顯受到抑制；圖5顯示了經(jīng)面積計算后血管面積的柱狀圖，從圖中可以看出當給藥濃度為10. 0、15. O ug/mL,血管面積明顯下降。
權(quán)利要求
1.丹參內(nèi)酯在制備抗腫瘤血管新生藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹參內(nèi)酯在制備抗腫瘤血管新生藥物中的應用，實驗結(jié)果顯示將丹參內(nèi)酯作為一種血管新生的拮抗劑，具有抗血管生成的作用，通過抑制腫瘤組織中的血管生成，從而抑制腫瘤的生長，特別是病理性與血管生成相關(guān)或由其引發(fā)的腫瘤生長。
文檔編號A61P35/00GK102670623SQ20121019174
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者何靜, 向誠, 莊文婷, 張林東, 戴偉鋒, 李寶才, 李鵬, 角仕云 申請人:昆明理工大學