專利名稱：一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明光敏劑技術領域，涉及一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑。
背景技術：
光動力學療法(photodynamic therapy, F1DT)是近20年發(fā)展起來的一種新的治療惡性腫瘤的方法。它是利用外加光敏劑或光敏劑前體，增加腫瘤內光敏劑的聚集，隨后給予特定波長的激發(fā)光激活光敏劑，從而引發(fā)細胞氧化應激反應造成腫瘤細胞的死亡。與傳統(tǒng)的手術、放療、化療相比，它具有相對的選擇特異性，毒副作用小，非侵入性，無累加毒性等特點。近年來美國、日本、荷蘭和加拿大等國的衛(wèi)生部門已相繼確認了這一腫瘤新療法的合法性。同時，PDT療法在非腫瘤的治療中也受到了重視，用于移除有害的細胞或組織。
5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一種常用的被美國FDA認證的光敏劑，它由于代謝快、毒副作用小被臨床病人和基礎研究者所青睞。然而其親水性的分子結構限制了對細胞膜的穿透力，從而限制了 5-ALA對于結節(jié)狀腫瘤的治療。所以，改善5-ALA對細胞膜的穿透力不僅可以提高5-ALA對腫瘤的殺傷效率，還能加大其在臨床上的應用范圍。從1995年便有人通過制備5-ALA的脂類衍生物來改善其親脂性能以增加其對細胞膜的通透性，到目前為止關于這方面的研究很多，但是沒有一種方法讓人們感到滿意和普遍接受。近年來，隨著納米技術的飛速發(fā)展，納米材料在生物醫(yī)學工程領域的研究已成為一個很有生命力的新方向。使用納米材料運載藥物，不僅可以使藥物具備新的特性，如改善藥物的溶解性、增強藥物的靶向性、增強對細胞的穿透力等，還能利用納米微粒本身特殊的物理和化學特性，在一些疾病的診斷和治療中發(fā)揮作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法，通過納米技術對5-ALA進行改進，提高5-ALA對細胞膜的穿透性，從而提高光動力學療法療效。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，在pH為7. 20 7. 45的溶液中，5_氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金通過靜電力結合，其質量比為5-氨基乙酰丙酸陽離子膠體金=3 10: I。所述的陽離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的直徑為10 50nm的膠體金顆粒。其中5-氨基乙酰丙酸的濃度為0. 5 10mM。還含有pH緩沖劑和穩(wěn)定劑。所述的pH緩沖劑為HEPES，其在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;所述的穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨，其在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟
I)陽離子膠體金的制備在聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液加入其質量0. I 5%的氯金酸，攪拌混勻，然后加入乙醇并攪拌混勻，調節(jié)pH為8. 0 8. 5，加熱至沸騰后冷卻至室溫，得到陽離子膠體金溶液；2)將陽離子膠體金溶液過濾后注入到pH為7. 20 7. 45的5_氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸與陽離子膠體金的質量比為3 10:1，超聲分散，并加入pH緩沖劑和穩(wěn)定劑，避光冷藏保存。所述的pH緩沖劑為HEPES，穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨。所述的HEPES在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;四辛基溴化銨在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。所述的超聲分散中超聲功率為250 300W，頻率為50 90Hz。 所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑在制備用于光動力治療的藥物的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果本發(fā)明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，利用納米膠體金的穿透力，通過靜電吸引力將5-ALA和陽離子納米金(GNPs)結合，從而提高5-ALA對細胞膜的穿透性，從而提高光動力學療法中對腫瘤細胞的殺傷效率。本發(fā)明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，通過不同的光譜來進行表征分析，最后用細胞試驗驗證了這種5-ALA和陽離子納米金結合的新型光敏劑5-ALA-GNPs在光動力療法中的可行性。具體的以人類白血病慢性粒細胞K562用來作為光動力療法的治療對象。與單獨的納米金和5-ALA相比，結合體的殺傷效果明顯提高，對K562細胞活性的抑制效果從單獨5-ALA的60%提升至71%左右。細胞實驗的結果證明了這種新型光敏劑良好的光動力治療效果和它在光動力學療法中的應用價值。


圖I為納米金的電鏡照片；圖2為納米金與5-ALA結合后的電鏡照片；圖3為Au+5-ALA與5-ALA的細胞的光動力學療法效果對比圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，本發(fā)明提供基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，是將5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金結合形成結合體，以改善其細胞穿透性。其中作為改性的陽離子納米金(GNPs)為具有能夠提供靜電吸引力的陽離子的納米金即可，一旦吸附形成結合體之后，陽離子納米金就可發(fā)揮其增強對細胞的穿透力的能力，從而協(xié)助5-氨基乙酰丙酸穿過細胞膜。下面通過具體的制備實施例來進行說明，實施例中所選擇的陽離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的膠體金顆粒，這并不是對技術方案中陽離子膠體金與5-ALA結合的限定，也不排除其他陽離子膠體金與5-ALA的結合，比如市場上可購買的多種陽離子膠體金。所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。實施例I基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽離子膠體金的制備取0.Ig聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethylammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至lOOmL。將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質量分數(shù)1%的氯金酸3mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧 化鈉溶液調節(jié)PH值至8. 5。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結合分別將ImM、IOmM和IOOmM三種不同濃度的5-ALA調節(jié)pH值到7. 4左右。將新制備的膠體金溶液用220 的注射濾器過濾，分別與不同濃度的5-氨基乙酰丙酸按體積比
I I混合，超聲分散5分鐘(功率285W，頻率59Hz )；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為20mM作為，使PH值保持恒定，根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為2mM以保持5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金結合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆?。參見圖I所示的納米金的電鏡照片，圖2所示的納米金與5-ALA結合后的電鏡照片，圖I與圖2相比結合5-ALA后的結合體5-ALA-Au明顯比未結合前變大。實施例2基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至100mL。將IOOmL I3DDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質量分數(shù)1%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結合分別將濃度為IOmM的5-ALA調節(jié)pH值到7. 2左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過濾，調節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽離子膠體金的質量比為4. 5:1，超聲分散3分鐘(功率285W，頻率75Hz )；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金結合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆?。實施?基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至100mL。
將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質量分數(shù)2%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結合分別將濃度為IOmM的5-ALA調節(jié)pH值到7. 2左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過濾，調節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽離子膠體金的質量比為8:1，超聲分散10分鐘(功率300W，頻率80Hz)；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金結合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆谩?實施例4基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至lOOmL。將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質量分數(shù)2%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結合分別將濃度為IOmM的5-ALA調節(jié)pH值到7. 45左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過濾，調節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽離子膠體金的質量比為5:1，超聲分散10分鐘(功率300W，頻率90Hz)；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金結合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆?。經過改性可以提高5-ALA對細胞膜的穿透性，從而提高光動力學療法中對腫瘤細胞的殺傷效率。具體人類白血病慢性粒細胞K562用來作為光動力療法的治療對象來進行說明。當K562細胞處于指數(shù)生長期時，調整細胞濃度到大約5X IO5左右，將細胞和制備好的新型光敏劑放置于96孔板中孵育4小時后，用汞燈照射系統(tǒng)以3. 6J/cm2的能量密度于暗室中照射I小時。光照后，將光照組和空白對照組的96孔板中各實驗孔都加入10iilCCK-8(CellCounting Kit-8)試劑(試劑中主要成分WTS-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4- 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，一種常用于檢測細胞增殖和細胞毒性的試劑)，再次放入培養(yǎng)箱孵育。分別在不同的時間段，利用酶標儀以450nm為檢測波長，測量各實驗孔OD值，檢測細胞活性。
檢測結果如圖3所示，分別給出了對照組(即不加入任何物質的細胞)，細胞納米金混合培養(yǎng)液，細胞5-ALA混合培養(yǎng)液以及細胞5-ALA-Au混合培養(yǎng)液在激光照射下的細胞的活性分析結果。通過分析可知，與單獨的納米金和5-ALA相比，改性后的5-ALA結合體的殺傷效果明顯提高，對K562細胞活性的抑制效果從單獨5-ALA的60%提升至71%左右。效果的提高是由于納米金增加了 5-ALA對細胞的穿透能力，從而增加了細胞對結合體的攝入。 細胞攝入結合體越多，5-ALA在細胞中的堆積越多，轉化的原卟啉IX就越多。原卟啉IX正是光動力學療法中殺傷細胞的光敏物質，因此，會有更多的細胞被殺傷。細胞實驗的結果證明了改性后的光敏劑良好的光動力治療效果和它在光動力學療法中的應用價值。
權利要求
1.一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，在pH為7. 20 7. 45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金通過靜電力結合，其質量比為5-氨基乙酰丙酸陽離子膠體金=3 10: I。
2.如權利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，所述的陽離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的直徑為10 50nm的膠體金顆粒。
3.如權利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，其中5-氨基乙酰丙酸的濃度為O. 5 10mM。
4.如權利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，還含有pH緩沖劑和穩(wěn)定劑。
5.如權利要求4所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，所述的pH緩沖劑為HEPES，其在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;所述的穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨，其在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。
6.一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，包括以下步驟 1)陽離子膠體金的制備 在聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液加入氯金酸后，攪拌混勻，然后加入乙醇并攪拌混勻，調節(jié)PH為8. O 8. 5，加熱至沸騰后冷卻至室溫，得到陽離子膠體金溶液； 2)將陽離子膠體金溶液過濾后注入到pH為7.20 7. 45的5-氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸與陽離子膠體金的質量比為3 10:1，超聲分散，并加入pH緩沖劑和穩(wěn)定劑，避光冷藏保存。
7.如權利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的PH緩沖劑為HEPES，穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨。
8.如權利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的HEPES在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;四辛基溴化銨在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。
9.如如權利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的超聲分散中超聲功率為250 300W，頻率為50 90Hz。
10.權利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑在制備用于光動力治療的藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法，在pH為7.20～7.45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和陽離子膠體金通過靜電力結合。利用納米膠體金的穿透力，通過靜電吸引力將5-ALA和陽離子納米金(GNPs)結合，從而提高5-ALA對細胞膜的穿透性，從而提高光動力學療法中對腫瘤細胞的殺傷效率。與單獨的納米金和5-ALA相比，結合體的殺傷效果明顯提高，對K562細胞活性的抑制效果從單獨5-ALA的60%提升至71%左右。證明了這種新型光敏劑良好的光動力治療效果和它在光動力學療法中的應用價值。
文檔編號A61P35/00GK102727891SQ201210192480
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權日2012年6月12日
發(fā)明者姚翠萍, 張鎮(zhèn)西, 李政, 梅建生, 王斯佳, 王晶, 許澔, 韓玉龍 申請人:西安交通大學