專利名稱：一種防治由艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治由艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗。
背景技術(shù)：
艱難梭菌(clostridium difficile,⑶)是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌,是最重要的醫(yī)院感染的病原體之一。研究表明，臨床上約1(T20%的抗生素相關(guān)性腹瀉和近100%的偽膜性腸炎與此菌有關(guān)。艱難梭菌相關(guān)性腹灣(Clostridium difficile-associateddiarrhea, CDAD)主要發(fā)生于長(zhǎng)期服用抗生素者，也可發(fā)生于其他影響腸道正常菌群，降低抵抗艱難梭菌定殖的情形，如用抗腫瘤藥物、長(zhǎng)期住院、免疫缺陷等，特別是那些有免疫功能降低者和/或老年人。CDAD臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，從無癥狀攜帶者到爆發(fā)性結(jié)腸炎。重癥患 者預(yù)后差，死亡率高達(dá)40%。CDAD的治療分為抗菌治療和非抗菌治療?？咕委熤校m95%的患者對(duì)甲硝唑或萬古霉素敏感，但5 30%患者停藥后易復(fù)發(fā)，還可造成繼發(fā)多重耐藥菌株感染。非抗菌治療主要手段之一是采用生態(tài)制劑，可作為治療輔助用藥或預(yù)防復(fù)發(fā)。但是，由于抗生素的“無選擇性”殺菌作用，使生態(tài)菌在CDAD的預(yù)防中發(fā)揮的作用十分有限。因此，有必要探索新的防治CDAD方法。而有效的疫苗正是防治CDAD最理想的途徑和方法。艱難梭菌主要產(chǎn)生兩種毒素毒素A和毒素B。毒素B與毒素A基因有一定的同源性，兩基因位于C端的重復(fù)序列，起結(jié)合膜受體作用，N端序列為毒素的酶及毒性作用區(qū)。毒素A分子表面結(jié)構(gòu)大部分是由C-末端重復(fù)單位構(gòu)成的，形成了毒素A分子的粘合區(qū)域(TxAC314,即14CDTA, 14C_terminal toxin A repeats)。業(yè)已證明，針對(duì)粘合區(qū)域的抗體具有保護(hù)作用，可以抑制毒素A的細(xì)胞毒性和腸毒性。針對(duì)毒素A設(shè)計(jì)的艱難梭菌疫苗也可以有效地防治A毒素陽性的艱難梭菌感染。國(guó)內(nèi)外對(duì)艱難梭菌疫苗研究的技術(shù)主要分為以下三類①被動(dòng)免疫型疫苗如用艱難梭菌菌體或重組毒素經(jīng)甲醛處理后免疫母雞，得到蛋黃免疫球蛋白IgY，經(jīng)純化后，口服治療艱難梭菌感染?；蛘哂没蚬こ痰姆椒ū磉_(dá)純化的針對(duì)艱難梭菌毒素的重組單克隆抗體。這一類型疫苗的優(yōu)點(diǎn)是不僅可預(yù)防，還可以作為治療性疫苗，但成本高，保存運(yùn)輸?shù)炔槐?。②主?dòng)免疫型疫苗如將艱難梭菌產(chǎn)毒株培養(yǎng)濾液及菌體分別用福爾馬林滅活后，以霍亂毒素作為粘膜佐劑制備的減毒疫苗；還有通過基因重組表達(dá)用艱難梭菌毒素A羧基端重復(fù)單位作為載體蛋白與其他病源微生物的多糖共價(jià)結(jié)合構(gòu)建成疫苗，或者用基因重組技術(shù)，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)毒素A與毒素B基因的3'端的重復(fù)序列，重組多肽純化后與多糖結(jié)合等基因工程疫苗。這但類疫苗于采用福爾馬林處理抗原，或免疫時(shí)配合使用佐劑，一些采用侵入性免疫途徑(如皮下、腹腔內(nèi)注射等)，因此，人體應(yīng)用時(shí)不易被患者接受；③口服活菌疫苗，其實(shí)也是主動(dòng)免疫型疫苗的一種。用減毒霍亂弧菌或減毒鼠傷寒桿菌中表達(dá)艱難梭菌毒素A羧基端無毒的受體結(jié)合區(qū)，形成減毒活菌疫苗，通過鼻腔及胃飼活菌，在肺、腸粘膜和血清中產(chǎn)生高滴度的抗毒素A抗體及抗破傷風(fēng)毒素抗體。這類活菌疫苗的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、方便，也有較好的免疫保護(hù)效果，還可同時(shí)做成多介疫苗，但由于目前采用了減毒傷寒菌或霍亂弧菌作為載體菌，于人體應(yīng)用時(shí)其生物安生性值得關(guān)注，因而有進(jìn)一步改進(jìn)的必要。乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis ；Lactococcus lactis)是一種革蘭氏陽性球菌，被認(rèn)為是一種對(duì)人體無害，較為安全的細(xì)菌(generally regarded as safe, GRAS)。作為一種食品工業(yè)菌，其被廣泛應(yīng)用于乳制品工業(yè)。乳鏈菌近年來被大量用于表達(dá)多種生物多肽或蛋白，如表達(dá)白介素2 (interleukin 2，IL2)、IL6、ILlO和三葉肽等。由于乳鏈菌是食品級(jí)的細(xì)菌，所以重組的乳鏈菌也被作為一種安全的生物制品的載體。例如，經(jīng)改造的分泌ILlO的重組乳鏈菌可以作為活菌口服，直接進(jìn)入腸道表達(dá)ILlO從而抑制炎癥反應(yīng)。乳鏈菌也被用于口服疫苗的研究工作。如將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)的抗原L7/L12與釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的M6蛋白的膜錨定序列(cell wallanchoring, CffA)連接成融合蛋白表達(dá)于乳鏈菌中,可以使抗原錨定于乳鏈菌的表面以增加 抗原性，形成抗流產(chǎn)布魯氏菌感染的食品級(jí)的口服活菌疫苗(Food-grade live vaccine)。隨著人口老齡化和腫瘤發(fā)病率的增加、抗生素等對(duì)腸道菌群有影響的藥物使用等原因，在臨床上艱難梭菌感染率有增加趨勢(shì)。研究一種新的抗艱難梭菌感染的疫苗是防治艱難梭菌感染的有效手段。但是目前尚無將乳酸鏈球菌作為表達(dá)載體用于艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，該活菌疫苗經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證安全有效。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的制備方法，該制備方法具有成本低、可大量制備及工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述上述防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗在制備具有防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染藥物中的用途。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌。其中，所述的胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌通過如下方式獲得采用表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白取代乳酸鏈球菌的胸苷酸合成酶ThyA基因序列。所述的表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白通過以下方式獲得將乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14⑶TA和無毒性破傷風(fēng)毒素C片段序列TETC，按正確的閱讀框用基因工程的方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白。更優(yōu)選的，所述的表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白通過以下方式獲得將乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14CDTA、無毒性破傷風(fēng)毒素C片段序列TETC和釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定序列CWAM6，按正確的閱讀框用基因工程的方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白。其中，乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14⑶TA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，無毒性破傷風(fēng)毒素C片段序列TETC的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定序列CWAM6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO. 8所示。即結(jié)合現(xiàn)有的艱難梭菌感染的疫苗研究技術(shù)以及乳酸鏈球菌在活菌疫苗中應(yīng)用的技術(shù)，本發(fā)明人采用食品級(jí)的乳酸鏈球菌為抗原蛋白的表達(dá)菌(載體)，表達(dá)艱難梭菌毒素 A 分子的粘合區(qū)域(TxAC314,即 14CDTA, 14C_terminal toxin A repeats)蛋白作為抗原，并將整個(gè)重組菌作為口服疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗14⑶TA的抗體，用于防治毒素A陽性的艱難梭菌腸道感染。優(yōu)選的，以乳酸鏈球菌活菌為疫苗的表達(dá)載體，表達(dá)艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14⑶TA)抗原，共表達(dá)無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)作為疫苗的生物佐劑，以基因工程的方法制備的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, ThyA)基因缺陷型重組乳酸鏈球菌。即首先將艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14CDTA)抗原與無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)序列形成一種融合蛋白，然后在融合蛋白基因的氨基端(N端，5’端)帶有一段乳酸鏈球菌分泌型蛋白 45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)基因的信號(hào)妝(75-181，GeneBank accessionNo. M60178)序列，作為乳酸鏈球菌表達(dá)融合蛋白的信號(hào)肽。也即乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14⑶TA)和無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)序列，按正確的閱讀框用基因工程方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白作為抗艱難梭菌口服疫苗的抗原。并采用上述分泌型的抗艱難梭菌A的融合蛋白基因序列替代乳酸鏈球菌的胸苷酸合成酶基因序列，所制備的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,ThyA)基因缺陷型重組乳酸鏈球菌將表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌A的融合蛋白作為疫苗。最佳的，以乳酸鏈球菌活菌為疫菌的表達(dá)載體，表達(dá)艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14⑶TA)抗原，共表達(dá)無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)作為疫苗的生物佐劑，并共表達(dá)釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定序列(CWAM6)以增強(qiáng)疫苗的免疫效果，以基因工程的方法制備的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,ThyA)基因缺陷型重組乳酸鏈球菌。即首先將艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14CDTA)抗原與無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)序列和釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定(CWAM6)序列共表達(dá)的,形成一種融合蛋白，該融合蛋白作為抗原主要錨定于乳酸鏈球菌的表面；然后在融合蛋白基因的氨基端(N端，5’端)帶有一段乳酸鏈球菌分泌型蛋白 45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)基因的信號(hào)妝(75-181,GeneBank accession No. M60178)序列，作為乳酸鏈球菌表達(dá)融合蛋白的信號(hào)肽。也即乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14⑶TA)、無毒性破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)序列和釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定(CWAM6)序列，按正確的閱讀框用基因工程方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白作為抗艱難梭菌口服疫苗的抗原。并采用上述分泌型的抗艱難梭菌A的融合蛋白基因序列替代乳酸鏈球菌的胸苷酸合成酶基因序列，所制備的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, ThyA)基因缺陷型重組乳酸鏈球菌將表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌A的融合蛋白作為疫苗。所述乳酸鏈球菌為食品級(jí)工業(yè)菌。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的上述防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的制備方法，將上述胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌在含有胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，獲得防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染的口服活菌疫苗。所述胸苷的濃度優(yōu)選為10 30 U M0
所述活菌疫苗的劑型為口服劑。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的上述防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗在制備具有防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染藥物中的用途。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本疫苗的劑型為口服劑，服用方便，便于保存及運(yùn)輸。


圖I是實(shí)施例I中防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的構(gòu)建示意圖，其中A是構(gòu)建14CDTA融合蛋白在乳鏈菌中共表達(dá)單位構(gòu)建示意圖，其將表達(dá)一種膜錨錠蛋白是構(gòu)建乳鏈菌中thyA基因剔除單位示意圖，ThyA-Up:乳鏈菌ThyA基因上游序列，含有ThyA基因啟動(dòng)子(promoter)和核糖體結(jié)合點(diǎn)(ribosomal bindingsite, RBS) ;SPUsp45 :USP45 蛋白的信號(hào)肽(Signal peptide ofUsp45) ;14CDTA :艱難梭菌毒素A之無毒性抗原序列；CWAM6 :編碼細(xì)胞膜M6蛋白序列(sequence encoding the cellwall M6protein), TETC:破傷風(fēng)無毒性的C片段；ThyA-Down:ThyA基因下游序列，含ThyA基因的終止子；圖2是實(shí)施例2和3中以質(zhì)粒表達(dá)14⑶TA融合蛋白試驗(yàn)中質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖，其中A為僅含有pTRKH2空白質(zhì)粒的乳鏈菌；B為乳鏈菌的質(zhì)粒中，包括有表達(dá)14CDTA分泌蛋白的元件，包括TETC和14⑶TA，但不表達(dá)膜蛋白CWAM6 ;C為乳鏈菌的質(zhì)粒中，表達(dá)帶有膜蛋白CWAM6的14⑶TA融合蛋白，P :為啟動(dòng)子；RBS :核糖體結(jié)合點(diǎn)(ribosomal bindingsite) ；SPUsp45 :USP45蛋白的信號(hào)妝(Signal peptide of Usp45) ;14CDTA :艱難梭菌毒素A之無毒性抗原序列；CWAM6 :編碼細(xì)胞膜M6蛋白序列(sequence encoding the cell wallM6protein) ；TETC:破傷風(fēng)無毒性的C片段；TUSP45為鏈酸鏈球菌USP45基因的終止密碼子；圖3是實(shí)施例I中表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)圖(由gene construction kit軟件制作)。其中，帶下劃線的大寫為P59啟動(dòng)子，帶下劃線的大寫紅色字母分別為-10區(qū)及-35區(qū)，帶藍(lán)色下劃線的小寫字母為RBS，大寫藍(lán)色粗體字母為Usp45蛋白的信號(hào)肽部分(SPusp45)，綠色大寫字母示多克隆位點(diǎn)(未示終止子部分，另外再行克隆和連接)；圖4是實(shí)施例I表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)驗(yàn)證，pNBC2000-EGFP在大腸桿菌中的表達(dá)激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，EGFP經(jīng)PCR擴(kuò)增后，亞克隆于pNBC2000載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(圖E、F)，并以pNBC2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌作為空白對(duì)照(圖C、D)，pBS-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌作為陰性對(duì)照(圖A、B)，其中，圖A、C、E為熒光圖像，而圖B、D、F為DIC(微分干涉襯比法)圖像，結(jié)果表明我們構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)可以正確表達(dá)外源基因；
圖5是實(shí)施例I表達(dá)系統(tǒng)在乳鏈菌活內(nèi)驗(yàn)證，PNBCL2000-EGFP在乳鏈菌中的表達(dá)激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，含有PNBCL2000-EGFP的乳鏈菌(A、B)，含pNBCL2000的乳鏈菌(C、D)，其中，圖A、C為熒光圖像，而圖B、D為DIC (微分干涉襯比法)圖像圖像；圖6是重組TETC蛋白在乳鏈菌的定位表達(dá)(丨為分泌表達(dá)的TETC，丨為膜錨定表達(dá)的TETC M :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :重組乳鏈菌LL-pNBCL1002總蛋白；重組乳鏈菌LL_pNBCL1002上清蛋白；3 :重組乳鏈菌LL-pNBCL2002總蛋白；4 :重組乳鏈菌LL_pNBCL2002膜蛋白；5 乳鏈菌LL-pTRKH2總蛋白6 :乳鏈菌LL_pTRKH2上清蛋白；7 :乳鏈菌LL_pTRKH2膜蛋白；8乳鏈菌總蛋白；9 :乳鏈菌上清蛋白);圖7是LL-pNBCL1002，LL-pNBCL2002重組蛋白免疫印跡分析結(jié)果(l:LL-pNBCL1002 菌體總蛋白；2:LL_pNBCL1002 上清蛋白；3:LL_pNBCL2002 菌體總蛋白；4:L :L-pNBCL2002 膜蛋白；5:LL_pTRKH2 菌體總蛋白；6:LL_pTRKH2 上清蛋白；7 LL-pTRKH2膜蛋白) 圖8重組TETC - 14⑶TA融合蛋白在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)(丨為分泌表達(dá)的TETC —14⑶TA，丨為膜錨定表達(dá)的TETC - 14⑶TAM :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :重組乳鏈菌LL_pNBCL1003總蛋白；重組乳鏈菌LL-pNBCL1003上清蛋白；3 :重組乳鏈菌LL_pNBCL2003總蛋白；4 :重組乳鏈菌LL-pNBCL2003膜蛋白；5 :乳鏈菌LL_pTRKH2總蛋白6 :乳鏈菌LL_pTRKH2上清蛋白；7 乳鏈菌LL-pTRKH2膜蛋白；8 :乳鏈菌總蛋白；9 :乳鏈菌上清蛋白);圖9LL-pNBCL1003, LL-pNBCL2003重組蛋白免疫印跡分析結(jié)果(Lanel:LL-pNBCL1003菌體總蛋白與破傷風(fēng)抗毒素Lane 2: LL-pNBCL1003上清蛋白與破傷風(fēng)抗毒素Lane 3:LL_pNBCL1003菌體總蛋白與艱難梭菌A毒素抗體Lane 4:LL_pNBCL1003上清蛋白與艱難梭菌A毒素抗體Lane 5 LL_pNBCL2003菌體總蛋白與破傷風(fēng)抗毒素Lane 6LL-PNBCL1003膜錨定蛋白與破傷風(fēng)抗毒素Lane7 LL-pNBCL2003菌體總蛋白與艱難梭菌A毒素抗體Lane 8 LL_pNBCL2003膜錨定蛋白與艱難梭菌A毒素抗體)；圖10實(shí)施例3中重組乳鏈菌活菌疫苗接種方案及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排過程圖；圖11是實(shí)施例3中艱難梭菌攻擊后各組動(dòng)物間累積腹瀉發(fā)生率的比較圖；圖12是實(shí)施例3中艱難梭菌攻擊后各組動(dòng)物間生存率的比較圖；圖13實(shí)施例3中艱難梭菌攻擊后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間的生存時(shí)間及攻擊后生存天數(shù)比較圖；圖14是實(shí)施例3中艱難梭菌攻擊后各組動(dòng)物間累積死亡率的比較圖；圖15是實(shí)施例3中艱難梭菌攻擊前后各組動(dòng)物間體重的比較圖；圖16是實(shí)施例3中空白對(duì)照組金黃地鼠的腸管、腸腔和結(jié)腸的顯微鏡示意圖，其中金黃地鼠腸管擴(kuò)張，腸腔出血，結(jié)腸內(nèi)無成形糞便；圖17是實(shí)施例3中空白對(duì)照組金黃地鼠的盲腸和結(jié)腸的顯微鏡示意圖，其中盲腸粘膜出血、水腫并可見部分粘膜缺損，血管紋理消失；相鄰的結(jié)腸粘膜水腫，潰瘍形成；圖18是實(shí)施例3中LL-pTRKH2組瀕死的金黃地鼠腸腔和結(jié)腸的顯微鏡示意圖，其中瀕死的金黃地鼠腸腔輕度擴(kuò)張、張力增高，水腫、淤血，結(jié)腸內(nèi)無成形糞便；圖19是實(shí)施例3中LL-pTRKH2組盲腸的顯微鏡示意圖，其中組盲腸粘膜水腫，散在出血點(diǎn)及糜爛；圖20是實(shí)施例3中LL-pNBCL2003組及LL_pNBCL1003組腸管和結(jié)腸的顯微鏡示意圖，其中這兩組腸管不擴(kuò)張，無明顯淤血及出血征象，張力正常，結(jié)腸內(nèi)有成形糞便；圖21是實(shí)施例3中LL-pNBCL1003組盲腸的顯微鏡示意圖，其中盲腸粘膜無明顯水腫，血管紋理清晰；圖22是實(shí)施例3中LL-pNBCL2003組盲腸的顯微鏡示意圖，其中盲腸粘膜無明顯水腫,血管紋理清晰；圖23是實(shí)施例3中空白對(duì)照組金黃地鼠盲腸的顯微鏡示意圖，其中空白對(duì)照組粘膜缺損，腺體破壞，廣泛出血，粘膜下層水腫，有中等至大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；圖24是實(shí)施例3中LL-pTRKH2組盲腸的顯微鏡示意圖，其中LL_pTRKH2組粘膜缺損較空白對(duì)照組輕，粘膜下有少量出血及大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膿腫形成； 圖25是實(shí)施例3中LL-pNBCL1003組盲腸的顯微鏡示意圖，其中LL_pNBCL1003組粘膜上皮輕度受損完整，粘膜下層有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩變淺；圖26是實(shí)施例3中LL-pNBCL2003組盲腸的顯微鏡示意圖，其中LL_pNBCL2003組粘膜缺損較輕，僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；圖27 是實(shí)施例 3 中空白對(duì)照組、LL-pTRKH2 組、LL_pNBCL1003 租和 LL_pNBCL2003組大體及組織病理評(píng)分比較圖，其中a與空白對(duì)照組比較p = 0. 000, b與LL-pTRKH2組比較 p = 0. 000，c 與 LL-pNBCL2003 比較 p = 0. 616 ；圖28是實(shí)施例3中血清及腸液抗艱難梭菌A毒素特異性抗體IgG及IgA檢測(cè)結(jié)果圖，其中與空白對(duì)照組相比，P < 0.05 ;與非重組質(zhì)粒乳鏈菌組相比，P < 0. 000，與 LL-pNBCL1003 相比，P = 0. 116 ;圖29是實(shí)施例3中抗TETC-14⑶TA血清對(duì)艱難梭菌A毒素細(xì)胞毒性的影響圖，其中A.正常對(duì)照組；B. A毒素處理組；C.血清預(yù)孵組；D.血清處理組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但是本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。第一部分防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗及其制備過程實(shí)施例II.疫苗表達(dá)抗原的載體(表達(dá)菌)米用乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis ；Lactococcus lactis)作為表達(dá)艱難梭菌的14CDTA蛋白分子(抗原)的載體，乳酸鏈球菌是一種革蘭氏陽性球菌，為一種兼性厭氧菌，被認(rèn)為是一種對(duì)人體無害，較為安全的細(xì)菌(generally regarded as safe, GRAS),也是一種食品工業(yè)菌，被廣泛應(yīng)用于乳制品工業(yè)，例如中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心保藏的乳酸鏈球菌(CICC編號(hào)6023)等。乳酸鏈球菌用M17培養(yǎng)基(Difco，Detroit, Mich)或類似培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于30°C厭氧或需氧的環(huán)境中，對(duì)于ThyA基因缺陷型乳酸鏈球菌，在培養(yǎng)基中要加入胸苷(thymidine)，其濃度約為20 y M，M17培養(yǎng)基由Difco公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基，只需加入蒸餾水高壓后即可使用。2.采用乳酸鏈球菌表達(dá)的艱難梭菌毒素A分子的粘合區(qū)域(TxAC314，即14⑶TA，14C-terminal toxin A repeats)蛋白作為抗原的特征如下
2. I 艱難梭菌毒素 A 分子的粘合區(qū)域(TxAC314,即 14CDTA, 14C_terminal toxinA r印eats)蛋白是無毒性的，艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14⑶TA的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2. 2為利于14⑶TA分子刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，14⑶TA分子為分泌蛋白形式表達(dá)，為達(dá)到這一目的，在14⑶TA分子序列的5’端將加上乳鏈菌分泌型蛋白45 (L. Iactissecreted protein Usp45 gene)的信號(hào)肽序列，乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 3為了將表達(dá)的分泌型14⑶TA錨定于乳酸鏈球菌的表達(dá)，以增強(qiáng)抗原性，在構(gòu)建表達(dá)膜錨定蛋白的基因來自釀膿鏈球菌的e_6基因中編碼M6蛋白的膜錨定序列(CffAM6) (1479-2111, GeneBank accession No. M11338)，其釀膿鏈球菌 M6 蛋白的膜錨定序列CWAM6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。2. 4為了增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于14⑶TA的免疫反應(yīng)，除將14⑶TA錨定于乳酸鏈球菌表面夕卜，加強(qiáng)14CDTA的抗原性是十分重要的技術(shù)步驟，本疫苗采用的一種生物疫苗，即無毒性 破傷風(fēng)毒素 C 片段(TETC)的序列(GeneBank accession no. M12739, 367-1719)，但為了有利于TETC在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)，根據(jù)乳鏈菌的密碼子，設(shè)計(jì)TETC的基因序列，用于本疫苗的TETC核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。3.重組活菌疫苗的構(gòu)建3. I乳鏈菌表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建3. I. I乳鏈菌分泌型表達(dá)系統(tǒng)的序列及獲得選用適合于乳鏈菌中使用的乳酪鏈球菌(Lactococcus lactis subsp. cremoris)的啟動(dòng)子 59 (promoter 59, p59) (GeneBankaccession No. M24806,)作為啟動(dòng)子，選用乳鏈菌分泌型蛋白45 (L. lactis secretedprotein Usp45 gene)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome binding site, RBS)和信號(hào)妝(75-181, GeneBank accession No. M60178)序列作為RBS和信號(hào)肽；在信號(hào)肽后插入多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)乳鏈菌分泌表達(dá)系統(tǒng)序列，核苷酸序列如SEQ ID NO. 9及圖3所示序列使用軟件DNASTAR 5. 0，每40bp的寡核苷酸的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)I條寡核苷酸，使相鄰的兩條寡核苷酸有20bp相互互補(bǔ)，采用基因拼接的方法獲得全長(zhǎng)341bp的序列PU (詳細(xì)方法見楊曉強(qiáng)，彭春秀，姜泊，邢銳，張紹榮，陳學(xué)清.乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其鑒定[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25 (10):1232 1235.)。3. I. 2擴(kuò)增USP45基因的終止子以質(zhì)粒pVE5247 (含USP45信號(hào)肽及終止子，由法國(guó)INRA科學(xué)家J.-C. Piard博士贈(zèng)送)為模板，擴(kuò)增USP45基因的終止子(Tusp45)作為表達(dá)系統(tǒng)PNBC1000的終止子，設(shè)計(jì)如下引物上游引物Tl加入BamH I位點(diǎn)5’GAGGATCCAAAAAAGTCTTAATAAAT 3’(黑體為 BamH I 位點(diǎn))，下游引物 T2 加入 Xba I 及 SacI 位點(diǎn)5’TGGAGCTCTCTAGATAAAAAATGAITTGACAG 3’，(黑體為 Sac I 位點(diǎn)，帶下劃線序列為Xba I位點(diǎn))(詳細(xì)方法見楊曉強(qiáng)，彭春秀，姜泊，邢銳，張紹榮，陳學(xué)清.乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其鑒定[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25 (10) :1232 1235.)。3. I. 3組裝分泌表達(dá)系統(tǒng)pNBClOOO將基因拼接產(chǎn)物I3U以Eco0109I及BamH I酶切3h，瓊脂糖凝膠電泳回收后取7 ii L(約50ng)與I y L(約15ng)以相同酶進(jìn)行酶切并凝膠電泳回收的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒用T4DNA連接酶室溫下連接5h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10感受態(tài)細(xì)胞，平鋪于已涂有40mmol/L IPTG，20% X_gal的含75 y g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜。通過藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，以含IOOy g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，用常規(guī)的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過Xba I酶切鑒定篩選出含有目的片斷的重組質(zhì)粒，命名為pBS-PU，將TUSP45連接至pBS-PU，構(gòu)建成PNBC1000,由上海博亞生物技術(shù)有限公司采用Sanger’ s雙脫氧末端終止法，用M13正向通用弓I物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定。3. I. 4M6蛋白膜錨定序列(CWAM6)擴(kuò)增以質(zhì)粒pVE5207(由法國(guó)INRA科學(xué)家J. -C.Piard博士贈(zèng)送)中的emm6基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)并合成PCR引物，在上游引物設(shè)計(jì)BamH I位點(diǎn)，下游引物5’加入Sal3’下游引物(EM3) :5’ CCGTCGACTTAGTTTTCTTCTTTGCG 3’，用滅菌雙蒸水配制成 20 u mo I/L 濃度，通過PCR擴(kuò)增CWAM6。(詳細(xì)方法見楊曉強(qiáng)，彭春秀，姜泊，邢銳，張紹榮，陳學(xué)清.乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其鑒定[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25 (10) :1232 1235.)。3. I. 5 重組質(zhì)粒 pNBC2000 構(gòu)建 將CWAM6 以 BamH I 及 Sal I 酶切 3h，回收后取 7 y L (約 50ng)與 I ii L (約 15ng)以BamH I、Xho I進(jìn)行酶切并凝膠電泳回收的pET_22b (+)質(zhì)粒用T4DNA連接酶室溫下連接5h，以消除Sal I及Xho I位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，平鋪于含75 u g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12h。挑取重組質(zhì)粒，以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，用常規(guī)的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過BamH I和Bpull021酶切鑒定篩選出含有目的片斷的重組質(zhì)粒，命名為PET-M6，以pET-M6為模板，以原上游引物EM5作為上游引物，TGGAGCTCTCTAGACAAAAAACCCCTCAAGA (黑體為Sac I位點(diǎn)，帶下劃線的為Xba I位點(diǎn))為下游引物M6down，反應(yīng)體系中其它成分及反應(yīng)條件與前相同，擴(kuò)增其后帶有組氨酸標(biāo)簽及17終止子的CWAM6基因，經(jīng)BamH I及Sac I雙酶切后連接到經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒pBS_PU，構(gòu)建成pNBC2000，經(jīng)Xba I酶切鑒定后，由上海博亞生物技術(shù)有限公司采用Sanger’s雙脫氧末端終止法測(cè)序。3. 2乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)的驗(yàn)證3. 2. IEGFP基因的擴(kuò)增以pEGFP-Nl為模板，設(shè)計(jì)I對(duì)引物擴(kuò)增EGFP基因，上游引物設(shè)計(jì)EcoRI位點(diǎn)，下游引物 5 ’ 加入 BamH I 位點(diǎn)，上游引物(EGFPI) : 5 ’ GGGAATTCTCGCCACCATGGTGAGCAA3 ’，下游引物(EGFP2) :5’GGGGATCCGTCTTGTACAGCTCGTCCA3’，以擴(kuò)增增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因。3. 2. 2EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌內(nèi)的鑒定EGFP基因擴(kuò)增并純化后用EcoR I和Bam HI酶切3小時(shí)，連入以相同酶切的質(zhì)粒pNBC2000及pBluescript II SK(+),并轉(zhuǎn)化至E. coli ToplO,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后分別命名為pNBC2000-EGFP，pBS-EGFP，分別將含有pNBC2000_EGFP質(zhì)粒、pNBC2000質(zhì)粒的E. coli ToplO加入含有氨芐青霉素IOOii g/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，次日各取IOu L菌液均勻涂布于載玻片上，蓋上蓋玻片，以中性樹脂封片，錫紙包裹，進(jìn)行激光聚焦顯微鏡觀察(結(jié)果見圖4)。3. 3乳鏈囷表達(dá)系統(tǒng)在乳鏈囷內(nèi)的驗(yàn)證以Xba I分別將pNBC2000中的P59啟動(dòng)子、USP45信號(hào)肽基因、多克隆位點(diǎn)、M6蛋白基因及17終止子及pNBC2000-EGFP中的P59啟動(dòng)子、USP45信號(hào)肽基因、EGFP基因、M6蛋白基因及17終止子切下，并通過后電泳回收這些片段，分別連接至經(jīng)Xba I單酶切及CIAP去磷酸化處理的E. coli及乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTRKH2，轉(zhuǎn)化至E. coli T0P10,提取質(zhì)粒以Xba I單酶切進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒分別命名為PNBCL2000，pNBCL2000_EGFP。取
2u LpNBCL2000, pNBCL2000-EGFP質(zhì)粒分別加入40 y L乳鏈菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化至乳鏈菌。隨后均勻平鋪于含I U g / mL紅霉素的SR固體培養(yǎng)基上30°C連續(xù)培養(yǎng)3天。提取乳鏈菌的質(zhì)粒DNA。用Xba I對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定。采用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP定位表達(dá)情況，將含有pNBCL2000-EGFP質(zhì)粒、pNBCL2000質(zhì)粒的乳鏈菌加入含有紅霉素5 u g/mL的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)16h，次日各取10 y L菌液均勻涂布于載玻片上，蓋上蓋玻片，以中性樹脂封片，錫紙包裹，進(jìn)行激光聚焦顯微鏡觀察(結(jié)果見圖5)。3. 4艱難梭菌A毒素羧基末端基因重復(fù)序列(14⑶TA)在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)3. 4. I艱難梭菌A毒素羧基末端基因重復(fù)序列(14⑶TA)的擴(kuò)增及TA克隆、測(cè)序 提取艱難梭菌基因組DNA，參照Genbank序列選擇設(shè)計(jì)引物，上游引物TXAl :5' CCCTCGAGGCCTCAACTGGTTATACAAGTATTAA 3'(下劃線示 Xho I 酶切位點(diǎn))下游引物 TXA2:5'TCAAGCTTTAGGGGCTTTTACTCCATCAACAC 3'(下劃線示 Hind III 酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增 14CDTA，使用TA克隆試劑盒進(jìn)行TA克隆，獲得的陽性克隆命名為pTA-Toxin_A，由上海博亞生物技術(shù)有限公司采用Sanger’ s雙脫氧末端終止法，用17正向及SP6通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定。測(cè)序通過NCBI網(wǎng)絡(luò)時(shí)行Blast分析。3. 4.2 14⑶TA乳鏈菌表達(dá)載體的構(gòu)建以Xho I、Hind III將14CDTA基因從測(cè)序正確的pTA_Toxin_A質(zhì)粒切下，定向克隆至經(jīng)相同酶切的載體PNBC1000及pNBC2000，平鋪于含75 y g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12h。挑取重組質(zhì)粒，以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，用常規(guī)的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以Xho I、Hind III酶切鑒定重組質(zhì)粒，分別命名為pNBClOOl，pNBC2001，以Xba I將p59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、14⑶TA基因、USP45蛋白的終止子從質(zhì)粒pNBClOOl切下，將p59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、14⑶TA基因、M6膜錨定蛋白基因、17終止子從質(zhì)粒pNBC2001切下，分別與經(jīng)Xba I單酶切并經(jīng)CIAP去磷酸化處理的質(zhì)粒PTRKH2進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coli ToplO，鋪于含125 y g / ml紅霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12-16h，挑取菌落，以含紅霉素150iig / ml的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)ia后，用常規(guī)的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以Xba I酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆子分別命名為PNBCL1001，PNBCL2001。各取 2u L pNBCL1001、pNBCL2001、pTRKH2 (約 I ii g)質(zhì)粒分別加入 40 u L 乳鏈菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，電穿孔轉(zhuǎn)化至乳鏈菌內(nèi)，提取乳鏈菌內(nèi)的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。3. 4.2 14⑶TA在乳鏈菌內(nèi)的定位表達(dá)分別提取含有質(zhì)粒pNBCLlOOl、pNBCL2001、pTRKH2的乳鏈菌的上清蛋白及膜蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blot實(shí)驗(yàn)，具體方法見文獻(xiàn)(楊曉強(qiáng)，趙亞剛，孫大勇，姜泊，陳學(xué)清.艱難梭菌A毒素受體結(jié)合區(qū)基因在乳鏈菌中的表達(dá).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(18):1676 1680.)3. 5破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)3. 5. ITETC基因序列的設(shè)計(jì)及獲得根據(jù)TETC 的序列(GeneBank accession no. M12739, 367-1719),結(jié)合乳鏈菌對(duì)一些密碼子的喜好，設(shè)計(jì)所用拼接的TETC基因序列，在TETC的5’端加上Sal I酶切位點(diǎn)，3’端加上Xho I和Hind III酶切位點(diǎn)。(核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQID NO. 6所示。)；使用軟件DNASTAR 5. 0，每40bp的寡核苷酸的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)I條寡核苷酸，使相鄰的兩條寡核苷酸有20bp相互互補(bǔ)，采用基因拼接的方法獲得全長(zhǎng)1383bp的序列(詳細(xì)方法見楊曉強(qiáng)，武金寶，姜泊，趙亞剛，陳學(xué)清.體外拼接破傷風(fēng)毒素C片段基因[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28 (3) : 363 365，369 369.)。3. 5. 2TETC乳鏈菌表達(dá)載體的構(gòu)建將TETC基因以Sal I和Hind III雙酶切后連接至經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒pBluescript
IISK(+)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆的質(zhì)粒，通過Sal I和Hind III雙酶切鑒定篩選出含有目的片斷的重組質(zhì)粒，命名為pBS-TETC，由上海博亞生物技術(shù)有限公司采用Sanger’s雙脫氧末端終止法,用M13正向及M13反向通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定。
以Sal I.Hind III將TETC基因從測(cè)序正確的pBS_TETC質(zhì)粒上切下，定向克隆至經(jīng)Xho I和Hind III酶切的載體pNBClOOO及pNBC2000 (以消除Xho I及Sal I酶切位點(diǎn))，轉(zhuǎn)化至E.coli ToplO，陽性克隆提取質(zhì)粒，以Xba I單酶切鑒定重組質(zhì)粒，分別命名為PNBC1002, pNBC2002,以Xba I將p59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、TETC基因、USP45蛋白的終止子從質(zhì)粒PNBC1002切下，將p59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、TETC基因、M6膜錨定蛋白基因、T7終止子從質(zhì)粒pNBC2002切下，分別與經(jīng)Xba I單酶切并經(jīng)CIAP去磷酸化處理的質(zhì)粒PTRKH2進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli ToplO，以Xba I酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆子分別命名為PNBCL1002，pNBCL2002。將pNBCL1002，pNBCL2002電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈菌，獲得的重組乳鏈菌分別稱為L(zhǎng)L-pNBCL1002及LL_pNBCL2002，提取重組乳鏈菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后分別提取重組乳鏈菌的分泌蛋白及膜錨定蛋白，進(jìn)行蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blot實(shí)驗(yàn)。(結(jié)果見圖6,圖7，詳見楊曉強(qiáng),趙亞剛,孫大勇，等.破傷風(fēng)毒素C片段在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá).廣東醫(yī)學(xué)，2011，32 (7) :1644 1647.)3. 6TETC 一 14⑶TA融合蛋白乳鏈菌表達(dá)載體的構(gòu)建以Xho I、Hind III將14CDTA基因從測(cè)序正確的pTA_Toxin_A質(zhì)粒切下，定向克隆至經(jīng)相同酶切的載體PNBC1002及pNBC2002，轉(zhuǎn)化至E. coli ToplO，提取陽性克隆質(zhì)粒以Xho I、Hind III酶切鑒定重組質(zhì)粒，分別命名為pNBC1003、pNBC2003,以Xbal、ApaLI 對(duì) pNBC1003 和 pNBC2003 進(jìn)行雙酶切(因 pNBC1003、pNBC2003 用 Xba I 切下的片段與pBluescript II SK(+)大小相近,在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)不能分開，因而用ApaLI將pBluescript II SK(+)切成較小的片段，大片段則為要回收的目的片段)，分別回收帶有P59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、TETC基因、14⑶TA基因、USP45蛋白的終止子的片段和帶有P59啟動(dòng)子、USP45蛋白的信號(hào)肽基因、TETC基因、14CDTA基因、M6膜錨定蛋白基因、17終止子的片段，分別與經(jīng)Xba I單酶切并經(jīng)CIAP去磷酸化處理的質(zhì)粒pTRKH2進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli ToplO。以Xba I酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆子分別命名為pNBCL1003，PNBCL2003。通過電穿孔將pNBCL1003，pNBCL2003轉(zhuǎn)化到乳鏈菌，提取乳鏈菌質(zhì)粒以XbaI酶切鑒定提取的質(zhì)粒。得到帶有質(zhì)粒PNBCL1003的乳鏈菌(LL 一 pNBCL1003)和帶有質(zhì)粒pNBCL2003的乳鏈菌(LL 一 pNBCL2003)。提取重組乳鏈菌LL 一 pNBCL1003及LL 一PNBCL2003的培養(yǎng)上清蛋白及膜錨定蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)。(結(jié)果見圖8，圖9。)
3. 7thyA基因缺陷的重組乳鏈菌的獲得構(gòu)建的表達(dá)分泌型14⑶TA是一種基因重組蛋白，其包括了乳酸鏈球菌USP45基因的信號(hào)肽部分，也包括了釀膿鏈球菌的e_6基因中編碼M6蛋白的膜錨定序列和無毒性破傷風(fēng)毒素C片段，共同構(gòu)成一個(gè)基因表達(dá)單位(以下稱14CDTA基因表達(dá)單位)，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖I中A。用細(xì)菌表達(dá)蛋白常采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法。也就是說將目的基因插入細(xì)菌的表達(dá)質(zhì)粒載體中，進(jìn)一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，根據(jù)質(zhì)粒的抗藥性等標(biāo)記來篩選用帶有質(zhì)粒的陽性細(xì)菌。由帶有質(zhì)粒的陽性細(xì)菌進(jìn)行目的基因的翻譯和表達(dá)。但是這種帶有質(zhì)粒的細(xì)菌作為疫苗是不安全的，對(duì)環(huán)境也可能造成生物污染。因此，需要構(gòu)建不帶有質(zhì)粒的且能表達(dá)14⑶TA基因表達(dá)單位的乳酸鏈球菌，同時(shí)這種乳酸鏈球菌在體外自然環(huán)境中是不能生存的。為了達(dá)到這一目的，本疫苗采用將14⑶TA基因表達(dá)單位完全替代乳酸鏈球菌基因組中的thyA基因。由于自然環(huán)境中缺乏胸苷，而腸道中有一定濃度的胸苷，因此thyA基因缺陷型乳酸 鏈球菌在自然環(huán)境中不能生存，不會(huì)造成生物污染。表達(dá)14⑶TA基因表達(dá)單位的thyA基因缺陷型乳酸鏈球菌的技術(shù)步驟如下3. 7. IthyA基因缺陷質(zhì)粒的構(gòu)建用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆乳酸鏈球菌thyA基因的上游(簡(jiǎn)稱thyA_up)及下游(簡(jiǎn)稱thyA-down)各1000_1500bp的基因片段；用基因克隆技術(shù)將構(gòu)建好的表達(dá)14⑶TA基因表達(dá)單位體外插入到thyA-up和thyA_down之間，構(gòu)建成thyA基因剔除單位(如圖I中B所示)；具體方法如下提取乳鏈菌，基因DNA，設(shè)計(jì) Up 上游引物 Upl 5' GGAAGCTTCATTCTCCCAAGATTTCTCCTGTAAAA 3丨(粗體示Hind III酶切位點(diǎn))及下游(2)將上述培養(yǎng)物稀釋接種于固體的不含任何抗性但含有胸苷的固定M17培養(yǎng)基因中，挑選出單個(gè)乳酸鏈球菌克隆。用質(zhì)粒提取、紅霉素抗性培養(yǎng)和不含胸苷培養(yǎng)等方法鑒定所挑選的單個(gè)乳酸鏈球菌克隆不帶有任何質(zhì)粒和抗性，且乳酸鏈球菌不能合成胸苷。這將表面所獲得的重組乳酸鏈球菌中的thyA基因，通過基因剔除技術(shù)，被14CDTA基因表達(dá)單位所替代了；(3)進(jìn)一步將上述所篩選出的重組乳酸鏈球菌用PCR和體外基因測(cè)序方法鑒定14CDTA基因表達(dá)單位替代thyA基因產(chǎn)生的剔除結(jié)果的可靠性；(4)將篩選出的多個(gè)且經(jīng)鑒定含有目的基因(14⑶TA)重組乳酸鏈球菌在不含任何抗生并含胸苷的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，用蛋白印跡電泳和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乳酸鏈球菌及培養(yǎng)物中14CDTA的表達(dá)量，篩選出高表達(dá)重組乳酸鏈球菌菌株；(5)可進(jìn)一步將重組乳酸鏈球菌表達(dá)的14⑶TA蛋白復(fù)合物純化，并且質(zhì)譜的方法驗(yàn)證蛋白質(zhì)表達(dá)的正確性。3.給藥途徑及實(shí)施方法本疫苗的給藥途徑為口服，表達(dá)14⑶TA的重組乳酸鏈球菌可以以凍干形成保存，口服后在腸道繁殖一段時(shí)間以活菌形式刺激腸道產(chǎn)生抗體。第二部分防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的用途實(shí)施例2重組乳鏈菌活菌疫苗在金黃地鼠腸道內(nèi)定植
為了觀察表達(dá)14CDTA的重組乳鏈菌口服疫苗即采用實(shí)施例I中方法構(gòu)建出來的分泌表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14⑶TA及膜錨定表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14CDTA的兩種重組乳鏈菌，)對(duì)防治艱難梭菌感染的防治作用，采用穿梭質(zhì)粒PTRKH2作為載體，在乳鏈菌中表達(dá)14⑶TA融合蛋白，在實(shí)驗(yàn)中采用乳酪鏈球菌(Lactococcus lactissubsp. cremoris)的啟動(dòng)子 59 (promoter 59,p59) (GeneBank accession No.M24806,)作為啟動(dòng)子，選用乳鏈菌分泌型蛋白45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)的RBS和信號(hào)妝(75-181，GeneBank accessionNo. M60178)序列作為RBS和信號(hào)月太;選用Usp45基因的終止子作為終止子(1514-1553, GeneBank accession No. M60178);在信號(hào)肽后插A 14CDTA表達(dá)單位，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖如圖2，其中A為僅含有pTRKH2空白質(zhì)粒的乳鏈菌為乳鏈菌的質(zhì)粒中，包括有表達(dá)14⑶TA分泌蛋白的元件，包括TETC和14⑶TA，但不表達(dá)膜蛋白CWAM6 ；C為乳鏈菌的質(zhì)粒中，表達(dá)帶有膜蛋白CWAM6的14⑶TA融合蛋白，P 為啟動(dòng)子；RBS :核糖體結(jié)合點(diǎn)(ribosomal binding site) ;SPUsp45 :USP45蛋白的信號(hào)肽 (Signal peptide ofUsp45) ;14Q)TA :艱難梭菌毒素A之無毒性抗原序列；CWAM6 :編碼細(xì)胞 膜 M6 蛋白序列(sequence encoding the cell wall M6protein) ；TETC:破傷風(fēng)無毒性的C片段；TUSP45為鏈酸鏈球菌USP45基因的終止密碼子。(I).接種前金黃地鼠糞便乳鏈菌分離培養(yǎng)；將大鼠糞便稱重并用小量無菌PBS重懸后倍比稀釋，接種于篩選LC平皿中，在鑒定后進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)(熊德鑫，等。臨床厭氧菌的檢驗(yàn)手冊(cè)。中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社。北京。1994年第I版)。此步驟為證實(shí)接種前金黃地鼠腸道內(nèi)是否有乳鏈菌定植。(2).采用灌胃的方法將5 X IO9CFU重組乳鏈菌(分別為分泌表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14⑶TA的乳菌LL-PNBCL1003圖2中B所示，和膜錨定表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14⑶TA的組乳鏈菌LL-PNBCL2003，圖2中C所示)及非重組乳鏈菌(含有非重組質(zhì)粒PTRKH2的乳鏈菌LL-pTRKH2，圖2中A所示)接種金黃地鼠；(3).接種I周后從糞便中分離培養(yǎng)乳鏈菌；將大鼠糞便稱重并用小量無菌PBS重懸后倍比稀釋，接種于篩選LC平皿中，在鑒定后進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)(熊德鑫，等。臨床厭氧菌的檢驗(yàn)手冊(cè)。中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社。北京。1994年第I版)。(4).以德國(guó)Biocam公司生產(chǎn)的艱難梭菌A毒素抗體檢測(cè)接種金黃地鼠腸液中重組14⑶TA表達(dá)情況，采用ELISA法。結(jié)果如下(5)接種前所有金黃地鼠均未能培養(yǎng)出乳鏈菌，接種I周后重組乳鏈菌組及非重組乳鏈菌組均分離培養(yǎng)出乳鏈菌，分泌表達(dá)14⑶TA的乳鏈菌為6. 2X107CFU、膜錨定表達(dá)14⑶TA的乳鏈菌為6. 5X 107CFU、非重組質(zhì)粒乳鏈菌為5. 9 X IO7CFU,各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(6)ELISA法檢測(cè)顯示分泌表達(dá)14⑶TA的滴度為3. 2±0. 8X 102，膜錨定表達(dá)14⑶TA的滴度為6. 3±1. I X 102，而非重組乳鏈菌組滴度為O。實(shí)施例3重組乳鏈菌活菌疫苗對(duì)防治艱難梭菌性腸炎的作用分泌表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14CDTA的乳菌LL-PNBCL1003、膜錨定表達(dá)帶有TETC作為生物佐劑的14⑶TA的組乳鏈菌LL-PNBCL2003及非重組乳鏈菌(含有非重組質(zhì)粒pTRKH2的乳鏈菌LL-pTRKH2的構(gòu)建過程同實(shí)施例2。I.實(shí)驗(yàn)分組及免疫方法取32只體重100-130克的雄性敘利亞金黃地鼠(以下簡(jiǎn)稱金黃地鼠)，隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8只，第I組(8只)給予生理鹽水灌胃作為空白對(duì)照組，第2組(8只)給予非重組質(zhì)粒乳鏈菌(LL-pTRKH2)作為陽性對(duì)照(圖2A)，第3組(8只)給予分泌表達(dá)14CDTA的乳鏈菌(LL-pNBCL1003)(圖2B)，第4組(8只)給予膜錨定表達(dá)14⑶TA的乳鏈菌(LL-pNBCL2003)(圖2C)，采用灌胃的方式進(jìn)行免疫，各乳鏈菌組均給予5X IO9CFU乳鏈菌灌胃(0D600約為I. 0)，以含有5%酪蛋白水解物、0. 5%葡萄糖的0. 2M碳酸氫鈉將帶有不同質(zhì)粒的乳鏈菌制成5X 109CFU/mL的細(xì)菌懸液，分別于第0、1、2、7、14，23天給不同組別的金黃地鼠灌胃，于第7、14天灌胃前分別進(jìn)行腸道菌群分析一次(如圖3所示)。2.第15天艱難梭菌攻擊實(shí)驗(yàn)接種后15天起各組金黃地鼠給予鹽酸克林霉素IOmg灌胃，連續(xù)給藥I周，期間進(jìn)行腸道菌群分析及艱難梭菌分離培養(yǎng)，以確定有無菌群失調(diào)及艱難梭菌感染，最后I次給藥后4小時(shí)給予4X IO5CFU的艱難梭菌約進(jìn)行攻擊，攻擊前稱量金黃地鼠的體重，攻擊后72小時(shí)內(nèi)每4小時(shí)觀察I次，并對(duì)糞便進(jìn)行艱難梭菌分離培養(yǎng)及乳鏈菌分離培養(yǎng)，此后每日觀察4次，詳細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便，肛周，活動(dòng)，皮毛形態(tài)、光澤、精神狀況，并進(jìn)行評(píng)分。3.評(píng)價(jià)指標(biāo)3. I以各組死亡率、腹瀉發(fā)生率、攻擊前后體重變化，生存時(shí)間來評(píng)價(jià)重組乳鏈菌對(duì)感染動(dòng)物模型的保護(hù)作用；3. 2解剖各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，肉眼觀察腹腔及腸管病變情況，取盲腸及結(jié)腸組織各一部分，沿縱軸剪開，用4°C生理鹽水將腸腔內(nèi)容物沖洗干凈后，取IOOmg腸粘膜組織立即勻漿進(jìn)行艱難梭菌分離培養(yǎng)及乳鏈菌分離培養(yǎng)；200mg腸粘膜組織立即凍存于-70°C冰箱以便提取腸組織總RNA及腸上皮細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白和核蛋白； 3. 3以實(shí)體鏡及解剖顯微鏡觀察各腸段大體病理變化，隨后置于10%中性甲醛內(nèi)固定、包埋、切片、HE染色，行一般組織病理學(xué)觀察；3. 4采用ELISA檢測(cè)的血清及腸道組織及腸液中產(chǎn)生的抗艱難梭菌A毒素羧基未端重復(fù)片段14CDTA抗體的滴度，進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)；3. 5通過觀察血清對(duì)艱難梭菌A毒素對(duì)CHO-Kl細(xì)胞毒性的中和作用，來評(píng)價(jià)金黃地鼠口服疫苗后血清中產(chǎn)生的抗14CDTA抗體對(duì)艱難梭菌A毒素的細(xì)胞毒性的拮抗作用；3. 6流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清對(duì)艱難梭菌A毒素誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞調(diào)亡的抑制作用。4.結(jié)果4. I腹瀉發(fā)生率腹瀉發(fā)生率各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0. 000,圖4)其中空白對(duì)照組及LL - pTRKH2組最高，LL-pNBCL2003組最低；4. 2死亡率及生存時(shí)間與空白對(duì)照組相比，其它組的死亡率均明顯低于空白對(duì)照組生存率及生存時(shí)間均高于空白對(duì)照組(P < 0. 001，圖5和圖6)，而重組乳鏈菌組死亡率均低于LL - pTRKH2組(P = 0. 000,圖7)，生存時(shí)間及攻擊后生存時(shí)間均高于LL 一 pTRKH2組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0. 881，圖8);4. 3攻擊前后體重變化各乳鏈菌組均高于空白對(duì)照組(P<0. 001，圖8)，而重組乳鏈菌組均高于LL - pTRKH2組(P = 0. 000,圖8)，兩種重組乳鏈菌之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.365，圖8)。其中a為與空白對(duì)照組比較，p=0. 001 ；b,與LL_pTRKH2組比較，p=0. 000 ；c,與LL-pNBCL1003組比較，p=0. 365 ；d,各組間相互比較，p=0. 843。4. 4大體病理觀察空白對(duì)照組金黃地鼠于攻擊后第2天呈現(xiàn)肛周、腳爪、下腹部潮濕，蜷縮，不活動(dòng)，平衡感消失，皮毛聳動(dòng)縐亂，對(duì)刺激反應(yīng)減弱等瀕死表現(xiàn)，處死后可見盲腸擴(kuò)張，腸腔出血(圖9)，沿腸管縱軸剖開，可見腸腔內(nèi)廣泛出血病灶(圖10)，部分病灶有粘膜缺損，病變以盲腸及結(jié)腸上段最重，小腸輕度擴(kuò)張，較結(jié)腸略增粗，直腸病變輕微，結(jié)腸內(nèi)無成形糞便。LL-PTRKH2組于攻擊后第2天有I只出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，處死后可見盲腸輕度擴(kuò)張，腸粘膜充血(圖11)，剖開腸腔，腸粘膜內(nèi)有少量出血病灶，粘膜充血水腫明顯，肉眼可見散在糜爛(圖12)。結(jié)腸內(nèi)無成形糞便，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死的LL-pTRKH2組金黃地鼠盲腸無擴(kuò)張，腸粘膜無充血，仍有腹瀉的金黃地鼠的腸粘膜輕度水腫，結(jié)腸內(nèi)無成形糞便，已停止腹瀉的金黃地鼠的腸粘膜無水腫，結(jié)腸及直腸內(nèi)可見成形的糞便。LL-pNBCL1003組與LL_pNBCL2003組(圖13)于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死的金黃地鼠腸管無擴(kuò)張，腸粘膜無充血、水腫(圖14，15)，結(jié)腸及 直腸內(nèi)均有成形糞便。4. 5組織病理學(xué)改變空白對(duì)照組粘膜缺損，腺體破壞，廣泛出血，粘膜下層水腫，有中等至大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。(見圖16)，LL-pTRKH2組粘膜缺損較空白對(duì)照組輕，粘膜下有少量出血及大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膿腫形成(見圖，17)。LL-pNBCL1003組粘膜上皮輕度受損完整，粘膜下層有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩變淺(見圖18)，LL-pNBCL2003組粘膜缺損較輕，僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖19)?？瞻讓?duì)照組、LL-pTRKH2組、LL-pNBCL1003組和LL_pNBCL2003組各組大體及組織病理圖評(píng)分比較見圖20，其中與空白對(duì)照組相比，P < 0. 05 ;與非重組質(zhì)粒乳鏈菌組相比，P < 0. 000，與 LL-PNBCL1003 相比，P = 0. 116。4. 6艱難梭菌及乳鏈菌的分離培養(yǎng)攻擊前，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便中均未分離培養(yǎng)出艱難梭菌，空白對(duì)照組金黃地鼠的腹瀉糞便及腸組織勻漿培養(yǎng)出艱難梭菌，LL - PTRKH2組有3只金黃地鼠的腹瀉糞便分離培養(yǎng)出艱難梭菌，其中有I只金黃地鼠的腸組織勻漿培養(yǎng)出艱難梭菌。LL-pNBCL1003組發(fā)生腹瀉的2只金黃地鼠的糞便中分離培養(yǎng)出艱難梭菌，但腸組織勻漿未分離出艱難梭菌。LL-pNBCL2003組中有I只金黃地鼠的糞便中亦分離出艱難梭菌，腸組織勻漿未分離培養(yǎng)艱難梭菌。連續(xù)給予鹽酸克林霉素IOmg灌胃I周后各組動(dòng)物均未分離出乳酸菌(包括乳鏈菌、乳桿菌及乳球菌)及雙歧桿菌，并出現(xiàn)了真菌，呈現(xiàn)出III度菌群失調(diào)，攻擊后第2天(即第23天)再次給予乳鏈菌加強(qiáng)免疫后，攻擊后第3天LL-pTRKH2組存活的金黃地鼠及LL-pNBCL1003組、LL_pNBCL2003組金黃地鼠的糞便中均分離培養(yǎng)出乳鏈菌，但攻擊后第14天較第7天分離培養(yǎng)的乳鏈菌減少，LL-pTRKH2組存活的金黃地鼠及LL_pNBCL1003組、LL-PNBCL2003組腸粘膜勻漿均培養(yǎng)出乳鏈菌，但LL_pTRKH2組腸粘膜尚分離培養(yǎng)出艱難梭菌。4. 7血清及腸液抗艱難梭菌A毒素抗體水平將試劑盒所能檢測(cè)的最小濃度定為I個(gè)滴度，各樣本最大稀釋度即為該樣本的滴度。結(jié)果各組血清及腸液均產(chǎn)生了抗艱難梭菌A毒素的IgG、IgA抗體，LL-pNBCL2003組血清產(chǎn)生I. 5X IO4滴度的抗艱難梭菌A毒素IgG抗體，6. 7X IO2滴度的IgA抗體，腸液產(chǎn)生I.45 X IO4滴度的抗艱難梭菌A毒素IgG抗體，I X IO2滴度的IgA抗體；LL_pNBCL1003組血清產(chǎn)生9. 5 X IO3滴度的抗艱難梭菌A毒素IgG抗體，5. 6 X IO2滴度的Ig A抗體，腸液產(chǎn)生
9.5 X IO3滴度的IgG抗體，7. 5 X IO1滴度的IgA抗體；LL — pTRKH2組血清產(chǎn)生2. 4 X IO3滴度的抗艱難梭菌A毒素IgG抗體，3. 6 X IO2滴度的IgA抗體，腸液產(chǎn)生3. 5 X IO3滴度的IgG抗體，7. 5 X IO1滴度的IgA抗體，空白對(duì)照組金黃地鼠血清產(chǎn)生6 X IO2滴度的IgG抗體，2 X IO2滴度的IgA抗體，腸液產(chǎn)生7. 3 X IO2滴度的IgG抗體，6. 3 X IO1滴度的IgA抗體。重組乳鏈菌組血清及腸液IgG滴度均明顯高于空白對(duì)照組及空質(zhì)粒對(duì)照組(P < 0. 000),血清IgA高于空白對(duì)照組(P < 0. 05)，腸液IgA雖高于空白對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖21)。4. 7毒素中和實(shí)驗(yàn)光鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞大小均勻一致，呈梭形，增殖期細(xì)胞呈圓形，但細(xì)胞核正常，經(jīng)過艱難梭菌A毒素處理后，細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，大小不等，核固縮、碎裂、溶解， 血清預(yù)孵組細(xì)胞略變圓，但仍可看出梭形形態(tài)，血清處理組細(xì)胞部分細(xì)胞變圓、縮小，核固縮，部分細(xì)胞仍略呈梭形。4. 8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗14CDTA血清對(duì)艱難梭菌A毒素誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞調(diào)亡的抑制作用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，艱難梭菌A毒素處理組細(xì)胞大量死亡，占細(xì)胞總數(shù)的41. 59%，調(diào)亡細(xì)胞占18. 34%，血清預(yù)孵組死亡細(xì)胞占7. 39%，調(diào)亡細(xì)胞占6. 47%，血清處理組死亡細(xì)胞占12%，調(diào)亡細(xì)胞占8. 78%，正常對(duì)照組死亡細(xì)胞占3. 9%，調(diào)亡細(xì)胞占3. 87% (見圖22)。4. 9RT-PCR 檢測(cè) ICAM-1、MCP-1、IL_6、Gro-I 等致炎細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)LL-pNBCL2003組各種致炎因子的mRNA的表達(dá)顯著低于其它各組比較(P
<0. 05) ；LL-pNBCL1003組各種致炎因子的mRNA的表達(dá)低于空白對(duì)照組及LL_pTRKH2組(P
<0. 05) ；LL-pTRKH2 組 ICAM-1、MCP-I 的表達(dá)低于空白對(duì)照組，LL_pTRKH2 組 IL-6、Gro-I的表達(dá)高于空白對(duì)照組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述的胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌通過如下方式獲得采用表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白取代乳酸鏈球菌的胸苷酸合成酶ThyA基因序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述的表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白通過以下方式獲得將乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14⑶TA和無毒性破傷風(fēng)毒素C片段序列TETC，按正確的閱讀框用基因工程的方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述的表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白通過以下方式獲得將乳酸鏈球菌分泌型蛋白45基因的信號(hào)肽序列SPUsp45、艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列14CDTA、無毒性破傷風(fēng)毒素C片段序列TETC和釀膿鏈球菌M6蛋白的膜錨定序列CWAM6，按正確的閱讀框用基因工程的方法連接形成表達(dá)分泌型的抗艱難梭菌毒素A的融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述乳酸鏈球菌為食品級(jí)工業(yè)菌。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的制備方法，其特征是將上述胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌在含有胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，獲得防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染的活菌疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗的制備方法，其特征是所述胸苷的濃度為l(T30iiM。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，其特征是所述活菌疫苗的劑型為口服劑。
9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗在制備具有防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染作用的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致腸道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重組乳酸鏈球菌；該疫苗經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證安全有效。還公開了上述活菌疫苗的制備方法及其在制備具有防治艱難梭菌毒素A陽性的艱難梭菌所致的腸道感染藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/07GK102743746SQ20121019491
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者楊曉強(qiáng), 陳學(xué)清 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 楊曉強(qiáng)